Nous tenons à remercier le personnel et les scientifiques au SBI pour leur soutien dans le développement et les tests de ces protocoles.

1. La transfection de cellules avec des plasmides 293TN emballage et la construction d&#39;expression <ol><li> Graine de 7,0 à 8,0 x 10 6 cellules par 15 293TN plaque de culture cm 2 dans 20 ml de milieu de culture contenant du milieu DMEM additionné de 4 mM de L-glutamine, 4,5 g / l de glucose, et sérum de veau fœtal (10%) sans antibiotiques. Cultiver pendant 18-24 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2 de sorte que la densité cellulaire atteint 60-80% de confluence au moment de la transfection. Dans certains cas, il peut être nécessaire à des plaques de semences de plusieurs cellules pour obtenir un titre suffisamment élevé pour que la transduction des cellules cibles. </li><li> Pour chaque plaque de cellules, ajouter 1,6 ml DMEM sans sérum dans un tube stérilisé à l&#39;autoclave 2 ml Eppendorff. Ajouter 45 ul pPACKH1 ou pPACKF1 et 4,5 mg de votre lentivector construire à l&#39;DMEM et mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> Ajouter 55 ul de PureFection dans le même tube. Vortex pendant 10 secondes. Incuber le milieu DMEM-plasmide-PureFection mélange à température ambiante fou 15 min. </li><li> Ajouter le DMEM-plasmide-PureFection mélange sur la plaque de culture de tissus goutte à goutte et agiter doucement pour disperser uniformément tout au long de la plaque. Retour le plat dans l&#39;incubateur et de croître à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Il n&#39;est pas nécessaire de changer les médias après la transfection. Si votre lentivector construction exprime un gène codant pour une protéine fluorescente comme la GFP, vérifiez vos cellules sous un microscope 12-24 heures après la transfection. Vous devriez être capable de voir les cellules&gt; 90% GFP-positives, indiquant que la transfection a été un succès. </li><li> Recueillir le surnageant de culture cellulaire après 48 et 72 heures dans un tube de centrifugation de 50 ml stérile. Ce surnageant de culture cellulaire contient maintenant les particules infectieuses pseudoviral. (Suivez les lignes directrices recommandées pour travailler avec la classe de protection BSL-2). Centrifuger à 1500 xg pendant 15 min à température ambiante pour obtenir un culot les débris cellulaires. Transférer le surnageant viral dans un nouveau tube, en veillant à ne pas perturber le culot. </li><li> Cellules 293TN qui ont été utilisés pour les emballages virale doivent être éliminés dans un container prévu à et ne doivent pas être utilisés pour d&#39;autres séries d&#39;emballages virale. </li></ol> 2. Concentration du surnageant viral <ol><li> Ajouter 1 volume de froid (4 ° C) PEG-il Precipitation Solution Virus tous les 4 volumes de lentiviral contenant des particules surnageant. Précipitation de particules de lentiviraux de gros volumes peut être réalisé avec des tubes de 250 ml Corning centrifugeuses en polypropylène. Mélanger la solution par les temps les tubes retournant plusieurs, mais ne pas vortexer le mélange. </li><li> Réfrigérer la solution à 4 ° C pendant au moins 12 heures (jusqu&#39;à 4 jours est acceptable). Ne pas secouer ou faire pivoter les tubes lors de l&#39;étape de réfrigération. </li><li> Centrifuger le surnageant / PEG-il mélange à 1500 xg pendant 30 minutes à 4 ° C. Après centrifugation, les particules lentiviraux apparaît comme une pastille ou beige au fond du tube. Verser le supernatant. </li><li> Retirer toutes les traces de liquide par aspiration, en prenant soin de ne pas déranger les particules précipitées lentiviraux dans le culot. Des traces de résidus de PEG-il diluer le virus (réduisant ainsi le titre), mais ne sera pas atteinte à l&#39;intégrité des cellules cibles depuis le PEG-il est inerte et non toxique. </li><li> Remettre en suspension et mélanger les particules en lentiviraux 1/100 du volume d&#39;origine en utilisant le froid (4 ° C), le phosphate de stérile ou une solution saline tamponnée DMEM contenant 25 mM de tampon HEPES. </li><li> Aliquoter dans stériles fioles cryogéniques et conserver à -70 ° C jusqu&#39;à ce que prêt à l&#39;emploi. </li></ol> 3. Titrage virale et la transduction des cellules cibles <ol><li> Nous recommandons titrage des particules lentiviraux avant transduction la cible des cellules d&#39;intérêt et le calcul de la multiplicité approprié d&#39;infection (MOI) pour les cellules cibles pour la cohérence entre les expériences. Pour titrage viral, nous vous recommandons d&#39;utiliser des cellules HT1080 comme une ligne de commande facile à infecter positif. Plla facilité noter que le protocole titrage implique la transduction des cellules HT1080 avec une petite aliquote des particules lentiviraux vous avez emballés. Une fois que le titre est connu, les cellules cibles d&#39;intérêt peut également être transduites avec les particules produites lentiviraux. Un protocole titrage recommandons peut être trouvé à: <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Plaque de mire 50.000 cellules d&#39;intérêt par puits dans une plaque de 24 puits dans les milieux de culture de cellules. Utiliser les médias que les cellules sont normalement cultivées in cultiver les cellules pendant la nuit à leurs conditions de culture spécifiques. Cellules doit être compris entre 50 à 70% confluente le jour de la transduction. </li><li> Le jour de la transduction, aspirer les médias à partir des cellules. Combinez milieu de culture avec TransDux à une concentration x 1 finale (par exemple, 2,5 TransDux ul à 500 ul de milieu de culture). Puis transférer le TransDux-CEll mélange milieu de culture dans chaque puits. </li><li> Introduire à la pipette le volume approprié de virus qui correspond à la MOI optimale pour les cellules cibles dans chaque puits. Si la MOI optimale est inconnue, nous vous recommandons d&#39;essayer toute une gamme de différents IAM (comme une MOI de 1, 2 et 5 pour facile à infecter les cellules de culture de tissus, et une MOI de 1, 10 et 20 pour plus difficile à -infecter les cellules primaires). Si la concentration des particules lentiviraux n&#39;est pas connu (tel que déterminé par un protocole titrage du virus), des volumes différents de virus peut être essayé, tels que pi 1, 2 et 5 du virus. Le virus peut rester en contact avec les cellules cibles pour un maximum de 72 heures. </li><li> D&#39;autres expériences avec les cellules transduites d&#39;intérêt cibles ne peut être intentée 72 heures après la transduction, une fois la construction virale a intégré dans le génome de la cellule hôte. Changer le support et le passage de la cible les cellules d&#39;intérêt en fonction de leurs besoins spécifiques. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; La transfection de cellules 293TN La densité de départ des cellules 293TN est critique pour l&#39;emballage virale réussie. 293TN cellules doit être comprise entre 60 -80% de confluence du jour de transfection (figure 2). Si les cellules sont 293TN moins de 60% de confluence, leur permettre de croître pendant quelques heures plus avant de tenter la transfection. Si les cellules sont confluentes 293TN&gt; 80%, ils devraient être réétalées avant la transfection. Si en utilisant une GFP lentivector exprimant, au moins 90% des cellules 293TN doit fluorescence verte 24 heures après la transfection, indiquant une transfection avec succès (figure 3). Si moins de 90% des cellules sont GFP-positives, ne pas procéder à l&#39;étape suivante, car cela indique que la transfection n&#39;a pas réussi, et les titres viraux sera faible. Au lieu de cela, la plaque de nouvelles cellules 293TN et recommencer, faire en sorte que les cellules 293TN sont à la densité cellulaire appropriée, avant la transfection. Cellules 293TN peut retirer les plaques de culture tissulaire 48-72 heures après la transfection. Cela ne veut pas nuire à la production de particules lentiviraux. Titrage avec des cellules HT1080 Les titres viraux peuvent être calculés à l&#39;aide du kit de SBI mondial Titrage ultrarapide selon les instructions du fabricant. Ce système utilise qPCR pour mesurer l&#39;intégration de la séquence virale WPRE à partir du vecteur lentiviral dans des cellules HT1080 et la compare à une courbe standard, basé sur une séquence de référence pour mesurer avec précision génomique unités infectieuses par ml (Figure 4). La transduction des cellules cibles Si vous utilisez des particules lentiviraux exprimant un marqueur GFP constitutivement active, les cellules GFP-positives devraient commencer à apparaître dans les 12-24 heures de la transduction, si la réaction est la transduction de travail. Expression de la GFP devrait se poursuivre après la construction lentiviral intègre de manière stable dans til accueillera génome de la cellule. Si transduction avec IAM différentes, la fluorescence GFP devrait approximativement correspondre à la MOI, MOI, où de faibles montrent une fluorescence GFP et moins élevés IAM présentent une augmentation de fluorescence de la GFP (figure 5). <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble du protocole de production virale. Les plasmides d&#39;emballage et de lentivector PPACK sont mélangés et co-transfectés dans des cellules 293TN. Après 48 -72 heures, le surnageant est recueilli virale, et les particules virales sont précipités avec du PEG-ci. Après titrage des particules lentiviraux, ils peuvent être utilisés pour transduire des cellules de la cible d&#39;intérêt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. L&#39;image en contraste de phase de cellules 293TN. Densit portabley doit être comprise entre 60-80% de confluence le jour de la transfection. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. L&#39;image fluorescente des cellules GFP-positives 293TN 24 heures après transfection avec Purefection, pPACKH1, et une construction codant pour la GFP lentivector. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Résultats de qPCR WPRE et la courbe standard obtenue à l&#39;aide du kit de SBI mondial Titrage ultrarapide pour calculer MOI et le titre correspondant de emballés particules virales. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5 images. Fluorescentes de cellules HT1080 transduites avec des quantités croissantes de lentivirus. Les images sont de 72 heures après transduction.

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Cet emballage virale et de la transduction des cellules cibles du protocole a été optimisé pour une utilisation avec des réactifs SBI emballage virales. Substitution d&#39;autres réactifs peuvent influer sur l&#39;issue du protocole. Ce protocole n&#39;a été optimisé pour la production lentivirale et peut ne pas être aptes à la production d&#39;autres types de virus ou pseudovirus. Le succès d&#39;emballage virale dépend de plusieurs étapes clés. Les cellules 293TN exprimer l&#39;antigène T de SV40 grande, qui est absolument nécessaire pour la sécrétion des particules lentiviraux dans le surnageant de culture cellulaire. La densité au cours de laquelle les cellules sont 293TN au moment de la transfection est particulièrement important pour que le réactif PureFection suffisamment transférer le lentivector et des plasmides d&#39;emballage dans les cellules. Ajout du mélange PureFection à la plaque de culture de tissus d&#39;une manière goutte à goutte puis soigneusement tourbillonnant de la plaque est important pour la dispersion des plasmides d&#39;emballageet de construire tout au long lentivector toutes les cellules. Défaut de façon appropriée la distribution des vecteurs peut entraîner l&#39;insuffisance des particules lentiviraux sont produites. La réaction d&#39;emballage virale peut être élargi pour la production de virus à titre élevé, sur la base de la surface des plaques de culture de tissus. On peut choisir de plaques de plusieurs boîtes de culture tissulaire de cellules 293TN par construction qui doit être emballé. Concentration des surnageants viraux est particulièrement utile dans la création à titre élevé de virus. Surnageant viral à partir de plusieurs plaques de cellules peuvent être combinées et concentrées pour une utilisation dans des expériences in vivo, ou pour les cellules qui sont difficiles à transduire. Titrage les particules produites lentiviraux est important pour calculer une précision IAM à utiliser pour la transduction de cellules cibles. Connaissant la MOI qui a été utilisé dans une transduction donnée permet le dépannage dans le cas où la transduction n&#39;est pas couronnée de succès. Par exemple, en utilisant un MOI qui esttrop faible peut entraîner dans les cellules cibles exprimant très peu de la construction d&#39;intérêts. L&#39;utilisation d&#39;un MOI qui est trop élevé, cependant, peut entraîner dans les cellules cibles qui montrent des signes de stress. L&#39;objectif est d&#39;utiliser une MOI qui maximise l&#39;expression de la construction d&#39;intérêts tout en préservant la santé des cellules. Bien que nous recommandions un protocole titrage qPCR basée sur ce que les mesures copies intégrées de la construction lentiviral dans des cellules HT1080, les approches titrage d&#39;autres peuvent également être utilisés, tels que p24 ELISA ou l&#39;estimation du pour cent de la GFP-positives cellules. Transduction des cellules cibles avec succès dépend également de plusieurs facteurs clés. TransDux est un réactif unique qui permet l&#39;infection efficacités de transduction élevées, mais ce n&#39;est pas toxique pour les cellules. TransDux peut être utilisé à la place de polybrène, qui est souvent toxique pour les cellules cibles. L&#39;inclusion de TransDux dans la transduction des cellules cibles aide à neutraliser les charges sur les particules virales et permet le virus dans la cellules. Depuis TransDux n&#39;est pas toxique pour les cellules, on peut permettre aux particules lentiviraux de rester en contact avec les cellules pour jusqu&#39;à 72 heures (l&#39;heure à laquelle les constructions virales ont intégré dans le génome de la cellule hôte), augmentant ainsi la probabilité de la des particules virales entrant dans la cellule. Pour certaines cellules difficiles à transduisent, transductions peut être répétée plusieurs jours de suite pour augmenter l&#39;efficacité de transduction. Par exemple, transduire les cellules sur le jour 1, permettent aux cellules de se reposer le jour 2, puis transduire les cellules de nouveau le jour 3. Il est important d&#39;attendre 72 heures après la transduction dernière avant la sélection début, d&#39;autres expériences ou la caractérisation des cellules cibles. Efficaces emballage virale est également dépendant de la taille de la construction lentivirale, entre l&#39;extrémité 5 &#39;et régions 3&#39;LTR. Cette partie de la construction lentivirale doit être d&#39;environ 9 kb ou moins, ce qui correspond à la taille du génome natif VIH. Le dépassement de 9 kb peut deaugmentation du titre des particules produites pseudoviral. Les nouvelles technologies, tels que les vecteurs de transposons PiggyBac, permettent un fonctionnement fiable, une intégration stable des transgènes jusqu&#39;à 100 kb par une transfection unique. Cette approche peut être utilisée pour des constructions qui dépassent la limite de taille pour les vecteurs lentiviraux, dans les cas où il est possible de transfecter des cellules cibles, et offre l&#39;avantage supplémentaire de ne pas nécessiter une étape de l&#39;emballage virale 9,10. Les particules produites pseudoviral utilisant ce protocole sont contagieux en ce sens qu&#39;ils peuvent infecter les types de cellules de mammifères les plus. Les produits utilisés dans le présent protocole, sont cependant de troisième génération biosécuritaire en ce qu&#39;elles produisent non-réplicatif et auto-inactivant pseudovirus. Par conséquent, une fois dans les cellules cibles transduites ou les animaux, les cellules cibles ou des animaux ne sont pas infectieuse ou contagieuse. Substitution d&#39;autres plasmides lentivector qui ne sont pas de troisième génération biosécuritaire est possible mais pas recommandé à partir d&#39;une prévention des risques biotechnologiquesperspective. Le protocole de production et de la transduction virale subséquente des cellules cibles devraient être menées dans le cadre de biosécurité de niveau 2, selon les directives du NIH 11, et les chercheurs doivent toujours porter une blouse de laboratoire et des gants lorsque vous manipulez les particules virales. Occasion cellules productrices 293TN, tubes de particules virales, et des pipettes jetables doivent être jetés dans un conteneur pour déchets biologiques. Les pipettes réutilisables et la verrerie doivent être décontaminés avec l&#39;eau de Javel et l&#39;autoclavage à réduire l&#39;exposition du personnel.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Milieu DMEM glycémie élevée </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> Cellules 293TN </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> Pour le VIH à base de lentivectors </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> Pour FIV à base lentivectors </td></tr><tr><td> Tout vecteur lentiviral </td><td> SBI </td><td> Divers </td><td> ADNc, ShRNA, microARN journalistes de transcription, </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-il </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Mondial kit Titrage ultrarapide </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> Non décrit dans ce protocole, mais nécessaire pour titrer les particules virales </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

packaging hiv- or fiv-based lentivector expression constructs &amp; transduction of vsv-g pseudotyped viral particles

Comme à la norme des vecteurs plasmidiques, il est possible de transfecter lentivectors sous forme de plasmide dans les cellules à faible et à moyen terme l&#39;efficacité pour obtenir une expression transitoire de effecteurs. Constructions d&#39;emballage d&#39;expression lentiviraux en particules pseudoviral, cependant, permet à la transduction du 100%, même avec difficiles à transfecter des cellules primaires, tels que, la tige et des cellules différenciées. En outre, la livraison lentiviral ne produit pas les réponses cellulaires spécifiques généralement associés à des transfections chimiques, comme la mort cellulaire résultant de la toxicité du réactif de transfection 1, 2. Lorsque transduites dans des cellules cibles, la construction lentiviral s&#39;intègre dans l&#39;ADN génomique et fournit une expression stable de l&#39;épingle à cheveux d&#39;ARN (shRNA), le gène d&#39;ADNc, microARN ou reporter 3, 4. Des cellules cibles exprimant de manière stable la molécule effectrice peut être isolé à l&#39;aide d&#39;un marqueur sélectionnable contenue dans le vecteur d&#39;expression construit comme puromycine ou GFP. Après psparticules eudoviral infecter les cellules cibles, ils ne peuvent pas se répliquer dans les cellules cibles, parce que les gènes viraux structuraux sont absents et les longues répétitions terminales (LTR) sont conçus pour être auto-inactivant sur ​​la transduction du 5, 6. Il ya trois principales composantes nécessaires pour l&#39;emballage lentiviral efficace 1, 5, 6, 7. <ol><li> Le vecteur d&#39;expression lentiviral qui contient quelques-uns des éléments génétiques nécessaires pour l&#39;emballage, l&#39;intégration stable de l&#39;expression virale dans l&#39;ADN génomique de construire, et l&#39;expression de l&#39;effecteur ou reporteur. </li><li> Les plasmides d&#39;emballage lentiviraux qui fournissent les protéines essentielles pour la transcription et d&#39;emballage d&#39;une copie d&#39;ARN du vecteur d&#39;expression recombinant dans des particules pseudoviral. Ce protocole utilise les plasmides PPACK (SBI) qui codent pour gag, pol et rev à partir du génome du VIH ou le FIV et de stomatite vésiculeuse g de protéines (VSV-G) pour la protéine d&#39;enveloppe virale. </li><li> 293TN produire<html> r cellules (dérivé de cellules HEK 293) qui expriment l&#39;antigène T de SV40 grande, qui est nécessaire pour la production à titre élevé lentivirale et un gène de résistance à la néomycine, utile pour resélectionner des cellules de maintenance. </li></ol> Un aperçu du protocole de production virale peut être vu dans la figure 1. Production virale commence par co-transfection des cellules productrices 293TN avec le vecteur d&#39;expression lentiviral et les plasmides d&#39;emballage. Les particules virales sont sécrétées dans les médias. Après 48-72 heures les milieux de culture cellulaire est récolté. Débris cellulaires est enlevé à partir des milieux de culture cellulaire, et les particules virales sont précipités par centrifugation avec du PEG-il de la concentration. Produit particules sont ensuite lentiviraux titrés et peut être utilisé pour la transduction de cellules cibles. Détails de titrage virale ne sont pas inclus dans ce protocole, mais peut être trouvée à l&#39;adresse: ank &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Ce protocole a été optimisé en utilisant les produits spécifiques indiqués. D&#39;autres réactifs peuvent être substitués, mais les mêmes résultats ne peuvent être garantis.

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Vecteurs d&#39;expression lentiviraux sont les véhicules les plus efficaces pour différentes exprimant de façon stable des molécules effectrices ou des constructions rapporteurs à diviser et non de division des cellules de mammifères et des organismes entiers. Ici, nous fournir un protocole sur la façon d&#39;emballer des constructions d&#39;expression lentivector particules pseudoviral et pour transduire des cellules cibles en utilisant les particules pseudoviral.

Emballage VIH ou FIV à base de constructions d&#39;expression et de transduction du Lentivector VSV-G pseudotypés particules virales

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.9K vues.  System Biosciences. Vecteurs d'expression lentiviraux sont les véhicules les plus efficaces pour différentes exprimant de façon stable des molécules effectrices ou des constructions rapporteurs à diviser et non de division des cellules de mammifères et des organismes entiers. Ici, nous fournir un protocole sur la façon d'emballer des constructions d'expression lentivector particules pseudoviral et pour transduire des cellules cibles en utilisant les particules pseudoviral....

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

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Immunologie et infection

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplifier et quantifier l&#39;ARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l&#39;expression des gènes

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien+ T les cellules isolées de macaques rhésus

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Production de pseudo particules pour étudier les coronavirus hautement pathogènes dans un cadre de niveau 2 de Biosafety

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Évaluation de la neutralisation sérique contre le SRAS-CoV-2 avec des virus pseudotypés

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Pleins feux sur l’auteur : Étude des interactions hôte-virus avec des virus pseudotypés 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

Virus pseudotypés en tant qu’outil moléculaire pour surveiller les réponses immunitaires humorales contre le SRAS-CoV-2 via un test de neutralisation

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...