Nous tenons à remercier Andy Johnson du Centre de recherche biomédicale à l&#39;UBC pour l&#39;assistance à l&#39;analyse FACS. Financement de la recherche contre le cancer dans le laboratoire de Wong est fournie par le Société canadienne du cancer Institut de recherche (subvention de fonctionnement # 019250) et de fonds de réinvestissement de recherche de la Faculté des sciences pharmaceutiques, UBC. JMYW est soutenu par les Chaires de recherche du Canada et la Fondation Michael Smith pour les programmes de recherche en santé pour le développement de carrière.

1. Préparation des cellules <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="Figure 0" /> <ol><li> Cellules de la plaque pour atteindre une densité d&#39;environ 60% de confluence. Les cellules doivent être en phase journal au moment de la collecte. Pour les cellules MCF7, ceci est accompli par l&#39;ensemencement de 5 x 10 5 cellules / 10 cm de la plaque dans les médias appropriés. HT29 et LS180 cellules sont ensemencées à 6 x 10 5 cellules / 6 cm de la plaque. Nous avons utilisé du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1x pénicilline / streptomycine. Assurez-vous de plaques de semences pour les contrôles adéquats positives et négatives dansOutre vos échantillons. Ils comprennent ce qui suit: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Je </td><td> contrôle positif </td><td> BrdU seulement </td></tr><tr><td> ii </td><td> contrôle positif </td><td> PI ne </td></tr><tr><td> iii </td><td> contrôle négatif </td><td> BrdU négative, PI négative </td></tr></tbody></table> (Il convient de noter que d&#39;une expérience préliminaire avec dosages répétés tels que celui décrit dans le présent protocole peut être utilisé pour affiner la période durant laquelle pour mener à bien les futures collections.) <ol start="2"><li> Les cellules étalées sont incubées à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 24-48 h, ce qui permet aux cellules de récupérer et fixer. </li><li> Pour marquer les cellules avec des impulsions bromodésoxyuridine (BrdU), DMEM est remplacé wie milieu frais contenant 10 uM de BrdU. Les cellules sont incubées pendant 1 h à 37 ° C, 5% de CO 2 pour permettre l&#39;incorporation de BrdU pour dans l&#39;ADN. N&#39;oubliez pas de laisser une plaque non traitée d&#39;agir comme contrôle négatif. </li><li> Les médias d&#39;impulsion en matière d&#39;étiquetage est enlevé et les cellules sont rincées brièvement avec du PBS 1X. </li><li> Des milieux de croissance frais est ajouté (moins la BrdU) et les cellules sont autorisés à continuer à incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 jusqu&#39;à ce que le point de temps appropriée pour la récolte est atteint. </li></ol> 2. La récolte et la fixation des <ol><li> Cellules non traitées provenant de l&#39;étape 1.3 sont considérés comme la date jalon zéro. Cet échantillon peut être récoltée avec le point de temps 1 h qui est prélevé immédiatement après le traitement BrdU. </li><li> Pour récolter les cellules, les médias est enlevé et les plaques sont rincées une fois avec du PBS 1X. </li><li> Les cellules sont traitées à la trypsine, recueillies dans les médias la culture et par la suite par centrifugation à 1500 rpm pendant 5 min Supernatant est éliminé. </li><li> Rincer 1-10 x 10 6 cellules dans 5 ml de glace froide PBS 1X. Centrifuger à 1500 rpm pendant 5 min surnageant est éliminé. </li><li> Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans 100 ul de PBS glacé / 1% de FBS. Ajout de FBS 1% dans du PBS aides en empêchant l&#39;agglomération des cellules. </li><li> Ajouter ces cellules goutte à goutte à 5 ml de -20 ° C, l&#39;éthanol à 70% pour fixer les cellules. </li><li> Incuber sur de la glace pendant 30 min ou conserver à 4 ° C pendant la nuit. C&#39;est une étape idéale au cours de laquelle d&#39;arrêter la collecte des échantillons des divers moments. Les échantillons peuvent être laissés dans l&#39;éthanol pendant plusieurs jours, leur permettant d&#39;être traitées simultanément par le reste du protocole. </li></ol> 3. La coloration BrdU et PI <ol><li> Cellules par centrifugation pendant 5 min à 1500 rpm. </li><li> Retirer le fixateur, mais laisser ~ 50 ul dans lequel pour desserrer le culot au vortex. </li><li> Pour dénaturer l&#39;ADN, ajouter lentement 1 ml de HCl 2N / Triton X-100goutte à goutte tout en vortex. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation des échantillons pendant 5 min à 1500 rpm. Aspirer et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot de cellules dans 1 ml de tétraborate de sodium 0,1 M, pH 8,5, pour neutraliser l&#39;étape de dénaturation. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 1500 rpm. Aspirer et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 75 pl de mélange de coloration BrdU (50 pi 0,5% entre 20/1% de BSA / PBS + 20 pl conjugué FITC anti-BrdU + 5 pi 10 mg / ml de RNase). </li><li> Incuber à température ambiante pendant 45 min abri de la lumière. </li><li> Pour un culot de cellules, centrifuger les échantillons pendant 5 min à 1500 rpm. Aspirer et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS contenant 5 ug / ml d&#39;iodure de propidium. </li></ol> 4. Cytométrie en flux <ol><li> D&#39;analyser les cellules, un cytomètre à écoulement équipée d&#39;un laser de 488 nm et lafiltres appropriés est nécessaire. Logiciel d&#39;analyse tels que CellQuest est nécessaire de créer des parcelles décrites ci-dessous. </li><li> Lors de l&#39;exécution de l&#39;échantillon dans le cytomètre en flux, créer une diffusion vers l&#39;avant (SSC-H) vs côté de dispersion (FSC-H) complot visant à assurer la distribution de la taille adéquate des cellules (figure 1A). Ces deux paramètres sont tracées sur une échelle linéaire. </li><li> Visualiser simultanément une parcelle de FL3-H (PI tache) vs FL2-W (figure 1B). Cette trame est utilisée pour créer une grille (R3) pour isoler la fraction de cellules qui sont dans la configuration de distribution normale du cycle cellulaire. En général, ce schéma de répartition est caractérisée par deux groupes de cellules de la teneur en ADN 2N et 4N de marquage par le PI représentant le G1 et G2 phases du cycle cellulaire, respectivement. Une chaîne de cellules situées entre ces 2 groupes est représentatif de la réplication d&#39;ADN continu qui se produit dans la phase S du cycle cellulaire. </li><li> Créer un complot displaying des cellules clos (R3) à partir de l&#39;étape 4.3, à FL1-H (FITC, l&#39;intrigue journal) sur l&#39;axe des y et PI (tracé linéaire) sur l&#39;axe des x (figure 1C). Cette parcelle sera utilisée pour définir les autres paramètres en utilisant les différentes commandes décrites au paragraphe 1.1, ainsi que pour recueillir des données pour l&#39;analyse. </li><li> Placez le seul IP échantillon coloré sur le cytomètre. Réglez le gain de placer G1 à ~ 200 sur l&#39;axe des x. Ce sera plus facile de visualiser dans un histogramme de la tache PI. </li><li> Un deuxième contrôle consiste à exécuter un échantillon BrdU-seulement sur le cytomètre en flux. Réglez le gain de sorte que les 2 populations de cellules BrdU (positif vs négatif BrdU) apparaissent sur la parcelle. Idéalement, les cellules BrdU négatives sont positionnés à apparaître juste en dessous de 10 -1. </li><li> Le contrôle final est l&#39;échantillon BrdU / PI négative. Exécuter ce témoin négatif pour s&#39;assurer que les cellules n&#39;apparaissent pas dans l&#39;un des quadrants supérieurs à main ou à droite. </li><li> Une fois les paramètres des différentes parcelles ont été fixés, lecytomètre en flux est étalonné et prêt pour le traitement de cellules BrdU et PI colorées. Un minimum de 10.000 cellules qui sont gated dans la fraction correcte PI (voir l&#39;étape 4.3) doit être lu par collection. </li><li> Pour analyser les données recueillies, des logiciels tels que FlowJo ou FACSDiva sont utilisés. Chacune des parcelles mentionnées ci-dessus peuvent être recréées dans ces programmes et l&#39;analyse quantitative et statistique réalisée. </li><li> Le critère d&#39;évaluation de l&#39;analyse comporte plusieurs étapes successives. Création d&#39;une parcelle de FITC vs PI avec des cellules bloquées de façon positive dans la parcelle PI vs FL2-W PI permet de distinguer la population du vélo. Une seconde grille est créée à partir de ce complot, en isolant le BrdU positive de la population. Exprimant cette population particulière sur un histogramme avec PI sur l&#39;axe des x permet de suivre l&#39;évolution dans le temps de progression du cycle cellulaire. Cela peut être visualisée en outre en traçant le nombre de cellules positives BrdU avec G1 ou G2 contenu en tant que fonction du temps. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Normalement, les cellules de cyclisme colorées avec de l&#39;iodure de propidium ont pics distincts à G1 et G2, correspondant à des cellules contenant l&#39;ADN contenu 2N et 4N, respectivement (figure 2). Pulse étiquetage avec BrdU permet de marquage sélectif d&#39;une sous-population de cellules qui sont activement synthétiser de l&#39;ADN (phase S ie). Peu de temps après l&#39;enlèvement du réactif BrdU, toutes les cellules marquées sont en phase S (figure 3). En limitant l&#39;étiquetage pour une courte impulsion on est capable de suivre ce chemin s&#39;est distingué sous-population de cellules à travers de nombreux points dans le temps comme ils passent à travers les phases ultérieures du cycle cellulaire. Ceci peut être visualisé au point 1 h de temps de la figure 3 comme un manque flagrant de G1 et G2 pics. Des informations complémentaires peuvent être dérivés de l&#39;étape de marquage BrdU. Non seulement la proportion de cellules qui se divisent activement être mesurée, mais une HNEimate étape de distribution du cycle cellulaire entre deux échantillons peut être déterminée ainsi. En recueillant des cellules à des intervalles équidistants qui suivent le retrait du réactif BrdU, les cellules peuvent être tracée comme ils continuent à vélo, les progrès à G2 et, finalement, se déplacer dans la division cellulaire des cellules d&#39;origine, enfin en train de devenir des cellules filles BrdU-positives avec G1 la teneur en ADN (figure 4). Un exemple de quantification de phase du cycle cellulaire et l&#39;analyse cinétique est fournie à la figure 5. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. (A) par rapport Forward Scatter Nuage de points de côté d&#39;un représentant de population de cellules MCF7. (B) par rapport PI Largeur (FL-W) Terrain d&#39;un représentant population de cellules MCF7. Gating est montré à exclure doublets de cellules dans l&#39;analyse finale (R3). Doublets de cellules auront une largeur supérieure impulsion que d&#39;une seule cellule, comme ils prennent plus de temps à passer à travers le faisceau laser et therefminerai peut être exclu de l&#39;analyse. (C) par rapport à PI FITC (BrdU) Terrain d&#39;une population de cellules MCF7 représentant. Gating est montré pour inclure uniquement les FITC (BrdU) des cellules positives (R4). <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Histogramme représentant une population totale de cellules normalement vélo. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Histogramme des cellules qui ont été recueillies 1h après le retrait de l&#39;impulsion de BrdU, après de déclenchement pour FITC (BrdU) de cellules positives. BrdU-positives cellules à un point de temps au début après le retrait de l&#39;étiquette montrent des profils de PI qui correspondent à des échantillons d&#39;ADN affichant un contenu compatible avec les cellules qui sont dans la phase S du cycle cellulaire, ce qui confirme l&#39;étiquetage réussie de cellules que lors de la synthèse d&#39;ADN. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" a<html> lt = &quot;Figure 4&quot; /&gt; Figure 4. Comparaison de la cinétique du cycle cellulaire de progression entre les lignes cellulaires cancéreuses, les cancers colorectaux HT29 (A) et LS180 (B), ainsi que MCF7 cancer du sein (C). Les cellules ont été recueillies toutes les heures pendant 8 heures, après le retrait de l&#39;impulsion de BrdU. Dans cette expérience, nous avons observé un profil clair de la progression du cycle cellulaire accélérée par le biais de la phase G2 du cycle cellulaire dans la lignée cellulaire LS180 colorectal. En comparant la cinétique entre les deux profils de cellules du cancer colorectal, l&#39;émergence d&#39;un pic G1 est évident à T = 4h l&#39;après-BrdU dans les cellules LS180, par rapport au point de temps correspondant à la ligne cellulaire HT-29 qui n&#39;a pas ce pic. Par rapport à une ou l&#39;autre des deux lignées de cellules colorectales, les cellules MCF7 sont le vélo à un taux significativement réduit. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <html> re 5 &quot;/&gt; Figure 5. (A) L&#39;analyse quantitative de phase du cycle cellulaire des cellules cancéreuses BrdU-étiquetés. L&#39;algorithme de Dean / Jett / Fox a été appliqué à HT29, LS180 et MCF7 (illustré en vert). Les distributions résultant du cycle cellulaire en phase de chaque échantillon sont exprimés en% Total BrdU-positives cellules pour chaque phase. Seulement sélectionner des points de temps pour chaque lignée cellulaire sont affichés, comme les analyses de quelques-uns des points dans le temps antérieurs ont produit des résultats incorrects. Dans ces points dans le temps plus tôt, toutes les cellules BrdU-positives sont dans la phase S et manquent donc de G1 distincte et les pics de G2, qui sont nécessaires pour l&#39;application algorithme. (B) histogrammes de cellules cancéreuses affichant la cinétique de la progression à travers G2 / M phases du cycle cellulaire. La progression dans G2 / M est le plus rapide pour les phases LS180 cellules, suivie par HT29 et MCF7. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <html> jpg &quot;alt =&quot; Figure S1 &quot;/&gt; Figure S1. Contrôles cytométrie en flux. cellules MCF7 sont indiqués par (A) contrôle négatif où les cellules ne sont ni PI ni teinté BrdU. (B) PI ne colorées. (C) BrdU-FITC étiqueté échantillons. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="Figure S2" /> Figure S2. Illustration schématique montrant la relation entre le spectre d&#39;émission de fluorescence du PI par rapport au FITC (BrdU). Les fenêtres spectrales de collecte pour le canal fluorescent 1 (FL1, pour FITC) et le canal fluorescent 3 (LV3, pour PI) sont présentés dans les cases correspondantes. Il n&#39;y a pas de chevauchement des spectres fluorophores entre FL1 et FL3 de détection. Evidemment, la compensation de fluorescence n&#39;est pas nécessaire lorsque des données expérimentales de PI et FITC-BrdU co-marqués cellules sont collectées dans les canaux FL1/FL3 respectivement. Spectres de fluorescence ont été obtenus de BD Biosciences site:target = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

En combinant la cytométrie de flux avec l&#39;incorporation de BrdU, nous avons les outils nécessaires pour étudier la cinétique du cycle cellulaire. La propriété distinctive de BrdU à fonctionner comme un analogue de la thymidine est ce qui permet de quantifier la teneur en ADN d&#39;une cellule à vélo. L&#39;incorporation de BrdU dans un brin d&#39;ADN fille croissante au cours de la synthèse en phase du cycle cellulaire est ce qui permet un à suivre une sous-population de cellules à vélo à travers la r?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> bromodésoxyuridine </td><td> Becton Dickinson </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> l&#39;iodure de propidium </td><td> Sigma </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml de stock </td></tr><tr><td> FITC anti-BrdU </td><td> Becton Dickinson </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> tétraborate de sodium </td><td> Pêcheur </td><td> S80172 </td><td> 0,1 M, pH 8,5 </td></tr><tr><td> Calibre FACS </td><td> Becton Dickinson </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

Un contrôle précis de l&#39;initiation et la progression ultérieure à travers les différentes phases du cycle cellulaire sont d&#39;une importance capitale dans des cellules proliférantes. Cycle de division cellulaire est une partie intégrante de la croissance et la reproduction et la déréglementation des principaux composants du cycle cellulaire ont été impliqués dans les événements ayant mené à de 1,2 cancérogenèse. Agents moléculaires dans les traitements anticancéreux fréquemment cibler les voies biologiques responsables de la réglementation et la coordination de la division du cycle cellulaire 3. Bien que la cinétique du cycle cellulaire ont tendance à varier selon le type de cellule, la distribution des cellules parmi les quatre étapes du cycle cellulaire est plutôt cohérente au sein d&#39;une lignée cellulaire particulière en raison de la tendance constante des mitogènes et d&#39;expression du facteur de croissance. Événements génotoxiques et autres facteurs de stress cellulaire peut entraîner dans un bloc temporaire de la progression du cycle cellulaire, résultant en l&#39;arrestation ou d&#39;une pause temporaire dans une phase du cycle cellulaire en particulier pour permettre institutionstion du mécanisme de réponse appropriée. La capacité à observer le comportement expérimentalement d&#39;une population de cellules en fonction de leur stade de progression du cycle cellulaire est un progrès important dans la biologie cellulaire. Des procédures communes telles que mitotique secouer, centrifugation différentielle ou la cytométrie de flux à base de tri sont utilisées pour isoler des cellules à des stades spécifiques du cycle cellulaire 4-6. Ces fractionnés, du cycle cellulaire en phase enrichis populations sont alors soumis à des traitements expérimentaux. Rendement, la pureté et la viabilité des fractions séparées peuvent souvent être compromise en utilisant ces méthodes de séparation physique. De plus, le laps de temps entre la séparation des populations de cellules et le début du traitement expérimental, dans lequel les cellules fractionnées peut progresser à partir du stade du cycle cellulaire sélectionnée, qui peuvent poser des défis importants dans la mise en œuvre réussie et l&#39;interprétation de ces expériences. D&#39;autres approches de study stades du cycle cellulaire incluent l&#39;utilisation de produits chimiques pour synchroniser les cellules. Le traitement des cellules avec des inhibiteurs chimiques des principaux processus métaboliques pour chaque stade du cycle cellulaire sont utiles dans le blocage de la progression du cycle cellulaire à l&#39;étape suivante. Par exemple, les inhibiteurs de la ribonucléotide réductase hydroxyurée cellules s&#39;arrête à la jonction G1 / S en limitant l&#39;offre de désoxynucléotides, les blocs constitutifs de l&#39;ADN. D&#39;autres produits chimiques notables comprennent le traitement avec l&#39;aphidicoline, un inhibiteur de l&#39;alpha-polymérase d&#39;arrêt G1, le traitement par la colchicine et le nocodazole, qui tous deux interférer avec la formation du fuseau mitotique à arrêter les cellules en phase M et enfin, le traitement avec la chaîne d&#39;ADN de terminaison 5-fluorodeoxyridine pour initier arrestation de la phase S 7-9. Le traitement avec ces produits chimiques est un moyen efficace de synchroniser toute une population de cellules à une phase particulière. Avec le retrait de la substance chimique, les cellules rejoindre le cycle cellulaire à l&#39;unisson. Traitement de la libération test suivant l&#39;agentde la composition chimique du cycle cellulaire de blocage assure que la réponse aux médicaments a suscité provient d&#39;un uniforme, cycle cellulaire spécifique au stade de la population. Cependant, puisque la plupart des synchroniseurs chimiques génotoxiques sont des composés connus, à démêler la participation de diverses voies de réponse (aux synchroniseurs vs les agents de test) est un défi. Nous décrivons ici une méthode de marquage métabolique pour la suite d&#39;une sous-population de cellules activement à vélo à travers leur progression de la phase de réplication de l&#39;ADN, par l&#39;intermédiaire de la division et la séparation de leurs cellules filles. Couplé avec la quantification par cytométrie en flux, ce protocole permet à la mesure de la progression de cinétique du cycle cellulaire en l&#39;absence de l&#39;une des mécaniquement ou chimiquement induite par cellulaire souligne souvent associée à des méthodes autres cellules de synchronisation du cycle 10. Dans les sections suivantes, nous allons discuter de la méthodologie, ainsi que certaines de ses applications dans la recherche biomédicale.

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Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Suivi des changements subtils dans la progression et la cinétique des étapes du cycle cellulaire peut être accompli par l&#39;utilisation d&#39;une combinaison de marquage métabolique des acides nucléiques avec BrdU et totale coloration de l&#39;ADN génomique par l&#39;iodure de propidium. Cette méthode évite la nécessité de la synchronisation chimique des cellules de cyclisme, empêchant ainsi l&#39;introduction de dommages à l&#39;ADN non-spécifique, ce qui affecte à son tour la progression du cycle cellulaire.

Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K vues.  University of British Columbia. Suivi des changements subtils dans la progression et la cinétique des étapes du cycle cellulaire peut être accompli par l'utilisation d'une combinaison de marquage métabolique des acides nucléiques avec BrdU et totale coloration de l'ADN génomique par l'iodure de propidium. Cette méthode évite la nécessité de la synchronisation chimique des cellules de cyclisme, empêchant ainsi l'introduction de dommages à l'ADN non-spécifique, ce qui ...

Vidéo: Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

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Biologie

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Mesure intracellulaire de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Les changements dans le sperme humain à l&#39;aide de quatre techniques: FLUOROMETRIE conventionnel, s&#39;est arrêté Fluorimétrie du flux, la cytométrie en flux et l&#39;imagerie cellulaire unique

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Marquage métabolique de leucine Rich Repeat Kinase 1 et 2 avec radioactifs Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cultures Suspension cellulaires

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...