Nous remercions le Dr R. Michael Sramkoski de l&#39;aide pour la cytométrie en flux, le Dr Purnima Jaiswal et le Dr Di Wu pour entrée tôt et Ilya Aylyarov de l&#39;aide pour les illustrations. Soutenu par des subventions du NIH R01GM089872 et la cytométrie &amp; Imaging Microscopy Facility base du Centre de cas Comprehensive Cancer (P30 CA43703).

1. La croissance des cellules haploïdes <ol><li> Cultivez S. cerevisiae S288C de l&#39;arrière-plan (BY4741) dans des conditions normales 10. </li><li> Transformez haploïdes pour exprimer l&#39;un des deux marqueurs fluorescents visibles 10. Les marqueurs de choix sont la GFP soluble exprimée dans le cytoplasme (pEG220, URA3/YIp, linéarisé avec BglII 11) et une seule protéine ribosomique, RPL25, fusionné avec mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Nous nous attendons à ce que les protocoles de purification équivalent à deux couleurs pourrait utiliser d&#39;autres protéines fluorescentes vives qui sont synthétisées par les cellules haploïdes parentales. Alternativement, la paroi cellulaire pourrait être étiqueté avec des lectines fluorescentes. </li><li> Sur la purification zygote veille, inoculer 5 ml de cultures de chaque type de cellule et les cultiver sous agitation durant la nuit à 23 ° C pour atteindre A600 ne dépassant pas 1,0. Croître les transformants GFP (ATY4442) dans un milieu synthétique complet, y compris 2% de glucose (CSM-glucose) une-RPL25 mCherry transformants (ATY4552) en milieu sélectif dépourvu d&#39;uracile synthétique 10. Maintenir des cultures parallèles de chaque type de cellule sous agitation à la température ambiante. </li></ol> 2. Réalisation d&#39;une croix <ol><li> Régler la densité optique (A600) de chaque échantillon à 1,0 dans un milieu frais. [1 ~ unité de densité optique 3 x 10 7 cellules / ml] </li><li> Mélanger des volumes égaux des deux cultures, vortex brièvement 3 fois, suivies d&#39;une longue vortex pendant 10 sec. </li><li> Préparer CSM-glucose plaques. Les plaques sont identiques à ceux utilisés pour la croissance et la routine ont été séchés 45 min après la coulée et la solidification de la gélose 10. </li><li> Distribuer jusqu&#39;à vingt 40-ml gouttelettes du mélange 1 cm du bord de la surface de plaques CSM-glucose. Lorsque les gouttelettes sont tout d&#39;abord appliqué à la surface démarrer la minuterie pour mesurer le temps écoulé. Une fois que le liquide a été absorbé (environ 30 min), couvrir les plaques et les laisser reposer au rootempérature m. </li></ol> 3. Les préparatifs de récolte <ol><li> Après la récolte des échantillons de 1,75 à 2,5 heure à 23 ° C par des lavages répétés individuels gouttelettes séchées à l&#39;aide de la plaque 150 ml froid CSM-glucose, la tenue des plaques sur de la glace. Laver plusieurs fois le domaine des gouttelettes 10-20 fois avec le même milieu pour maximiser la récupération. Recueillir dans des tubes de 15 ml Falcon sur la glace. </li><li> Sonder soniquer les échantillons à une amplitude de 10x 60% avec un sonicateur Fisher FB120 (120Watt, 120Volt, Freq 20KHz) sur la glace. </li><li> Vérifiez dans un microscope à phase que les agrégats peu ou pas de rester. 15-50% des cellules sont censés avoir formé zygotes à ce stade. </li><li> Laisser le tube de cellules dans une position verticale au repos sur de la glace pendant 10 minutes comme précaution supplémentaire (pour permettre de régler les agrégats). </li><li> Récupérer la plus haute de 90% du volume et de la filtrer à travers un tamis en nylon (tube en polypropylène BD Falcon avec filtre bouchon (Ref 352235)). Dans une expérience typique, 10 7 cellulesrécupéré d&#39;une plaque étaient à ce point diluée dans 4 ml de CSM-glucose. </li></ol> 4. Cytométrie en flux <ol><li> Trier les cellules en utilisant le modèle Sony réflexion ICYT cytomètre de flux, (hautement automatisée Trier parallèle) HAPS1 avec une pointe de 100 microns. Pour l&#39;excitation GFP, utilisez le bleu argon-ion, 250 milliwatt laser à 488 nm. Pour l&#39;excitation mCherry, utilisez le laser de 100 milliwatts à 561 nm. Même si nous n&#39;avons pas d&#39;expérience avec d&#39;autres machines, nous nous attendons à ce que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Afflux ou Beckman Coulter MoFlo XDP serait bien s&#39;il est équipé des lasers appropriés. </li><li> Base de paramètres de tri sur un terrain de diffusion vers l&#39;avant vs rentré dans l&#39;ordre à la porte des cellules viables. Établir un complot émission de 615 + / - 30 passe-bande nm filtre (mCherry) par rapport à 525 + / - 25 passe-bande nm filtre (GFP) pour diviser les événements en quatre quadrants, &quot;rouge + vert-&quot;, &quot;rouge + vert +&quot;, &quot;rouge- Green-»et« Rouge-Vert + &quot;(figure S2). Utilisez cellules non fluorescentes comme une norme fou la détermination du &quot;Rouge-Vert-&quot; quadrant. </li><li> Trier les cellules avec une pression de 21,5 psi gaine, une fréquence goutte de 43.400 gouttes / s, et sous une pression de 20,5 psi échantillon. </li><li> Trier initiale (&quot;Recovery Mode&quot;): Prélever des échantillons dans des tubes Eppendorf réfrigérées contenant 250 ml d&#39;eau froide CSM-glucose. Sédiments 10 sec à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse réfrigérée (Tomy MRX-150, 15.000 tours par minute) et aspirer la solution de flux (solution gaine de cytométrie en flux (PBS avec 1 mM d&#39;EDTA) Catalogue BioSure N ° 1027). Remettre en suspension dans 500 ml froid CSM-glucose. </li><li> Trier seconde (mode &quot;Pureté&quot;): Réaliser le genre comme pour le tri initial, en utilisant le mode &quot;pureté&quot; option. Sédiments l&#39;. Cellules purifiées et remettre en suspension les culots dans 500 ml 1,0 ml CSM-glucose Agiter pendant 15 min dans des plaques 24 puits à 23 ° C pour permettre la récupération métabolique. </li></ol> 5. Microscopie DeltaVision <ol><li> Préparer tampons d&#39;agarose comme suit: Apportez une suspension de 1,5% d&#39;agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, catalogue 15510-07) in CSM-glucose à ébullition, homogénéiser brièvement au vortex, puis appliquez échantillons 0,3 ml de la solution d&#39;agarose à la surface des lames de verre horizontaux standard et les couvrir à la fois avec une deuxième lame (sans application d&#39;une pression). </li><li> Après refroidissement pendant 10 minutes, retirez délicatement le chariot supérieur en le faisant glisser horizontalement, en prenant soin de laisser une surface lisse et ne pas perturber la couche d&#39;agarose. (Lorsque le chariot supérieur a été retiré, l&#39;échantillon de cellules doit être appliqué dans les 1-2 min. Lorsqu&#39;il est conservé dans une chambre humide à température ambiante sans enlever le chariot supérieur, plaquettes peuvent être conservées pendant une journée avant de l&#39;utiliser.) </li><li> Des échantillons de sédiments et dépôt aliquotes de 1 ml de la pastille sur des patins d&#39;agarose (sans toucher la surface). Couvrir immédiatement l&#39;échantillon avec un carré n ° 1 lamelle. Coupez l&#39;excès d&#39;agarose avec une lame de rasoir à un seul tranchant. Sceller les préparations avec de la vaseline distribués à partir d&#39;une seringue. </li><li> Image à l&#39;aide Deltavision (Applied Precision) avec un objectif à immersion 100x sans binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Déconvolutionner z-piles en utilisant le programme Softworx 5.0.0 ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) et de traiter de façon minimale. Successives z-plans sont généralement collectées à 0,2-0,4 microns intervalles. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Les niveaux d&#39;intensité de fluorescence dans les cellules haploïdes transformées: Le niveau de fluorescence dans les haploïdes est illustré à la Figure S1. Avant la croix, l&#39;examen épifluorescence démontré que pratiquement tous les transformants GFP étaient verts et que tous les transformants mCherry, bien que souvent plus faibles, étaient rouges. Afin de s&#39;assurer que toutes les cellules utilisées pour la croix étaient en effet fluorescent, nous avons utilisé la sous-population la plus brillante signal fluorescent. Rendement: Après le tri initial, le Rouge + Vert + échantillon (figure S2) comporte typiquement 8-20% du nombre de cellules d&#39;entrée et un nombre excessif de cellules haploïdes, peut-être en raison de la persistance adhésion cellule-cellule. Depuis fort enrichissement n&#39;est pas atteint d&#39;une sorte unique, l&#39;échantillon partiellement purifié la sonde doit être traité par ultrasons deux fois à une amplitude de 60% suivie de re-trier. (Sortes de récupération durent généralement entre 1-2 heures, tandis que le deuxième type ne nécessite que 15 min.) Sur les cellules soumises à la seconde espèce, les rouge + vert + échantillons inclus 23-52% des cellules d&#39;entrée. Examen microscopique phase: Examen par microscopie à contraste de phase a montré que la pureté de la préparation finale zygote en moyenne à environ 90% de plus de 21 préparations (allant de 86% à 91%). Les contaminants sont soit des haploïdes vertes ou rouges, ou de paires d&#39;haploïdes ayant été en contact avec l&#39;autre. Figure 3 pour cent de la dépouille qui ont zygotespas de bourgeon, bourgeons médians (Med), les bourgeons latéraux (Latitude) ou des bourgeons terminaux (Term), le nombre de paires haploïdes de la même couleur (&quot;2Same&quot;) ou de couleur différente (&quot;2Hap&quot;), ainsi que haploïdes individuels ( Hap). Lorsque les cellules ont été récoltées après 1,75 h, plus de 50% ont été unbudded et les autres sous-catégories (avec médial, des bourgeons latéraux ou terminaux) étaient également représentés. Après 2,5 h, il y avait à peu près autant de zygotes dans chacune des quatre catégories (unbudded, avec médial, des bourgeons latéraux ou terminaux). Observations microscopiques (figure 4): La structure de zygotes semble pas modifié lors de la purification. Selon la durée de la croix, la population avait des proportions différentes de zygotes unbudded et fleuri, comme expliqué ci-dessus. Puisque les haploïdes vert et rouge ont montré une variation considérable dans l&#39;intensité du signal fluorescent, certains étaient en majorité des zygotes rouge tandis que d&#39;autres étaient à prédominance verte, comme cela est observé par Comparing les images monochromes aux images combinées dans la figure 4. Notez également que la GFP (MW 26 kDa) pénètre dans le noyau et peut être trouvé dans le noyau, même lorsque les noyaux n&#39;ont pas fusionné. Vacuoles se démarquer en tant que noir non fluorescents sphères. Le produit final de purification donne une population diversifiée à différents stades de développement. Zygotes étiquetés Une fusion n&#39;ont pas subi. Type de zygotes B sont unbudded. Type C ont un petit bourgeon. Type D ont une plus grande bourgeon, et zygotes de type E sont sur le point de subir une cytokinèse. Notez également que la plupart des zygotes antérieures présentent encore une ligne non fluorescent division médiale (*), et que la «structure d&#39;héritage&quot; vacuolaire (I) 12 peuvent souvent être vus à s&#39;étendre à partir du zygote dans l&#39;œuf. Dans certains cas, le signal vert a redistribué dans le partenaire dans une mesure beaucoup plus grande que le signal rouge. Cela traduit le retard de transfert, qui est caractéristique des polysomes (Tartakoff, en préparation). 6 zygotes, ce qui est suffisant pour immunoblots nombreux, en utilisant les procédures de détection de chimioluminescence. En utilisant des protocoles d&#39;isolement au phénol-chloroforme on extrait environ 1,5 mg d&#39;ARN à partir de ce nombre de cellules. Depuis les zygotes purifiés ont été refroidie, avant de l&#39;analyser, nous recommandons d&#39;incubation à 23 ° C dans un milieu de croissance. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figure 1. Chronologie de la formation du zygote. Zygotes comme un intermédiaire entre les haploïdes et diploïdes. Ce diagramme montre l&#39;activation classique (shmooing) des haploïdes, leur fusion, et la formation de l&#39;œuf initial. Bourgeons peut être soit interne (M), latérale (L) ou le terminal (T). <imgalt = &quot;Figure 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Schématique du protocole de purification zygote. Après incubation à la surface des plaques de gélose dans un milieu complet avec le glucose, le mélange de cellules est récupéré par lavage et ensuite soumis à un tri initial en mode &quot;récupération&quot; suivi d&#39;un second type de mode de pureté &quot;. &quot; La couleur jaune signifie que les deux mCherry et les signaux de GFP étaient visibles dans les zygotes. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figure 3. Variétés de zygotes dans les mélanges d&#39;accouplement purifiés fractions. Ont été récoltées après 1,75 ou 2,5 heures pour récupérer des fractions enrichies en zygotes relativement tôt par rapport relativement plus mature. Huit expériences indépendantes, désignées par les couleurs distinctes, ont été réalisées pour chaque point dans le temps. Les graphiques indiquent le nombre relatif de zygotes qui have spatialement modèles distincts de formation des bourgeons. Compte tenu de la courte durée de l&#39;incubation (moins de 2,5 h à température ambiante) tous les bourgeons initiaux observés sont zygotiques événements en herbe. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figure 4. DeltaVision examen de fractions enrichies. Un domaine typique a été examinée par microscopie Deltavision. Les illustrations montrent soit des couleurs rouges et vertes ou unique. Le rouge correspond à l&#39;étiquette polysomique (Rpl25p-mCherry) et le vert à la GFP cytosolique. Notez le fort enrichissement des zygotes et les caractéristiques subcellulaires désignés: les vacuoles (v), les bourgeons (b), le noyau (n), &quot;structure d&#39;héritage&quot; vacuolaire (i), et la partition (*) qui semble séparer l&#39;parentale domaines de zygotes relativement tôt. Leur couleur variable globale reflète l&#39;intensité relative des haploïdes qui fusionnés. Dans les cas où les deux domaines retiennent parentalesune couleur distincte, l&#39;équilibrage des marqueurs (GFP cytoplasmique, mCherry étiquetées polysomes) était incomplète. Time-lapse études en cours montrent que les redistribue GFP soluble avant polysomes. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Legends supplémentaires <img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Figure S1. Fluorescence des cellules haploïdes Extrême gauche:. Cellules exprimant polysomes mCherry-marqués ont été examinés pour détecter un signal vert. La fenêtre rectangulaire a été créée pour éviter les cellules négatives. Graphique du milieu: Des cellules exprimant la GFP cytosolique ont été analysés, montrant la population nettement lumineux majeur de points positifs. Extrême droite: Les cellules exprimant polysomes mCherry-marqués ont été analysés. Le rectangle (identique à celle de l&#39;extrême gauche) comprend les plus brillants cellules et permet à tous lesnégatifs à éviter. La désignation «R2» indique le pourcentage de cellules récupérées dans le rectangle indiqué. <img alt="Figure S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figure S2. Répartition des cellules dans le tri premier et deuxième. Ces parcelles de deux couleurs indiquent la proportion de vert + rouge + cellules dans le quadrant supérieur droit (R5). Cette proportion augmente à 52% dans la seconde sorte. Axe horizontal: signal vert. Axe vertical: signal rouge.

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	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La disponibilité des zygotes purifiés devrait faciliter les études biochimiques, y compris la transcriptomique, la protéomique et la lipidomique, ainsi que des enquêtes sur les mécanismes par lesquels les zygotes subissent cycle cellulaire rentrée, remodelage de la paroi cellulaire, caractéristiques en herbe et à l&#39;héritage, etc Alternativement, les zygotes pourraient être générés à partir avec des souches porteuses de mutations caractéristiques dans l&#39;un ou les deux parents. En outre, les zygote...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif / équipement </td><td> Source </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codant pour la GFP cytoplasmique 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, l&#39;encodage RPL25 fusionnée à mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicateur </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Tube en polypropylène avec couvercle passoire </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse réfrigérée </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Solution gaine cytométrie en flux </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Réflexion ICYT Modèle cytomètre de flux </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> Microscope déconvolution DeltaVision </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit à épifluorescence </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> Formulation de glucose CSM Notes: Pour les plaques d&#39;agar agar, il suffit d&#39;inclure 2% (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zygotes sont des intermédiaires essentiels entre les haploïdes et diploïdes états du cycle de vie de nombreux organismes, y compris la levure (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes résultat de la fusion de cellules haploïdes de type sexuel distinct (MATa, MATalpha) et donner lieu à des correspondants diploïdes stables qui génèrent successivement jusqu&#39;à 20 descendance diploïde en raison de leurs divisions mitotiques étonnamment asymétriques 2. Formation Zygote est orchestré par une séquence complexe d&#39;événements: Dans ce processus, les facteurs d&#39;accouplement solubles se lient aux récepteurs apparenté, déclenchant médiés par le récepteur cascades de signalisation qui facilitent l&#39;interruption du cycle cellulaire et aboutir à fusion cellule-cellule. Zygotes peut être considéré comme un modèle pour les progéniteurs ou de la fonction des cellules souches. Même si on a beaucoup appris à propos de la formation des zygotes et bien zygotes ont été utilisés pour étudier les cellules moléculaires des questions d&#39;intérêt général Significance, presque toutes les études ont eu recours à des mélanges d&#39;accouplement dans laquelle sont mélangés des zygotes avec une majorité de la population de cellules haploïdes 3-8. De nombreux aspects de la biochimie de la formation du zygote et la vie continue du zygote restent donc d&#39;une enquête. Rapports de purification des zygotes levure décrire les protocoles basés sur leurs propriétés de sédimentation 9; toutefois, cette procédure basée sur la sédimentation n&#39;a pas donné près de 90% de pureté dans nos mains. En outre, elle présente l&#39;inconvénient que les cellules sont exposées au sorbitol hypertonique. Nous avons donc mis au point un procédé de purification polyvalente. A cet effet, des paires de cellules haploïdes exprimant rouges ou verts protéines fluorescentes ont été co-incubées pour permettre la formation du zygote, récoltées à des moments différents, et les zygotes obtenus ont été purifiés en utilisant un protocole de triage par cytométrie de flux à base de. Cette technique permet une évaluation visuelle pratique de la pureté et de la maturation. La pureté moyennede la fraction est d&#39;environ 90%. Selon le moment de la récolte, les zygotes de différents degrés de maturité peut être récupéré. Les échantillons purifiés fournir un point de départ commode pour les «-omiques» des études, pour la récupération de la descendance initiale, et une enquête systématique de cette cellule souche.

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Pour purifier les zygotes de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Les cellules haploïdes de type sexuel opposé ont été modifiées pour exprimer rouges ou verts protéines fluorescentes, co-incubées pour permettre la formation du zygote, et fractionnés en utilisant une cytométrie de flux à base de protocole. La fraction hautement enrichi permet ultérieur &quot;-omiques», les études, la reprise de la descendance initiale, et l&#39;investigation systématique de la morphogenèse zygote.

Cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

12.7K vues.  Case Western Reserve University School of Medicine. Pour purifier les zygotes de S. cerevisiae, Les cellules haploïdes de type sexuel opposé ont été modifiées pour exprimer rouges ou verts protéines fluorescentes, co-incubées pour permettre la formation du zygote, et fractionnés en utilisant une cytométrie de flux à base de protocole. La fraction hautement enrichi permet ultérieur "-omiques», les études, la reprise de la descendance initiale, et l'investigation systématique de la morph...

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Dosage de l&#39;adhésion et l&#39;invasion Agar chez S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

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Biologie

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Etudier Instabilité génomique fonction de l&#39;âge en utilisant les S. cerevisiae Modèle chronologique Lifespan

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

À haut débit microinjections oursins zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;