Les auteurs tiennent à remercier Brogan Invité, Michelle Weaver, et Kristen Lippert. Le financement de cette étude a été fourni par des subventions du NIH R03EB009237, ainsi que les subventions de formation NIH T32EB001026-06 de l&#39;Institut national d&#39;imagerie biomédicale et de la bioingénierie et T32HL076124-05.

1. Préparation des tissus et Experiment Setup <ol><li> Organe porcin récolte immédiatement après l&#39;euthanasie d&#39;une installation abattoir ou de la recherche et de rincer l&#39;excès de sang. Coupez le cœur de l&#39;excès de graisse et de tissus, en gardant les oreillettes et l&#39;aorte intacte. Coupez le gras de séparer l&#39;artère pulmonaire à l&#39;aorte. S&#39;il ya des coupures dans le tissu, jeter de façon appropriée. </li><li> Enveloppez chaque coeur individuellement dans du papier congélateur et stocker tous les tissus dans un congélateur à -80 ° C pendant au moins 24 h à garantir une congélation complète. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à l&#39;emploi (généralement moins de 3 mois), le dégel un cœur intact de porc congelé dans de l&#39;eau de type 1 nuit immergé dans un bêcher de 4 L à 4 ° C. </li><li> Après le cœur est complètement dégelé, caresser le cœur sec, peser le cœur, et noter le poids. Le cœur d&#39;un cochon poids de marché devrait peser environ 375-450 g. </li><li> Connectez taille 18 tube Masterflex à l&#39;¼ &quot;fin d&#39;un réducteur de fer barbelé. Insérez le réducteur de fer barbelé ettube intérieur de l&#39;aorte. Placer les pinces de serrage 2 ou attaches sécurisées autour de l&#39;aorte, juste en dessous du tronc brachio-céphalique. Le réducteur et la tubulure doit rester au-dessus de la valve aortique, de sorte que les artères coronaires peut être perfusé (figure 1). </li><li> Utilisez une seringue de 30 ou 60 ml pour remplir le tube avec de l&#39;eau de type I. Insérer le tube dans la cartouche d&#39;une pompe à galet Masterflex en son milieu approximatif. Plonger l&#39;extrémité d&#39;entrée du tube dans le fond d&#39;un bêcher rempli 4 L à 2,5 L d&#39;eau et fixer le tube. </li><li> Placez le cœur dans le bécher rempli d&#39;eau, et amorcer la pompe pour éliminer les bulles d&#39;air. Si des bulles sont observées en provenance de l&#39;aorte où le tube est inséré, l&#39;aorte peut être nécessaire de repositionner ou fixé avec des liens supplémentaires. Un joint étanche est important de maintenir une pression adéquate pendant le processus de décellularisation (Figure 2). </li><li> Placer le bécher contenant 4 L 3 L de 0,2% NaN% Trypsin/0.05 EDTA/0.05%3 solution sur plaque d&#39;agitation et le réchauffer à 37 ° C dans la préparation du processus décellularisation. </li></ol> 2. Se rince le tissu <ol><li> Régler la pompe à un débit de 400 ml / min, en veillant à ce que le diamètre de la conduite correcte est sélectionnée. Rincer le cœur avec Eau de type I pour 15-25 min. Comme la pompe est démarrée, le cœur doit gonfler et écouler le sang des ventricules. Une solution fraîche doit être remplacé tous les 5-10 minutes, ou selon les besoins en fonction de la quantité de sang prélevée à partir du cœur. Si le sang n&#39;est pas épanché du cœur, ajustez le tuyau et pinces si nécessaire. </li><li> Arrêter la pompe et de transférer le cœur à un bêcher séparé rempli de solution saline tamponnée au phosphate 2X (PBS). Après que le tuyau est immergé dans la solution, la pompe démarre et augmenter le débit de 700 ml / min. Le cœur doit rester dans la solution pendant 15 min, en changeant la solution toutes les 5 min. Une variation de la pompe solution nécessite d&#39;être arrêté temporairement tandis que les tissus et le tube est déplacéDans le bécher de nouveau. </li><li> Transfert au cœur de type I eau pendant 10 min et augmenter le débit à 750 ml / min. </li></ol> 3. Perfusion décellularisation et Solution <ol><li> Transférer le coeur dans le bécher contenant 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% de NaN3 à 37 ° C. Augmenter la vitesse de la pompe à 1200 ml / min et démarrer la pompe. Utiliser un barreau d&#39;agitation placé au fond du bécher pour faire circuler la solution dans le bécher. Le cœur doit rester dans le 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% de NaN3 solution à 37 ° C pour un total de trois heures. Après 1 h, augmenter la vitesse de la pompe à 1500 ml / min. Après une heure supplémentaire, augmenter la vitesse de la pompe à 1.800 ml / min. Le tissu est soumis à une lente vitesse de perfusion accrue à l&#39;état du tissu et d&#39;éviter la rupture des vaisseaux. Le cœur se gonfle et près du double de la taille lors de cette étape du protocole. Le tissu perd sa couleur naturelle, progressant de l&#39;oreillette vers le sommet tout au long èmee protocole (Figure 3). </li><li> Après chaque perfusion de solution, une étape de rinçage est effectuée deux pour éliminer les débris cellulaires, résidus chimiques, et la lyse des cellules de l&#39;aide. Chaque rinçage comprend un rinçage à 10 min de type I d&#39;eau suivie d&#39;un rinçage avec 10 min une solution de PBS 2X à température ambiante. Chaque lavage consiste en l&#39;élimination de la solution du bécher originale, l&#39;ajout des solutions de rinçage et de circulation du liquide de perfusion dans le bécher contenant le coeur immergé. Après l&#39;0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% de NaN3 solution, l&#39;eau perfuse à 1900 ml / min, puis perfuser 2X PBS à 1950 ml / min. </li><li> Transférer le cœur à une solution de 3% de Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% de NaN3 à la température ambiante. Augmenter la vitesse de la pompe à 2.000 ml / min et la solution perfuse pendant une heure. Enlever la solution du bécher et la remplacer par une nouvelle solution, augmenter la vitesse de la pompe à 2100 ml / min, et perfuser la solution fraîche pendant une heure supplémentaire et demi, ce qui porte la durée totale en3% de Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 à 2,5 heures. </li><li> Rincer le tissu à eau de type I à 2150 ml / min et 2X PBS au 2180 ml / min pendant 10 min à chaque fois. </li><li> Transférer le cœur à une solution de désoxycholate de sodium à 4% à la température ambiante. Augmenter la vitesse de la pompe à 2200 ml / min et la solution perfuse pendant 3 heures. </li><li> Rincer le tissu à eau de type I à X et 2X PBS à 2200 ml / min pendant 15 min à chaque fois, en changeant les solutions après 5-10 min pour chaque solution. Les étapes décrites perfusion peut être réparti sur plusieurs jours en effectuant l&#39;étape consistant à rincer deux fois et stocker le coeur avec un tube attaché pendant une nuit à 4 ° C et immergé dans l&#39;eau de type I. </li><li> Le lendemain, effectuer un rinçage à 5 min à eau de type I à 750 ml / min, suivi d&#39;un rinçage 5 min dans du PBS 1X à 1500 ml / min. Le protocole peut alors être repris à la vitesse d&#39;écoulement décrits dans la solution adéquate. </li></ol> 4. Désinfection et traitement final <ol><li> Transfert au cœur d&#39;un PERAC 0,1%acide étique / solution éthanolique 4% et perfuser une solution de 1,5 heure à 2.200 ml / min. </li><li> Les derniers rinçages pour les tissus sont tous effectués à 2.200 ml / min. Perfuser le tissu avec du PBS 1X pendant 15 min, suivie de deux lavages de 5 min dans de l&#39;eau de type I. Cette série de rinçages est répété une fois de plus afin de compléter la procédure de perfusion solution. </li><li> Mettez la pompe hors tension et retirez le cœur de la solution de vider le coeur. Coupez les attaches de l&#39;aorte, enlever tous les tuyaux, et placez le coeur dans un bécher vide égoutter pendant 1 heure. L&#39;excès de liquide doivent être vidangés périodiquement. Posez le coeur sur un tampon absorbant afin de décharger complètement le cœur (figure 4). </li><li> Après plus de l&#39;eau est éliminée, enregistrer le poids de la matrice extracellulaire cardiaque (C-ECM). Le cœur peut s&#39;attendre à perdre environ 20-25% de son poids initial au cours du processus décellularisation. </li><li> Disséquer les ventricules droit et gauche, ainsi que le septum ventriculaire de l&#39;ADN quantificatiet le traitement histologique dans le but de confirmer décellularisation complet du tissu (figure 5). </li><li> Congeler le C-ECM à -80 ° C pendant au moins 2 heures avant la lyophilisation. </li></ol>

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	<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li><li>Wainwright, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold.">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li></ol>

Dr. Gilbert a siégé au conseil consultatif scientifique ACell, Inc tandis que l&#39;étude a été fait, et est récemment devenu le vice-président de la recherche et du développement. ACell, Inc vend matrice de la vessie et n&#39;a aucun intérêt commercial dans la présente étude.

La présente étude décrit la méthodologie pour décellularisation cohérente et efficace d&#39;un coeur de porc. Le protocole a été une modification à un rapport déjà publié 1, et comprenait une exposition plus longue à l&#39;écoulement et de la pression accrue, ce qui a donné des résultats plus reproductibles. Le tissu résultant décellularisé satisfait à tous les critères publiés pour décellularisation réussie de tissu 2. Changements fréquents de solution ont été réalisée...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pêcheur </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Pêcheur </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Désoxycholate de sodium </td><td> Sigma </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide peracétique </td><td> Pfaltz et Bauer </td><td> P05020 </td><td> 35% N ° CAS 79-21-0 </td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Entraînement de pompe Masterflex </td><td> Cole Parmer </td><td> SI-07524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes Masterflex </td><td> Cole Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> Taille 18 </td></tr><tr><td> Réducteur de fer barbelé </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> Bécher 4L </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

Perfusion basée sur décellularisation organe entier a récemment suscité un intérêt dans le domaine du génie tissulaire comme un moyen de créer des sites spécifiques échafaudages de la matrice extracellulaire, bien que largement en préservant l&#39;architecture d&#39;origine de l&#39;échafaud. À ce jour, cette approche a été utilisée dans une variété de systèmes d&#39;organes, y compris le cœur, les poumons, le foie et 1-5. Décellularisation méthodes précédentes pour tissus sans un réseau facilement accessible vasculaire ont invoqué l&#39;exposition prolongée des tissus à des solutions de détergents, acides ou les traitements enzymatiques comme un moyen d&#39;éliminer les composants cellulaires et nucléaires de l&#39;environnement extracellulaire 6-8. Cependant, l&#39;efficacité de ces méthodes charnière sur la capacité des solutions à imprégner le tissu par diffusion. En revanche, la perfusion des organes à travers le système vasculaire naturel pour effet de réduire la distance de diffusion et de transport facilité de decellularizatides agents dans le tissu et les composants cellulaires sur le tissu. Nous décrivons ici une méthode pour bien decellularize un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde coronaire. Le protocole donné entièrement décellularisé cardiaque matrice extracellulaire (ECM-c) d&#39;échafaudage avec la structure tridimensionnelle du coeur intact. Notre procédé utilisé une série d&#39;enzymes, les détergents, les acides et les produits de rinçage couplé avec hypertoniques et hypotoniques pour aider à la lyse et l&#39;élimination des cellules. Le protocole utilisé une solution de Trypsine pour détacher les cellules de la matrice, suivie par des solutions de Triton X-100 désoxycholate de sodium et d&#39;aider à l&#39;élimination de la matière cellulaire. Le protocole décrit utilise également des vitesses de perfusion de plus de 2 L / min pour des périodes de temps prolongées. La vitesse d&#39;écoulement élevée, associée à des changements souhaités solution transport d&#39;agents dans le tissu sans contamination des débris cellulaires et assurer un rinçage efficace du tissu. La méthode décrite enlevé toutes les matières nucléaires de native porcine tissu cardiaque, la création d&#39;un site spécifique cardiaque ECM échafaudage qui peut être utilisé pour une variété d&#39;applications.

L&#39;effet de décellularisation sur les cœurs de porc entières varie naturellement en raison de différences dans la taille, la pression, et la disposition des navires. Par conséquent, la composition exacte des échafaudages dérivés de la matrice extracellulaire ne sera pas la même chose de cœur à cœur. L&#39;achèvement du protocole décrit donnera un cœur qui apparaît en blanc ou translucide, indiquant la perte de matériel cellulaire. Cependant, il est largement admis qu&#39;un tissu peut être considér...

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Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Une méthode pour rapidement et complètement éliminer les composants cellulaires à partir d&#39;un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde est décrite. Cette méthode permet d&#39;obtenir un site spécifique de la matrice extracellulaire cardiaque échafaudage qui a le potentiel pour être utilisé dans de multiples applications cliniques.

Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.7K vues.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. Une méthode pour rapidement et complètement éliminer les composants cellulaires à partir d'un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde est décrite. Cette méthode permet d'obtenir un site spécifique de la matrice extracellulaire cardiaque échafaudage qui a le potentiel pour être utilisé dans de multiples applications cliniques.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Décellularisation et Recellularization des foies entiers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Procédure pour Décellularisation du Rat Livers dans une perfusion périphérique oscillant de pression

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

DÉCELLULARISATION du cœur humain à l’intérieur d’une poche sous pression dans une Orientation inversée

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Isolement et DÉCELLULARISATION d’un pancréas entier porcin

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

Mesure in vivo résolue dans le temps de la dynamique des neuropeptides par immunosonde capacitive dans le cœur porcin

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Acquisition et perfusion-décellularisation de lambeaux vascularisés porcins dans un bioréacteur de perfusion personnalisé

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Obtention et décellularisation de membres postérieurs de rat à l’aide d’un bioréacteur ex vivo basé sur la perfusion pour l’allotransplantation composite vascularisée

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Évaluation des propriétés hydrodynamiques des valves aortiques porcines montées

An Ex Vivo Porcine Model for Hydrodynamic Testing of Experimental Aortic Valve Procedures and Novel Medical Devices

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a method for mounting a porcine aortic valve in a pulse duplicator to evaluate its hydrodynamic properties. These properties can then be evaluated before and after the procedure under investigation is performed and/or the investigative medical device is applied. Securing the inflow segment presents some difficulty owing to the lack of circumferential myocardium in the left ventricular outflow tract. This method addresses that issue by securing the inflow segment using the anterior leaflet of the mitral valve and then suturing the left ventricular free wall around the inflow fixture. The outflow segment is secured simply by inserting the fixture into an incision in the superior aspect of the aortic arch. We found that specimens had significantly different hydrodynamic properties before and after tissue fixation. This finding induced us to use fresh specimens in our testing and should be considered when using this method. In our work, we used this method to test novel intracardiac patch materials for use in the valvular position by performing an aortic valve neocuspidization procedure (Ozaki procedure) on the mounted porcine aortic valves. These valves were tested before and after the procedure to assess the change in hydrodynamic properties in comparison to the native valve. Herein, we report a platform for hydrodynamic testing of experimental aortic valve procedures that enables comparison with the native valve and between different devices and techniques used for the procedure under investigation.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser les tests de procédures cardiaques avant de se lancer dans des études sur les grands animaux 

We present a method for mounting a porcine aortic valve on a pulse duplicator to test its hydrodynamic properties. This method can be used to determine the change in hydrodynamics after the application of an experimental procedure or novel medical device prior to use in a large animal model.

Un modèle porcin ex vivo pour les essais hydrodynamiques de procédures expérimentales de valvules aortiques et de nouveaux dispositifs médicaux

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a ...