Ce travail a été effectué en partie au Centre pour les systèmes nanométriques (SNC), un membre de la National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), qui est soutenu par la National Science Foundation sous NSF prix pas. ECS-0335765. SNC fait partie de l&#39;Université de Harvard.

Le protocole de générer aligné tissu fonctionnel du myocarde peut être divisé en trois grandes parties. La fabrication du maître à micro en utilisant des techniques de lithographie douce n&#39;est pas considéré comme faisant partie du protocole suivant, mais peut être basé sur la méthode établie 6. 1. Impression par microcontact de la fibronectine sur PDMS Substrats <ol><li> Mélanger Sylgard 184 (Dow Corning) en élastomère PDMS à une base de 10:1 à guérir rapport agent et dégazer l&#39;assemblage en utilisant un dessiccateur pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Durcir PDMS contre un maître précédemment fabriqué avec 20 um de large et 2 um de hauteur des crêtes séparées par un espacement 20 um pour soit 2 jours à température ambiante ou 4 heures à 65 ° C pour obtenir microtexturée timbres PDMS. </li></ol> * Durcissement dans un dessiccateur est fortement recommandé d&#39;éliminer les bulles d&#39;air. <ol start="3"><li> Spin couche de PDMS sur des lamelles de verre (par exemple,22x22 mm) à 5000 rpm pendant 2 min à l&#39;aide d&#39;une tournette Headway pour produire mince et même PDMS substrats de 15 um d&#39;épaisseur. </li><li> Nettoyez timbres avec 70% d&#39;éthanol pour enlever la poussière et les particules de saleté. Laissez-les sécher à l&#39;air. </li></ol> Timbres * peut être utilisé plusieurs fois, cependant, le renouvellement de timbres PDMS sur une base régulière est recommandée en raison d&#39;une abrasion de la surface au fil du temps. <ol start="5"><li> Timbres placer dans un nettoyeur de SPI Plasma Plasma II-Prep et le processus pendant 1 min à 275 mTorr à rendre les surfaces de PDMS hydrophile. </li></ol> * Le traitement plasma d&#39;oxygène doivent être surveillés. Des temps de traitement plus longs peuvent entraîner des fissures de l&#39;élastomère. <ol start="6"><li> Stériliser timbres avec de l&#39;éthanol à 70% pendant 1 min. Sécher rapidement à l&#39;air comprimé. </li></ol> * D&#39;autres mesures doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité. <ol start="7"><li> Couvrir les surfaces avec timbre Fsolution ibronectin (50 pg / ml dans ddH 2 O). Laissez adsorber au moins 10 min. </li><li> Secouez solution de fibronectine de timbres et sèchent rapidement à l&#39;air comprimé. </li><li> Établir un contact conforme entre les timbres et PDMS substrats pendant 2 minutes et appuyez fermement. </li><li> Rincer à micro substrats avec ddH 2 O. Rangez-les dans ddH 2 O pour un maximum de 2 semaines à 4 ° C sauf initialement utilisé. Magasin de timbres en PDMS ddH 2 O. </li></ol> 2. Entretien des doubles transgéniques lignées cellulaires embryonnaires souches Tout d&#39;abord, préparer les supports suivants pour la culture de cellules de souris ES: Embryonnaires de souris fibroblastes (MEF)-Medium: Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de sérum foetal bovin (FBS) ES cellulaire ou la différenciation de classe, 1% de pénicilline-streptomycine (P / S) Les cellules souches embryonnaires (CSE)-Medium: DMEM, 15% de FBS cellule ES de qualité,1% non-acides aminés essentiels (AANE), 0,5% P / S, 0,2% facteur inhibiteur de leucémie (LIF), 0,0007% de 2-mercaptoéthanol (2-ME) <ol><li> Manteau de plaques de 6 puits avec 0,1% stérile gélatine dans ddH 2 O et laissez-le adsorber 15 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter MEF à partir d&#39;un aliquot décongelé à 50 ml de PBS dans un tube conique et les centrifuger à 1000 tours par minute pendant 5 minutes. Resuspendre MEF MEF en moyen terme. </li><li> Après adsorption, aspirer l&#39;excès de gélatine et ajouter FAE dans les puits. Laissez FAE 1 jour à fixer. </li></ol> * Une aliquote de 10 millions FAE suffit pour 3 plaques de 6 puits. <ol start="4"><li> Lorsque MEF ont attaché, ajouter des cellules ES à partir d&#39;un aliquot décongelé à 50 ml de PBS dans un tube conique et les centrifuger à 1000 tours par minute pendant 5 minutes. Remettre les cellules ES dans l&#39;ESC-support et les ajouter dans les puits contenant les MEF. Culture de cellules ES dans l&#39;ESC-moyen jusqu&#39;à ce que la confluence est atteinte. </li></ol> * Une fois que les cellules ES ont atteint la confluence, repiquage est requIRED pour éviter la prolifération et de maintenir des colonies de cellules ES. <ol start="5"><li> Préparer les cellules ES pour repiquage. Aspirer ESC-moyen et laver une fois avec du PBS stérile. </li><li> Aspirer le PBS et ajouter 500 ul de trypsine. Processus de 3,5 min à 37 ° C. </li><li> Pipeter la solution de Trypsine monter et descendre plusieurs fois pour briser les colonies de cellules ES et le neutraliser avec 500 pi de l&#39;ESC et moyen terme. </li><li> Les cellules ES passage selon le rapport désiré, par exemple le transfert de 33 ul à l&#39;autre ainsi préparée au préalable avec MEFs de passage 1/30. Maintenir les cellules ES de l&#39;ESC-moyen. </li></ol> * Un taux de passage de 1/30 permet aux cellules ES pour atteindre la confluence dans les 3 jours. Les cellules ES de passage en fonction de votre horaire de différenciation in vitro. 3. Différenciation in vitro de doubles transgéniques lignées cellulaires embryonnaires souches et d&#39;isolement et d&#39;ensemencement des progéniteurs cardiaques Tout d&#39;abord, préparer le followimédias ng requis pour la différenciation in vitro de cellules ES: Adaptation-: Moyen Iscove modifié de Dulbecco (IMDM), 15% de FBS ES cellules de qualité, de 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% FRV, 0,0007% de 2-ME Différenciation-Medium: IMDM, 15% de FBS différenciation de qualité. 1%, 0,5% NEAA P / S, 0,35% d&#39;acide ascorbique 0,1 M, 0,0007% de 2-ME <ol><li> Lancer la différenciation in vitro lorsque les cellules ES ont atteint la confluence. Manteau de 10 plats de culture stérile cm avec 0,1% de gélatine dans ddH 2 O et laissez-le adsorber 15 min à 37 ° C. </li></ol> * Soyez conscient de la durée du processus de différenciation in vitro. Il faut 8 jours jusqu&#39;à progéniteurs cardiaques peuvent être isolés. Planifiez vos expériences en conséquence. <ol start="2"><li> Récolte des cellules ES comme avant. Après adsorption, aspirer l&#39;excès de gélatine et ajouter qu&#39;environ 1/3-1/2 de la suspension de cellules ES à la culture préparésplats contenant Adaptation-support. Cellules en culture pendant 2 jours. </li></ol> * Choisissez la quantité de cellules ES pour l&#39;adaptation en fonction de vos expériences. <ol start="3"><li> Récolte adaptée cellules ES dans un tube conique de 50 ml contenant du PBS en utilisant 1. 5 ml de trypsine. Centrifuger les cellules ES dissociées à 1000 rpm pendant 5 min et les remettre en suspension dans la différenciation et moyen terme. </li><li> Faire corps embryoïdes (EBS) d&#39;environ 1.000 cellules par 10 pl à goutte 15 cm boîtes de culture à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. Inverser les plaques et culture suspendue EBS gouttelettes pendant 2,5 jours à 37 ° C. </li><li> Au bout de 2,5 jours, piscine EB de 6-8 cm 15 plats culture en un à l&#39;aide de différenciation à moyen et à les cultiver pendant encore 3,5 jours à 37 ° C. </li><li> Au bout de 3,5 jours, EB recueillir dans un tube de 50 ml conique et laissez-les couler au fond pendant environ 5 min. Aspirer le surnageant et laver EB avec du PBS stérile. Laissez-EB replonger vers le bas pour approximately 5 min. </li><li> EB dissocier en les traitant avec 2. 5 ml de trypsine pendant 2 min dans un bain d&#39;eau à 37 ° C en secouant le tube doucement. Ensuite, ajoutez 2. 5 ml de PBS stérile à la solution de trypsine et pipeter de haut en bas avec une pipette de 10 ml sérologique environ 8-10 fois pour briser amas de cellules. Neutraliser la trypsine avec 10 ml de tampon FACS contenant 7,5% de FBS cellules ES ou la différenciation de qualité et de 0,01% dans du PBS DAPI. </li><li> Centrifuger dissocié EB à 1000 rpm pendant 5 min et les remettre en suspension dans environ 1 ml de tampon FACS. Introduire à la pipette de haut en bas avec une pipette de 1 ml environ 8-10 fois pour briser amas de cellules. </li></ol> * Ajouter tampon FACS selon le montant estimé de dissocier EB. Des cellules trop fortement concentrées peuvent obstruer pendant FACS et trop faible nombre de cellules concentrées peut prolonger le temps de FACS inutilement. <ol start="9"><li> Transfert des cellules à un stérile à fond rond de tube avec un tamis cellulaire 35 um pour obtenirune suspension de cellules isolées. </li><li> Cellules ES différenciées Trier utilisant un cytomètre de flux FACSAria et obtenir purifiée populations de CVP. </li></ol> * Nous avons développé une stratégie de porte multi-étapes pour isoler les cellules hautement purifiées de couleur. En bref, nous porte d&#39;abord sur l&#39;amplitude Forward Scatter (FSC-A) et d&#39;amplitude Side Scatter (SSC-A) (figure 1A). Cela nous permet de séparer les cellules entières de débris cellulaires. Nous avons ensuite porte sur FSC-A et Forward Scatter-Largeur (FSC-W) (figure 1B). Cela nous permet d&#39;isoler les cellules maillots de doublets et autres agrégats cellulaires. Nous avons ensuite porte sur SSC-A et Side Scatter-Largeur (SSC-W) (figure 1C). Cela augmente la pureté de maillots de cellules. Nous avons ensuite porte sur la coloration DAPI pour isoler des cellules viables (DAPI-négatif) à partir de cellules non viables (figure 1D). On porte ensuite sur Phycoeryhthrin amplitude (PE-A) et PE-cyanine 7 amplitude (PE-Cy7-A) afin d&#39;obtenir vrai positif rouge (R + </sup&gt;) et vrais négatifs rouge (R - cellules) et d&#39;exclure autofluorescentes rouge cellules négatives (figure 1E). R + et R - cellules sont ensuite fermée séparément sur ​​Amplitude isothiocyanate de fluorescéine (FITC-A) et PE-A pour trier vrais positifs vert (G +) et négatifs vrai vert (G -) des cellules au sein de ces populations (figure 1F + 1G). Cela se traduit par des populations de cellules 4 de la manière suivante: R + G +, R + G -, R - G + et R - G - (figure 1H). <ol start="11"><li> Passiver à micro-substrats avec 1% de Pluronic F-127 dans ddH 2 O pendant 10 min. Ensuite, lavez-les avec 3x PBS stérile. </li></ol> * Pluronic F-127 est un agent tensio-actif qui bloque l&#39;adhérence cellulaire. Il prend en charge le confinement de l&#39;adhésion cellulaire à la surface à micro. <ol start="12"><li> Fixez les joints PDMS autour de la région à motifset appuyez fermement. Puis CVP semences, sur des substrats à micro fibronectine. </li></ol>

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Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Dans ce protocole, nous avons présenté une méthode pour isoler les populations purifiées de progéniteurs cardiogénique et les graines sur des substrats de fibronectine à micro ce qui leur permet d&#39;aligner et de prendre une forme de tige myocytes cardiaques comparables. Organisation cellulaire normale est essentielle pour la fonction de tissus normaux 8,10, en particulier pour le tissu myocardique. Les myocytes cardiaques ont été montré pour élaborer de meilleures propriétés mécaniques et <su...

Malgré les progrès récents dans le traitement médical, l&#39;insuffisance cardiaque avancée reste une cause majeure de mortalité et de morbidité dans le monde développé. Le syndrome clinique résulte d&#39;une perte de tissu myocardique fonctionnelle et par la suite une incapacité du cœur à défaut de répondre aux besoins métaboliques des personnes concernées. Puisque le cœur a une capacité limitée de régénération, la transplantation cardiaque autologue est le seul traitement actuel cliniquement acceptée directement destinées à reconstituer le tissu cardiaque perdu fonctionnelle. Inconvénients majeurs de la transplantation cardiaque, y compris un nombre limité de coeur de donneur et de la nécessité à long terme un traitement immunosuppresseur, obstacle à l&#39;utilisation très répandue de cette thérapie. En conséquence, le traitement médical a été la pierre angulaire du traitement pour les patients souffrant de maladies cardiaques. Un défi majeur dans le développement de médicaments est l&#39;identification des dosages cellulaires qui récapitulent fidèlement la physiologie normale et pathologique du myocarde in vitro. <html> La récente convergence de la biologie des cellules souches et génie tissulaire technologie soulève de nouvelles avenues prometteuses pour la régénération cardiaque. Fonctionnelle génératrice tissu myocardique d&#39;une ressource renouvelable spécifique au patient source serait une avancée majeure dans le domaine. Cela permettrait le développement de maladies spécifiques essais cellulaires pour le développement de médicaments et de découverte et jetterait les bases pour la médecine régénérative cardiaque. Homme souches embryonnaires (ES) et des cellules, de manière plus significative, l&#39;homme souches pluripotentes induites (iPS) représentent un potentiel renouvelable spécifique au patient source de cellules souches ventriculaires et les myocytes ventriculaires adultes. La combinaison de la biologie des cellules souches et stratégies de génie tissulaire répond à ce problème en générant le tissu cardiaque fonctionnel in vitro qui peut être utilisé dans le développement de tests cellulaires pour la découverte de médicaments cardiaques ou des approches régénératives pour le traitement de l&#39;insuffisance cardiaque avancée. _content &quot;&gt; Un défi majeur dans la régénération cardiaque a été l&#39;identification d&#39;un type cellulaire optimale. Un large éventail de cellules ont été étudiés 1, mais à ce jour, bien que différents précurseurs multipotentes cardiogéniques provenant de diverses sources ont été découverts, l&#39;identification d&#39;une cellule source qui répond aux besoins essentiels tels que l&#39;engagement au sort cellule myogénique, le maintien de la capacité de se développer in vivo ou in vitro et la composition d&#39;un tissu fonctionnel du myocarde s&#39;est avéré être un problème central 2. Nous avons déjà décrit un système de double transgénique murin qui permet l&#39;isolement de populations hautement purifiée de progéniteurs engagés ventriculaire (PVC) à partir de cellules souches embryonnaires de différentiation in vitro. Nous avons produit une nouvelle souris double transgénique qui exprime la protéine fluorescente rouge DsRed sous le contrôle d&#39;un amplificateur Isl1 dépendant du gène MEF2C et la protéine fluorescente verte améliorée sous le contrôle d&#39;le cardio-spécifique Nkx2.5 amplificateur. Sur la base de ce système bicolore rapporteur fluorescent, premier et deuxième progéniteurs cardiaques sur le terrain du développement des cellules ES peuvent être isolés au moyen de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en fonction de leur expression de gènes MEF2C et Nkx2.5. CVP ressemblent myocytes cardiaques en fonction des profils d&#39;expression de marqueurs myocardiques et les qualités structurelles et fonctionnelles 3, ce qui offre de grandes promesses pour des fins de régénération des tissus cardiaques. Bien qu&#39;il y ait eu de nombreuses avancées dans le domaine de l&#39;ingénierie tissulaire, imitant natif architecture cellulaire reste un défi majeur. Les méthodes conventionnelles pour relever ce défi incluent ensemencement échafaudages biologiques ou synthétiques avec des cellules in vitro. En raison d&#39;un certain nombre d&#39;inconvénients d&#39;échafaudages, y compris la dégradation rapide, limitée stabilité physique et mécanique et faible densité cellulaire 1,4,5, nous avons tenté de concevoir un échafaudage moins de tissu. Altien que les cellules cardiaques peuvent modifier leur micro-environnement local par la sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire, ils ont une capacité plus limitée à s&#39;organiser pour tige en forme de myocytes cardiaques en l&#39;absence de signaux extracellulaires. Ainsi, un modèle qui fournit les cellules appropriées repères spatiaux et biologiques pour composer fonctionnelle tissu myocardique est nécessaire. L&#39;impression par microcontact répond à ce défi en proposant une technique simple et peu coûteux pour contrôler avec précision la forme des cellules, l&#39;organisation et la fonction 6-8, qui sont tous essentiels pour la production d&#39;aligner le tissu myocardique fonctionnelle. Il comprend l&#39;utilisation de microtexturée polydiméthylsiloxane (PDMS) avec des tailles de fonction Stamps allant jusqu&#39;à 2 microns 9 qui permettent le dépôt de protéines de la matrice extracellulaire sur des substrats PDMS selon des schémas précis et donc d&#39;affecter l&#39;adhésion cellulaire spatialement. Ici, nous proposons de combiner la technologie bio-ingénierie tissulaire avec tige cell la biologie de générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde. En conséquence, nous avons ici de démontrer notre approche récemment publiée dans les cas suivants: (1) la génération de surfaces de PDMS à micro-protéines substrats par impression par microcontact pour la génération d&#39;un modèle aligné tissu myocardique, (2) l&#39;isolement des progéniteurs cardiaques hautement purifiée à partir de différenciation des cellules ES in vitro, et (3) la combinaison de ces deux techniques pour générer aligné fonctionnelle du tissu myocardique.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de produit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Acide L-ascorbique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> Préparer une solution 0,1 M dans ddH 2 O </td></tr><tr><td> Dessiccateur à vide de 10 pouces </td><td> Nouvelle-Tech International, Inc </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole, dihydrochlorure (DAPI) </td><td> Life Technologies </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle modifié par Dulbecco moyen </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Cytomètre de flux FACSAria II </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine SerumES-classe de cellules </td><td> Gémeaux Bioproduits </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum différenciation de qualité </td><td> Gémeaux Bioproduits </td><td> 100-500 </td><td></td></tr><tr><td> La fibronectine de plasma bovin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F4759 </td><td> Solubiliser à 1 mg / ml dans ddH 2 O </td></tr><tr><td> Fisherfinest Prime couvercle en verre 22x22mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 à 548-B </td><td></td></tr><tr><td> Gélatine de peau de porc </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> Préparer une solution à 0,1% dans le trou DDH 2 O </td></tr><tr><td> Tournette progrès </td><td> Headway Research, Inc </td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modifié par Iscove à moyen </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td> Facteur inhibiteur de leucémie </td><td> SoiPréparés à partir de lignées cellulaires sécrétant des FRV </td><td></td><td> Préparer la solution mère 500x </td></tr><tr><td> MEM non-acides aminés essentiels </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblastes embryonnaires de souris </td><td> Récoltée à partir d&#39;embryons de souris 12-15 jours </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2443 </td><td> Préparer une solution à 1% dans ddH 2 O </td></tr><tr><td> Tube à fond rond de 35 um tamis cellulaire </td><td> BD Biosciences </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner </td><td> Fournitures SPI </td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard184 Kit élastomère silicone </td><td> Dow Corning </td><td> 184 SIL ELAST KIT 0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuomètre </td><td> Fournitures SPI </td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing

Insuffisance cardiaque avancée représente un important défi clinique insatisfait, résultant de la perte d&#39;viables et / ou entièrement fonctionnel des cellules musculaires cardiaques. Malgré un traitement médicamenteux optimal, l&#39;insuffisance cardiaque représente une cause majeure de mortalité et de morbidité dans le monde développé. Un défi majeur dans le développement de médicaments est l&#39;identification des dosages cellulaires qui précise récapitulent normal et pathologique du myocarde physiologie humaine in vitro. De même, les défis majeurs de la biologie régénérative cardiaque tournent autour de l&#39;identification et l&#39;isolement des patients spécifiques progéniteurs cardiaques en quantités cliniquement pertinentes. Ces cellules doivent ensuite être assemblés en tissu fonctionnel qui ressemble à l&#39;architecture du tissu cardiaque native impression par microcontact. Permet la création de formes précises de protéines qui ressemblent à micro-organisation structurelle du cœur, fournissant ainsi des indices géométriques pour contrôler l&#39;adhésion cellulaire dans l&#39;espace. Présentesnous décrivons notre approche pour l&#39;isolement de cellules myocardiques hautement purifiée à partir de cellules souches pluripotentes de différenciation in vitro, la génération de surfaces de croissance des cellules à micro avec protéines de matrice extracellulaire, et l&#39;ensemble des dérivés de cellules souches cellules du muscle cardiaque dans le tissu myocardique anisotrope.

FACS-purification de cellules in vitro ES différenciées révélé quatre populations distinctes de progéniteurs (figure 1). La présence de fibronectine à micro a été confirmée par immunofluorescence qui fait preuve d&#39;un transfert complet des lignes continues fibronectine (figure 2). Placage de FACS-isolées progéniteurs sur micropatterns fibronectine abouti à l&#39;alignement de la R + G + et une partie de la R - G +<...

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Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

La génération de tissu myocardique alignés est une exigence essentielle pour adapter les progrès récents de la biologie des cellules souches à des fins utiles en clinique. Ici nous décrivons une approche impression par microcontact pour le contrôle précis de la forme et la fonction cellulaire. Utilisation populations hautement purifiées de cellules souches embryonnaires dérivées progéniteurs cardiaques, nous avons ensuite générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde.

Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l&#39;impression par microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K vues.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. La génération de tissu myocardique alignés est une exigence essentielle pour adapter les progrès récents de la biologie des cellules souches à des fins utiles en clinique. Ici nous décrivons une approche impression par microcontact pour le contrôle précis de la forme et la fonction cellulaire. Utilisation populations hautement purifiées de cellules souches embryonnaires dérivées progéniteurs cardiaques, nous avons ensuite générer anisotrope tissu fonctionne...

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

La fabrication des matériaux injectables d&#39;origine biologique pour l&#39;ingénierie tissulaire du myocarde

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Recherche

Bio-ingénierie

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Fabrication de tissus de cartilage humain en utilisant trois dimensions jet d&#39;encre Technologie d&#39;impression

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Fabrication de substrats de culture complexe robotisée microcontact impression (R-uCP) et substitution nucléophile séquentielle

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Génération et greffage des navires par ingénierie tissulaire dans un modèle de souris

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Génération d&#39;une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Échafaudages d'impression de noyau/coquille pour l'ingénierie tissulaire des structures tubulaires

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink extracellulaire de matrice de tissu pancréatique-dérivé pour l'impression 3D Cell-Laden Pancréatique Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the context of liver diseases, 3-dimensional (3D) models based on cholangiocytes have emerged such as cysts, spheroids, or tube-like structures to mimic tissue topology for organogenesis, disease modeling, and drug screening studies. These structures have been mainly obtained by embedding cholangiocytes in a hydrogel. The main purpose was to study self-organization by addressing epithelial polarity, functional, and morphological properties. However, very few studies focus on cyst formation efficiency. When this is the case, the efficiency is often quantified from images of a single plane. Functional assays and structural analysis are performed without representing the potential heterogeneity of cyst distribution arising from hydrogel polymerization heterogeneities and side effects. Therefore, the quantitative analysis, when done, cannot be used for comparison from one article to another. Moreover, this methodology does not allow comparisons of 3D growth potential of different matrices and cell types. Additionally, there is no mention of the experimental troubleshooting for immunostaining cysts. In this article, we provide a reliable and universal method to show that the initial cell distribution is related to the heterogeneous vertical distribution of cyst formation. Cholangiocyte cells embedded in hydrogel are followed with Z-stacks analysis along the hydrogel depth over the time course of 10 days. With this method, a robust kinetics of cyst formation efficiency and growth is obtained. We also present methods to evaluate cyst polarity and secretory function. Finally, additional tips for optimizing immunostaining protocols are provided in order to limit cyst collapse for imaging. This approach can be applied to other 3D cell culture studies, thus opening the possibilities to compare one system to another.

Three-dimensional (3D) cellular systems are relevant models for investigating organogenesis. A hydrogel-based method for biliary cysts production and their characterization is proposed. This protocol unravels the barriers of 3D characterization, with a straightforward and reliable method to assess cyst formation efficiency, sizes, and to test their functionality.

Génération et caractérisation quantitative des kystes épithéliales biliaires fonctionnels et polarisés

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...