Nous sommes reconnaissants à la discussion, l&#39;orientation et le soutien de MM. Michael Andreeff MD, PhD., Et Jared Burks doctorat. du MD Anderson cytométrie en flux et cellulaire Imaging Core Facility. Ce travail a été financé en partie par des subventions de l&#39;Institut national du cancer (RC1-CA146381, CA-083 639, R01NS06994, CA116199 et CA109451 pour FCM. ELS est également soutenu par le Département de l&#39;Armée de Défense (de BC083397).

Syngénique murin de moelle osseuse (GMO), tel qu&#39;approuvé par les protocoles institutionnels IACUC (Note: Le succès de ce protocole nécessite l&#39;utilisation de n&#39;importe quel type de cellule marquée (s) comme cible pour l&#39;analyse multispectrale, et de faciliter l&#39;analyse en aval, on peut exploiter tout génétique ou l&#39;étiquetage cellulaire stable. Nous suggérons que n&#39;importe quelle cellule, tissu ou organe à-être-peut être appliquée à un modèle de transplantation et la greffe peut contenir autant de populations marquées uniques que la recherche jugera utile. outre, multi-étiquetés systèmes cellulaires , tels que ceux trouvés dans les souris transgéniques contenant lignée multiple restreinte marquées par fluorescence populations peuvent être conçus pour éliminer les complications de greffe pour l&#39;étude de certains états pathologiques. <ol><li> Irradier Lethally souris receveuses BMT avec une seule dose de 9,5 Gy quatre heures avant la reconstitution avec donneur de moelle osseuse. (Bénéficiaires BMT GFP doivent être 6-10 semaines d&#39;âge). </li><li> Mouiller la peau de souris avec 70% d&#39;éthanol avant écrêtage et éplucher pour exposer les membres postérieurs avec des ciseaux chirurgicaux stériles. Retirer la jambe entière, y compris la crête iliaque de l&#39;articulation sacro-iliaque. Jeter le pied en coupant juste au-dessus de la cheville, puis retirez soigneusement tous les muscles, les ligaments et les tissus en excès de l&#39;os. Rincer la moelle du tibia, péroné et la crête iliaque avec une aiguille 23 G en utilisant 2% de FBS dans du PBS stérile (PBS-2). (DP donateurs BMT doivent être sacrifiés selon les normes institutionnelles.) </li><li> Slice et doucement écraser l&#39;os restant en fragments à l&#39;aide d&#39;un scalpel et pince puis placez dans 50 ml tube conique avec 3 pg / ml de collagénase I pendant 1 heure à 37 ° C à 300 tpm. </li><li> Terminez le tube avec du PBS-2 et recueillir le surnageant dans un nouveau tube et combiner avec des cellules vidées. Isoler à 250rpm pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Remettre les cellules en PBS-2 et filtrer à travers 40 nm filtre cellulaire. À ce stade, les cellules peuvent être étiquetés pour fluoresct tri cellulaire activé (FACS) si l&#39;on souhaite manipuler des populations spécifiques pour la greffe de moelle osseuse. </li><li> Reprendre 2 x 10 6 cellules par 100 pi de PBS, par la souris. Utilisez 29 aiguille G à injecter par voie systémique dans les souris receveuses GFP irradiés par la queue ou rétro-orbitaire veine conique côté-up. Injecter une souris avec 100 ul de PBS seulement que le contrôle de la prise de greffe. Utiliser une lampe chauffante pour dilater les vaisseaux avant l&#39;injection et en utilisant un dispositif de retenue pour l&#39;injection dans la veine caudale lors de l&#39;injection. Avoir une gaze stérile disponible à appliquer une légère pression sur l&#39;injection queue de poste. </li><li> Trois semaines après la greffe de moelle osseuse, sang de recueillir rétro-orbitale et d&#39;analyser par cytométrie en flux pour confirmer la présence de cellules circulantes GFP et l&#39;absence de cellules de la DP circulation. La souris de contrôle sont morts à ce stade. </li></ol> 2. La prise de greffe tumorale Selon institutionnels Directives IACUC <ol><li> ID8 croître des cellules tumorales murines ovariens in vitro avant l&#39;injection in vivo (1 x 10 6 de caunes par souris). Jour de l&#39;injection, traitement à la trypsine, laver avec du PBS et remettre en suspension dans du PBS à 1 x 10 6 cellules par 100 pi. </li><li> Injecter des cellules tumorales dans la cavité intaperitoneal de la souris, l&#39;aiguille doit être en biseau côté-up. Stériliser vue d&#39;injection avec 70% d&#39;éthanol. Injecter dans le coin inférieur gauche ou le quadrant inférieur droit de l&#39;abdomen (crânienne et un peu en dedans de l&#39;ensemble inférieur de mamelons abdominaux de souris femelle), éviter de heurter les organes. Retenez la souris en saisissant par la nuque et tenant la queue avec le petit doigt ou l&#39;annulaire. Les souris peuvent être anesthésiés avec de l&#39;isoflurane pour cette procédure. </li><li> Sacrifier la souris lorsque des signes de prise de greffe tumorale, telle qu&#39;une légère ballonnements abdominaux, sont évidentes. Cela se produira plus de 4-12 semaines. </li><li> tumeurs d&#39;accise de cavité IP. Tumeurs dans la cavité ressemblera nodules blancs sur et autour de la surface des organes. Avec un scalpel, enlever les tumeurs et les placer dans un tube / pot de formol à 10% pendant 24 heures fixation. P histologiqueréparation peut être sous-traité à cœur pathologie / d&#39;histologie si les réactifs et les matériaux ne sont pas disponibles pour inclusion dans la paraffine et la préparation des lames. Section tissu dans 5-8 um tranches sur des lames de verre pour les procédures de coloration suivants. </li></ol> 3. Multi-paramètre immunofluorescence <ol><li> Préparer des lames simples de contrôle de couleur pour chaque sonde fluorescente utilisée dans l&#39;expérience. Dans ce scénario, on utilise quatre couleurs. Par conséquent, quatre diapositives pour chaque couleur ainsi que d&#39;une diapositive pour le contrôle du bruit de fond et enfin une lame pour la coloration de combinaison complète. (Nombre de diapositives = 6) Toutes les lames sont traitées côte à côte d&#39;une manière identique à minimiser la variation expérimentale. </li><li> Cuire des sections de paraffine à 56 ° C pendant 1 heure. </li><li> Laver les lames 3x 10 min dans le xylène. </li><li> Laver 2x 5 min 100% d&#39;éthanol. </li><li> Laver 1x 3 min 95% d&#39;éthanol </li><li> Laver 1x 2 min90% d&#39;éthanol. </li><li> Laver 1x 2 min70% d&#39;éthanol. </li><li&gt; Laver 1x 2 min dans de l&#39;eau. Immerger lentement le support de coloration dans et hors de l&#39;eau de 10x. </li><li> Lors de la dernière série de lavage, pré-ébullition tampon de citrate de sodium pendant 2 minutes (micro-ondes en haut). (Peut remplacer par du tampon tris-EDTA en fonction des anticorps utilisés) </li><li> Faire bouillir les diapositives pendant 20 min dans le citrate de sodium tampon (micro-ondes sur 10% de la puissance ou dans une cocotte-minute). Si le tampon à ébullition, éteindre micro-ondes et laisser reposer. </li><li> Retirer de la source de chaleur et laisser les lames reposent pendant 30 min dans le tampon de citrate de sodium à refroidir. </li><li> Rincer les lames dans de l&#39;eau pendant 5 min. </li><li> Mark autour des sections tumorales ayant Pap Pen et mis BSA 2% / 1% de FBS acide maléique tampon de blocage pendant 1 heure. Préparer les lames individuellement pour ne pas les laisser sécher pendant cette étape. </li><li> Préparer des anticorps primaires à une dilution optimale dans un tampon de blocage. (Si les anticorps utilisés sont tous des espèces différentes (ou chaîne variation IgG-ex: IgG1 IgG2a vs de même espèce), ils peuvent être utilisés en combinaison pendant quepériode d&#39;incubation Ingle. Si les espèces d&#39;anticorps se chevauchent, alors les incubations doivent être effectuées séquentiellement pour minimiser anticorps contre-réaction.) </li><li> À ce stade, laisser deux lames avec un tampon de blocage seulement. Ces deux diapositives servir de témoin sans tache et le contrôle de colorant nucléaire. Les autres contrôles simples de couleur seront incubées avec des anticorps primaires individuels. Seul le coulisseau d&#39;analyse aura une combinaison d&#39;anticorps primaires. </li><li> Incuber les lames avec l&#39;anticorps primaire dans une boîte de la chambre de l&#39;humidité sur un agitateur à rotation lente à 4 ° la nuit (~ 16-20 h) (Remarque: lorsque vous travaillez avec 4 + fluorophores, coloration séquentielle ou une conjugaison directe peut être nécessaire de réduire anticorps contre-réaction . dans ces conditions se répètent jusqu&#39;à ce que toutes les étapes 1.16 à 1.21 anticorps sont appliqués sur les diapositives.) </li><li> Laver les lames pendant 10 minutes dans du PBST (2x) doucement sur agitateur </li><li> Bien laver va, préparer AlexaFluor 488, 594 et 647 Anticorps secondaires pour une dilution finalede 1:1000 dans du tampon de blocage. (Assurez-vous que ces anticorps et dilutions sont conservés à 4 ° C et à l&#39;obscurité à tout moment afin de préserver la fluorescence dans des lots et au fil du temps.) </li><li> Sur les lames de contrôle de couleur simples, placez dilutions AlexaFluor simples correspondant aux espèces de l&#39;anticorps primaire utilisé. Tous les anticorps secondaires seront placés sur la diapositive d&#39;analyse. Les lames de contrôle colorées et non colorées le nucléaire restera avec un tampon bloquant tout au long de cette étape. </li><li> Incuber dans une boîte de la chambre de l&#39;humidité (recouverte de papier d&#39;aluminium pour éviter exposition à la lumière) sur lent agitateur rotatif à température ambiante pendant 2 h. </li><li> Laver les lames pendant 5 min en PBS (2x) doucement sur un agitateur. Couvrir de papier d&#39;aluminium pour le protéger de la lumière. </li><li> Ajouter DAPI (1:10000) pendant 1 min à la lame de DAPI seule et la lame d&#39;analyse. Couvrir de papier d&#39;aluminium pour le protéger de la lumière. Les autres lames peuvent être laissés dans les récipients couverts de lavage. </li><li> Laver les deux DAPI incubésles lames dans un récipient séparé pour le premier lavage 5 min à ne pas contaminer les autres diapositives avec du DAPI taches. Pour le deuxième lavage 5 min, les lames peuvent être combinés dans du PBST (tous les lavages doivent être effectuées sur un agitateur). Couvrir de papier d&#39;aluminium pour le protéger de la lumière. </li><li> Diapositives brièvement d&#39;immersion dans l&#39;eau avant (1,5 épaisseur avec les médias de montage aqueux pour préserver fluorescence) glisser couverture </li><li> Laisser sécher 3 heures dans l&#39;obscurité à la température ambiante. </li><li> Scellez les bords de la lamelle avec du vernis durcisseur. (Ne pas utiliser de vernis à ongles comme de l&#39;acétone peut étancher le signal fluorescent). </li><li> Analyser diapositives immédiatement ou conserver à 4 ° C pour une analyse ultérieure. </li></ol> 4. Imagerie multispectrale <ol><li> Recueillir des images multispectrales utilisant une caméra Nuance EX (contenant un filtre accordable à cristaux liquides) sur un Olympus X-63 microscope droit avec le logiciel Nuance pour la collecte de données. </li><li> Recueillir des images en utilisant un objectif de l&#39;huile pour augmenter la résolution. </li><li> Initiativel installation comprend l&#39;établissement de la gamme spectrale pour chaque fluorophore utilisé. <ol class="lalpha"><li> Pour 4 couleur: <ol class="lroman"><li> DAPI: 420-480nm </li><li> AF488: 490-580nm </li><li> AF594: 590-640nm </li><li> AF647: 650-720nm </li></ol></li></ol></li><li> Prendre une image initiale de la lame d&#39;analyse pour obtenir les durées d&#39;exposition appropriées pour chacune des plages spectrales. </li><li> Créer &quot;bibliothèque spectrale&quot; que le logiciel utilise pour identifier et séparer le rapport signal-sur-bruit des fluorophores et de l&#39;autre signal de fond. (Remarque: Chaque fluorochrome doit avoir son propre curseur de contrôle de couleur unique pour assembler une bibliothèque spectrale avec des courbes de longueurs d&#39;onde appropriées pour assurer une bonne analyse de l&#39;ensemble de données Exemple: 3 fluorophores = 4 lames de contrôle; 5 fluorophores = 6 lames de contrôle.). <ol><li> Première image de la diapositive sans tache. Cette diapositive sera désigné au sein du bibliothécaire spectraley comme arrière-plan.&gt; </li><li> L&#39;image du DAPI seulement glisser seconde. Cette diapositive sera utilisé pour désigner les noyaux DAPI colorées avec l&#39;outil &quot;dessiner&quot; et sera sauvegardé dans la bibliothèque spectrale DAPI.&gt; </li><li> L&#39;image de la AF488 seulement glisser tiers. Cette diapositive sera utilisé pour désigner les régions AF488 colorées avec l&#39;outil &quot;dessiner&quot; et sera sauvegardé dans la bibliothèque spectrale AF488.&gt; </li><li> L&#39;image de la AF594 seulement glisser quatrième. Cette diapositive sera utilisé pour désigner les régions AF594 colorées avec l&#39;outil &quot;dessiner&quot; et sera sauvegardé dans la bibliothèque spectrale AF594.&gt; </li><li> L&#39;image de la AF647 seulement glisser cinquième. Cette diapositive sera utilisé pour désigner les régions AF647 colorées avec l&#39;outil &quot;dessiner&quot; et sera sauvegardé dans la bibliothèque spectrale AF647.&gt; </li><li> Après la collecte de chaque composant spectral,enregistrer la bibliothèque spectrale et le protocole.&gt; </li></ol></li><li> Une fois la bibliothèque spectrale est terminée, trouver des régions d&#39;intérêt sur ​​la lame d&#39;analyse sur le microscope et collecter / enregistrer des images.&gt; </li></ol> 5. Analyse quantitative des images multispectrales <ol><li> Importer un assortiment représentatif d&#39;images acquises à l&#39;aide de Nuance InForm logiciel. </li><li> Ouvrez la bibliothèque spectrale enregistrée selon les directives du programme </li><li> Identifier des régions de tissus d&#39;intérêt à analyser. (Par exemple les tissus de la tumeur par rapport aux tissus adipeux). </li><li> Identifier les cellules individuelles basées sur DAPI-tache. Cytoplasme sera défini automatiquement sur la base de la forme du noyau. </li><li> Choisissez l&#39;intensité de fluorescence de lecture de choix pour chaque paramètre fluorescent (par exemple, moyenne, écart-type) </li><li> Lot l&#39;acquis images et de laisser le processus de logiciel en utilisant l&#39;algorithme proposé. </li><li> Lorsque le traitement d&#39;image est terminée, fusionnerles fichiers de résultats. </li><li> Ouvrez les résultats dans Excel (ou tout autre logiciel d&#39;analyse) et tracer deux intensités de fluorescence uns contre les autres sur axes XY. Chaque intensité de fluorescence est donnée par cellule. Les cellules doubles positives apparaissent dans le quadrant supérieur droit. L&#39;utilisateur doit définir les intensités de fluorescence de base. </li></ol>

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

FCM, CMB, et ELS n&#39;ont aucun conflit et rien à divulguer.

Nous décrivons ici l&#39;application de l&#39;imagerie multispectrale, nous décrivons comme interrogation MIMicc-multispectrale de compositions cellulaires multiplexés, pour analyser la moelle osseuse provenant composantes stromales du microenvironnement de la tumeur, mais cette méthodologie et le concept peut être appliqué à déchiffrer d&#39;autres éléments cellulaires qui composent un complexe tissus tels que ceux observés lors des réactions de cicatrisation des plaies ou lors d&#39;un tissu régénératri...

Comprendre le développement et la réparation tissulaire est important d&#39;élucider les composants cellulaires qui participent à la cicatrisation des plaies, 2,3 médecine régénérative, la biologie du développement et de la biologie de la tumeur. Dans des circonstances de la réparation, de nombreux types de cellules infiltrent le microenvironnement entourant à l&#39;aide de la vascularisation, le dépôt de l&#39;ECM, la prolifération et la restructuration des tissus. Facteurs cellulaires et les phénotypes peuvent être identifiés sur la base de plusieurs paramètres, marqueurs multiplexés qui peuvent identifier la localisation, l&#39;état de la différenciation et de l&#39;interaction entre les composants cellulaires dans le microenvironnement enquête. Ici, nous décrivons le développement de la tumeur comme un exemple typique de ce modèle de greffe multicolore-multicellulaire suivi par imagerie multispectrale et la méthodologie de déconvolution spectrale. La progression tumorale est un processus en plusieurs étapes qui est marquée par plusieurs capacités acquises qui incluent augmentation de la prolifération, unpropriétés ntiapoptotic, invasives et angiogéniques. 4 développement de la tumeur est facilitée par des cellules non néoplasiques qui sont recrutés dans l&#39;environnement à fournir des facteurs de croissance, des matrices structurelles, les réseaux vasculaires et la modulation immunitaire. 1,5,6 Ce micro-habitat est constitué de cellules dérivées de , les tissus locaux voisins tels que le tissu adipeux, et les vaisseaux sanguins et les sources lointaines comme la moelle osseuse des cellules dérivées 1. L&#39;étendue de l&#39;incorporation des cellules non-néoplasiques dépend de la demande à partir de la tumeur, ce qui correspond souvent à l&#39;étape / grade de la tumeur. Pour comprendre le rôle du micro-environnement de la tumeur de support, il faut comprendre l&#39;origine et le potentiel de différenciation des populations de cellules non néoplasiques. Ce protocole a été conçu pour aider à l&#39;interprétation de la progression de la tumeur par le biais de la visualisation à la fois des composants cellulaires dérivées de la moelle osseuse, et la deriv tissulaire localecellules ed. Utilisant des souris fluorescentes de gènes exprimant journaliste transgéniques, nous avons transplanté GFP (protéine fluorescente verte) de la moelle osseuse dans un DP mortellement irradié (protéine rouge fluorescente) de la souris. Suite au succès la prise de greffe de moelle osseuse, une lignée cellulaire de tumeur syngénique est injecté orthotopique et on le laisse se greffer à 4-8 semaines. La tumeur résultant est excisé de la souris et traitées pour immunofluorescence (IF) pour visualiser la coloration des composants du stroma. Multiplexage SI marqueurs est une technique couramment utilisée qui implique une optimisation considérable 9.7, mais en utilisant une plate-forme d&#39;imagerie / de démixage multispectral améliore le potentiel de combinaisons de marqueurs fluorescents qui possèdent un recouvrement spectral. Nous présentons ici une technique que nous appelons interrogation MIMicc-multispectrale de compositions cellulaires multiplexés pour colorer et analyser jusqu&#39;à huit marqueurs d&#39;une section de la tumeur sur une seule lame afin d&#39;analyser les origines cellulaires, la différenciation cellulaire stATU et les interactions cellule-cellule des composants dans le microenvironnement tumoral. Cet exemple simplifié a le potentiel d&#39;être développée afin d&#39;analyser cinq, six, ou plusieurs marqueurs utilisant des anticorps ou intracellulaire expression fluorescent promoteur-entraînée. Tableau 1 énumère potentiels fluorescentes combinaisons anticorps de coloration avec des espèces appropriées prises en compte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Avec la volonté de comprendre les contributions des éléments cellulaires multiples à l&#39;élaboration d&#39;un tissu complexe, tels que les nombreux types cellulaires qui participent à la régénération du tissu, formation d&#39;une tumeur, ou la vasculogenèse, nous avons conçu un modèle de transplantation cellulaire multicolore de développement de tumeurs chez populations de cellules qui proviennent de différentes souris à gène rapporteur colorées par fluorescence et sont transplantés, greffés ou injectés dans et autour d&#39;une tumeur en développement. Ces cellules colorées sont ensuite recrutés et incorporés dans le stroma tumoral. Afin d&#39;évaluer quantitativement les cellules stromales de tumeurs dérivées de la moelle osseuse, nous avons transplanté exprimant la GFP ensemble transgénique moelle osseuse en DP mortellement irradié exprimer souris approuvé par IACUC. 0ovarian tumeurs qui ont été injectés de manière orthotopique dans les souris greffées ont été excisés 6-8 semaines après la prise de greffe et analysés pour le marqueur de la moelle osseuse d&#39;origine (GFP) ainsi que des marqueurs d&#39;anticorps pour détecter associé à une tumeurstroma en utilisant des techniques d&#39;imagerie multispectrale. Nous avons ensuite adapté une méthode que nous appelons MIMicc-multispectrale Interrogation de compositions cellulaires multiplexés, en utilisant unmixing multispectrale de fluoroprobes d&#39;évaluer quantitativement qui marqué cellule est venu à partir de laquelle les populations de départ (basé sur les étiquettes d&#39;origine de gènes rapporteurs), et que notre capacité à unmix 4, 5 , 6 ou plusieurs spectres par glissement augmente, nous avons ajouté immunohistochimie supplémentaire associée à des lignées cellulaires ou la différenciation pour augmenter la précision. Utilisant le logiciel pour détecter les signaux multiplexés fluorescent co-localisées, les populations du stroma de la tumeur peuvent être tracées, énumérés et caractérisés en fonction de marqueur coloration. 1

En utilisant une technique d&#39;imagerie multispectrale pour analyser les tumeurs greffées dans notre modèle de souris transgénique BMT, nous sommes en mesure de discerner les composants de tumeurs stromales qui sont d&#39;origine de la moelle osseuse. La première greffe de moelle osseuse a été confirmé trois semaines après la transplantation par cytométrie de flux (Figure 1). Orthotopiquement injecté tumeurs ovariennes non étiquetés suivant BMT confirmations de prise de greffe ont été ex...

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Masses tissulaires complexes, à partir d&#39;organes à des tumeurs, sont composées de différents éléments cellulaires. Nous avons élucidé la contribution des phénotypes cellulaires dans un tissu en utilisant des souris transgéniques fluorescentes marquées multi-paramètres multiples en combinaison avec la coloration par immunofluorescence suivie par déconvolution spectrale de déchiffrer l&#39;origine de la cellule ainsi que les caractéristiques des cellules sur la base de l&#39;expression de protéine.

Analyse quantitative multispectrale Après transplantation de tissu fluorescent pour la visualisation des origines cellulaires, types et Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

quantitative-multispectral-analysis-following-fluorescent-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K vues.  MD Anderson Cancer Center.  Masses tissulaires complexes, à partir d'organes à des tumeurs, sont composées de différents éléments cellulaires. Nous avons élucidé la contribution des phénotypes cellulaires dans un tissu en utilisant des souris transgéniques fluorescentes marquées multi-paramètres multiples en combinaison avec la coloration par immunofluorescence suivie par déconvolution spectrale de déchiffrer l'origine de la cellule ainsi que les caractéristiques des cellules...

Vidéo: Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Visualisation quantitative et la détection de cancer de la peau Utilisation dynamique imagerie thermique

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Recherche

Médecine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné<em&gt; In situ</emPerfusion&gt; du tissu pulmonaire et coloration X-gal de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tag cellules tumorales

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolement des noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murin de transplantation cardiaque hétérotopique Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-réseau d&#39;électrodes enregistrements des droits de l&#39;épilepsie post-opératoire corticale tissus

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

Rein murin Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Vein Interposition Modèle: un modèle approprié pour étudier Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualisation quantitative de l&#39;infiltration de leucocytes dans un modèle murin de myocardite fulminante par microscopie à feuilles lumineuses

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

Blessure axée sur le ballon pour provoquer l’hyperplasie Myointimal dans l’aorte abdominale de souris

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...