Les auteurs tiennent à remercier le Dr Lubor Borsig (Institut de Physiologie de l&#39;Université de Zurich) pour ses conseils sur la technique de la perfusion du poumon. Ce travail a été soutenu par des subventions du Krebsliga du canton de Zurich, le L. Walter et Johanna Wolf Foundation, Zurich, le Lydia Hochstrasser Foundation, Zurich, le Fonds national suisse, le FNS, la Suisse, le Schweizerischer Verein Balgrist, et l&#39;Université de Zurich.

1. Perfusion pulmonaire in situ et de fixation <ol><li> Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de ~ 150 ul solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 112,5 mg / kg (poids corporel) kétamine, 16,5 mg / kg de xylazine et 15 mg / kg acépromazine (ou par un autre anesthésie contenant des analgésiques appropriés). </li><li> Lorsque les réflexes de la souris ne sont plus respectées, le fixer sur la table d&#39;opération en arrière vers le bas et mouiller le pelage avec de l&#39;éthanol à 70% lisses les cheveux vers le bas. </li><li> Ouvrir la peau de l&#39;abdomen jusqu&#39;au cou et tirez-le vers les côtés ou le supprimer. </li><li> Ouvrez le péritoine et le thorax à une taille suffisante. Prévenir les ruptures de vaisseaux de grande taille (par exemple, la veine jugulaire) afin d&#39;éviter une perte d&#39;efficacité de la perfusion ultérieure. </li><li> Couper la veine cave caudale sous le foie. </li><li> Utilisez une seringue de 20 ml équipé d&#39;un 21G - 24G aiguille pour injecter le produit lentement 10-15 ml de PBS dans le ventricule droit du cœur battant jusqu&#39;à ce que le poumon est complètement blanc etle cœur cesse de battre (asystolie). </li><li> Pincer les vaisseaux sanguins au-dessus du foie et le diaphragme avec une pince vasculaire. </li><li> Utiliser une seringue de 10 ml équipé d&#39;un 21G - 24G aiguille pour injecter ~ 2 ml de paraformaldéhyde à 3% (PFA) dans le PBS dans le ventricule droit. </li><li> Découvrir la trachée à l&#39;extérieur de la cage thoracique. Utilisez la même seringue pour injecter ~ 3 ml de PFA 3% dans du PBS crânienne (à l&#39;extérieur du thorax) dans la trachée jusqu&#39;à ce que le poumon est gonflé. Immédiatement après le retrait de l&#39;aiguille, pincer la trachée caudale de la perforation avec une pince vasculaire et d&#39;attendre 10 minutes pour permettre la fixation. </li><li> Transect les vaisseaux sanguins au-dessus du clamp vasculaire, enlever le collier et injecter ~ 2 ml de PBS dans le ventricule droit pour enlever l&#39;excès PFA. </li><li> Percer les parties inférieures de l&#39;ensemble des lobes de poumon avec une aiguille, retirer la pince vasculaire à la trachée et injecter 3-5 ml d&#39;une solution d&#39;enrobage moyen PolyFreeze / PBS 1:1 dans la trachée caudale de la première perforation jusqu&#39;à ce que le PFA dans l&#39; poumonlobes est remplacé par la solution. </li><li> Retirez soigneusement le poumon en tirant sur le cœur avec une pince et en sectionnant les ligaments du tissu conjonctif, des vaisseaux sanguins et la trachée. Gardez le coeur relié aux poumons. </li><li> Selon la façon de procéder à l&#39;analyse des tissus du poumon continuent avec les protocoles décrits dans les sections 2 ou 3. Si vous voulez faire les deux analyses, enlever un lobe du poumon et procédez comme décrit au point 3. Traiter les lobes restants liés au cœur, comme décrit au point 2. </li></ol> 2. Visualisation de lacZ-taggés cellules tumorales métastatiques dans les lobes pulmonaires entières <ol><li> Placer le poumon dans un gobelet en plastique avec couvercle à fermeture étanche et le fixer avec du formaldéhyde à 2% dans du PBS à température ambiante pendant 30-60 min. </li><li> Retirer la solution de fixation et de bien se laver 3 fois avec du PBS. </li><li> Ajouter au moins 10 ml fraîchement préparée 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) solution de coloration (solution mère de X-Gal [40 mg / ml dansDiméthylformamide] 1:40 diluée dans une solution de coloration de base, pH 7,1 (tableau 1); abri de la lumière). </li><li> Placer un morceau de gaze sur le dessus du poumon natation de le garder complètement dans la solution et placez le couvercle que faiblement sur le pot pour permettre un échange d&#39;air. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 3-5 h abri de la lumière. </li><li> Retirer X-Gal solution, rincer une fois avec du PBS pour éliminer les résidus X-Gal solution (en option) et ajouter 4% de PFA. </li></ol> 3. Visualisation de lacZ-taggés cellules tumorales métastatiques pulmonaires dans cryosections <ol><li> Prefill un moule d&#39;enrobage étiqueté à 1/3 avec support intégration PolyFreeze non dilué. Mettre le lobe pulmonaire sur le dessus et remplir avec incorporation moyen jusqu&#39;à ce que le lobe est entièrement recouvert. Essayez d&#39;éviter les bulles. </li><li> Incuber les poumons incorporés à 4 ° C pendant 20 min. </li><li> Puis geler les poumons embarqués lentement dans un mélange de glace sèche et l&#39;isopentane et conserver à -80 ° C. </li><li> Couper um 10.07 cryosections sur un cryostat et les monter sur des lames de microscope SuperFrostPlus. </li><li> Incuber les sections immédiatement avec une solution de coloration X-Gal à 37 ° C pendant 24 heures dans une chambre humide. </li><li> Rincer les lames dans du PBS 2 fois pendant 5 min, puis brièvement dans de l&#39;eau distillée. </li><li> Contre-coloration avec le rouge rapide nucléaire pendant 10-30 secondes, rincer à l&#39;eau distillée et monter les lames avec Immu-Mount. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Asai et al. Rapporté dans l&#39;article d&#39;origine sur le modèle de Dunn dérivé LM8 souris OS que les tumeurs sc primaires dérivées des cellules parentales Dunn, différents de ceux issus de la grande lignée de cellules métastatique LM8 sous, ne forment spontanément des métastases pulmonaires détectables dans syngéniques C3H 14. Avec les techniques rapportées ici, nous avons une nouvelle enquête de la formation de métastases dans les modèles Dunn/LM8 OS souris. Nous avons profité de lacZ stable transduites par Dunn et LM8 cellules et d&#39;un protocole pour la perfusion du poumon in situ et de la fixation sur des souris. Des images représentatives des poumons perfusés et non perfusée de souris injectées avec lacZ sous-cutanée transduites et non transduites contrôle Dunn et LM8 cellules sont représentées sur la figure 1. Chez les souris injectées avec des cellules de contrôle Dunn, métastases macroscopiques et microscopiques restée indétectable dans les poumons perfusés et non perfusés (figure 1A, i-iv). Mais, curieusement, chez des souris injectées avec des cellules Dunn-lacZ, coloration X-gal a révélé bleu micrométastatique foyers de cellules simples ou amas de cellules de petite taille (&lt;0,1 mm) sur la surface de la non-perfusés poumons (figure 1A, vi). In- perfusion in situ et la fixation des poumons encore amélioré la détectabilité de Dunn-lacZ micrométastases (figure 1A, viii). Cependant, excroissance au macroscopique des foyers n&#39;a pas été observé (figure 1A, v, vii). &lt;/ P&gt; Chez les souris injectées avec des cellules de contrôle LM8, translucides, à peine détectable macrométastatique foyers supérieure à 0,1 mm de diamètre ont été reconnus dans les poumons non perfusés (figure 1B, i). Perfusion du poumon (figure 1B, iii) n&#39;améliore pas la détection des foyers. Cependant, chez les souris injectées avec LM8-lacZ plusieurs cellules X-Gal teinté bleu macro-(figure 1B, v) et micrométastases (figure 1B, vi) ont été détectés à la surface de la non-perfusés organes. En outre, la perfusion des poumons en outre amélioré la détectabilité des macro-et micro-métastases (figure 1B, vii - viii). Par conséquent, les micro-et macrométastases est devenu visible à une densité plus élevée et un plus grand nombre, principalement en raison de la translucidité du tissu perfusé dans lequel foyers sous la surface de l&#39;organe est devenu aussi visible. Une h supplémentaireanalyse istological utilisant cryosections de tissu pulmonaire confirmé l&#39;amélioration de la détectabilité des métastases pulmonaires chez des souris injectées avec lacZ transduites par Dunn et LM8 cellules. Chez les souris ayant des tumeurs primaires dérivées de Dunn-lacZ ou LM8-lacZ cellules, contrairement aux souris atteintes de tumeurs primaires des cellules témoins respectifs, des micrométastases ou de cellules, même seul foyers ont été constatés dans les sections du poumon (figure 2). En outre, macrométastases étaient également plus clairement visible dans les souris injectées avec des cellules LM8-lacZ que chez les animaux injectés avec le contrôle LM8 cellules (figure 2C, D). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figure 1. Détection de métastases spontanées de non transduites (i-iv) et lacZ-transduction (v-viii) Dunn (A) et LM8 (B) dans les cellules non perfusé (i, ii, v, vi) et perfusé (iii, iv, vii, viii) les poumons chez les souris C3H. Métastases représentant X-Gal-staINED poumons entiers (v, vii en A et B) et correspondant en gros plan (vi, viii A et B) apparaissent en bleu. Macrométastatique foyers (&gt; 0,1 mm) dans les organes de souris injectées avec des cellules marqués LM8 (i-iv en B) sont indiqués par des astérisques. Zones indiquées dans les gros plans sont représentatifs de poumons entiers. Barres d&#39;échelle indiquent 1 mm dans les images de poumons entiers et 0,1 mm en gros plan. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figure 2. Détection de Dunn et LM8 micrométastases dans cryosections pulmonaires. Des coupes de tissu pulmonaire octobre embarqué ont été incubés dans X-Gal solution de coloration à 37 ° C pendant 24 heures dans une chambre humide et ensuite contre le nucléaire rapide rouge. Les flèches indiquent micrométastatique foyers reconnus dans les sections de poumons de souris injectées avec Dunn-lacZ (B) ou LM8-lacZ cellules (D). Micrometastases restée indétectable dans les sections de poumon de souris injectées avec des non-transduites Dunn (A) ou LM8 cellules (C). Barres d&#39;échelle indiquent 0,1 mm.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les résultats présentés ici dans le modèle de souris Dunn/LM8 OS démontrer la puissance de la méthode nouvellement créée qui combine la coloration X-Gal de lacZ-taggés cellules tumorales avec la perfusion in situ / fixation du tissu pulmonaire. Cette combinaison de deux techniques permet de détecter des lésions de sensibilité micrométastatiques jusqu&#39;au niveau de la cellule unique et améliore également la visualisation de macrométastases sur la surface du poumon (figure 1) ainsi que dans les sections du poumon (figure 2). Bien que la coloration X-Gal permet également la détection de (micro) métastases dans d&#39;autres organes, in-situ de perfusion / fixation améliore la détectabilité des foyers métastatiques dans les tissus autres que le poumon que légèrement en raison de la couleur naturelle du sang et des tissus liée à de ces 13 organes. Même si la perfusion est dirigé vers un autre organe, par exemple le foie, l&#39;élimination du sang serait que partiellement améliorer le contraste pariween coloration X-Gal et de la couleur naturelle de l&#39;organe. Cependant, la méthode est applicable à tout type de lacZ étiquetées cellules tumorales, va considérablement améliorer la détectabilité des métastases pulmonaires jusqu&#39;au niveau des dormants unicellulaires micrométastases et permet une quantification simple et fiable de macro-et micro-métastases. Une limitation de cette méthode et toutes les autres techniques qui sont basées sur des gènes rapporteurs luciférase, y compris les protéines fluorescentes, et c&#39;est la stabilité de l&#39;expression du transgène. Comme le montre la figure 2d, toutes les cellules tumorales dans les foyers macrométastatique sont colorés en bleu, ce qui indique un manque d&#39;activité beta-galactosidase. Cela pourrait être lié à la nécrose, mais il est plus probablement due à une perte de l&#39;expression du transgène. Nous avons observé que la Dunn et LM8 cellules sont très efficaces dans la régulation négative de lacZ et d&#39;autres transgènes même dans la sélection continue d&#39;expression. Nous avons donc mis dans des études récentes de la K12 murinet K7M2 et les humains HOS, 143B et Saos-2 lignées de cellules d&#39;ostéosarcome, qui ont tous maintenu stable expression de lacZ in vitro ainsi que in vivo jusqu&#39;à 100% au cours du temps. Une fois stable lacZ-expression est garantie, cette technique peut être appliquée dans des études avec des gènes manipulés cellules tumorales de façon mécanique, par exemple pour étudier le processus de colonisation des tissus de 13 ainsi que pour le développement et les essais de nouveaux traitements visant à l&#39;éradication des lésions métastatiques 15 , 16. De plus, il peut servir de référence pour l&#39;amélioration des techniques actuelles d&#39;imagerie radiologique, tels que le PET, le (micro) TDM et l&#39;IRM, utilisés pour la détection précoce des lésions métastatiques. Dans une étude récente PET (inédit) avec différents traceurs nous avons vérifié le dans le poumon détecté in vivo les métastases in vivo par la suite ex avec le protocole décrit. Dans une étude en cours avec un animal nouveau petit micro-CT (SkyScan) nous sommes si loin able pour détecter les métastases pulmonaires in vivo à une taille de 0,5 mm et ex vivo à 0,3 mm, mais nous visons à une résolution de 0,1 mm. Il est intéressant, c&#39;est la limite de taille que nous avons mis de distinguer macro et micro-métastases avec la méthode combinée de la perfusion in situ et coloration X-Gal. Cela souligne encore une fois la sensibilité et l&#39;utilité de cette technique facile et rentable.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Narketan10 (kétamine) </td><td> Vétoquinol SA </td><td></td><td> 100 mg / ml, solution </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml, solution </td></tr><tr><td> Prequilan (acépromazine) </td><td> FATRO SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml, solution </td></tr><tr><td> Bulldog Type de Serrefine clamp vasculaire </td><td> Outils Fine Science </td><td> 18051-35 </td><td> courbé, 35 mm </td></tr><tr><td> Gobelet en plastique avec couvercle </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 tasses ml avec couvercles </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); poudre </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> dissoudre dans de la N, N-di-méthylformamide à 40 mg / ml, magasin protégée lumière à -20 ° C </td></tr><tr><td> Une solution de coloration de base, équilibrée à pH 7,1, stockée lumière protégés à 4 ° C pendant max. 1 mois </td><td> auto-rendu </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% de NP40, 1 ml / L 10% Sodium désoxycholate- </td></tr><tr><td> Moyen Embedding PolyFreeze </td><td> Polysciences; distributeur suisse: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Intégration moule </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 cryostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diapositives SuperFrost </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red-- solution de sulfate d&#39;aluminium </td><td> Division Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, distributeur suisse: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs et matériel.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

Les métastases sont la principale cause de décès dans la plupart des types de cancer et par conséquent un des principaux axes de recherche sur le cancer. Cependant, la détection des micrométastases par imagerie radiologique et le succès de leur éradication thérapeutiques restent limitées. Alors que les modèles animaux se sont révélés être des outils précieux pour recherche sur le cancer 1, le suivi / visualisation des micrométastases reste un défi et une évaluation inexacte de la dissémination métastatique dans les études précliniques conduit potentiellement à des résultats décevants dans les essais cliniques 2. Par conséquent, il ya un grand intérêt à perfectionner les méthodes pour enfin permettre la détection reproductible et fiable des métastases jusqu&#39;au niveau de la cellule unique dans les tissus normaux. L&#39;objectif principal est donc sur des techniques qui permettent la détection de cellules tumorales in vivo, comme les micro-tomographie par ordinateur (micro-CT), la tomographie par émission de positons (TEP), imagerie de fluorescence ou de bioluminescence &lt;sup&gt; 3,4. Nous sommes actuellement à l&#39;optimisation de ces techniques pour la surveillance in vivo de la croissance tumorale primaire et les métastases dans des modèles différents d&#39;ostéosarcome. Certaines de ces techniques peuvent également être utilisées pour l&#39;analyse ex vivo de métastases à côté des méthodes classiques comme qPCR 5, 6 ou FACS différents types de coloration histologique. Comme point de référence, nous avons établi dans la présente étude la transfection stable ou la transduction des cellules tumorales avec le gène lacZ codant pour l&#39;enzyme bactérienne β-galactosidase qui métabolise le substrat chromogène 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bêta-D -galactopyranoside (X-Gal) à un colorant insoluble bleu indigo 7 et permet très sensible et sélective coloration histochimique bleu de cellules tumorales in vivo de souris ex tissu jusqu&#39;au niveau de la cellule unique comme indiqué ici. Il s&#39;agit d&#39;un outil à faible coût et non l&#39;équipement à forte intensité, ce qui permet la validation précise des métastases 8 en études évaluant un nouveauthérapies ticancer 9-11. Un facteur limitant de coloration X-gal est le faible contraste par exemple à du sang liée à une coloration rouge des tissus vascularisés ainsi. Dans le tissu pulmonaire, ce problème peut être résolu par la perfusion pulmonaire in situ, une technique qui a été récemment mis en place par Borsig et al. 12 qui perfuse les poumons de souris sous anesthésie pour les faire disparaître du sang et de fixer et d&#39;intégrer les in-situ sous gonflage à travers la trachée. Cette méthode empêche également l&#39;effondrement du poumon et maintient ainsi la morphologie fonctionnelle des alvéoles pulmonaires, ce qui améliore la qualité du tissu pour analyse histologique. Dans la présente étude, nous décrivons un nouveau protocole, qui tire parti d&#39;une combinaison de coloration X-gal de lacZ cellules tumorales exprimant et in-situ de perfusion et de la fixation du tissu pulmonaire. Ce protocole permet raffiné de haute sensibilité de détection de simples cellules métastatiques dans les poumons et nous a permis dans une étude récente à detect «dormants» micrométastases pulmonaires dans un modèle de 13 souris, qui a été décrit à l&#39;origine comme non métastatique 14.

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Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Le nouveau protocole indiqué dans la présente étude permet une détection sélective des métastases pulmonaires à la résolution cellule unique chez la souris par combiné<em&gt; In situ</emPulmonaire de perfusion&gt; et la coloration de fixation et de X-Gal<em&gt; LacZ</em&gt;-Marqué cellules tumorales.

Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné<em&gt; In situ</emPerfusion&gt; du tissu pulmonaire et coloration X-gal de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tag cellules tumorales

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

17.2K vues.  Balgrist University Hospital, Zurich. Le nouveau protocole indiqué dans la présente étude permet une détection sélective des métastases pulmonaires à la résolution cellule unique chez la souris par combiné In situ et la coloration de fixation et de X-Gal LacZ-Marqué cellules tumorales.

Vidéo: Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Méthode de isolé<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung perfusion dans un modèle rat: Leçons tirées élaboration d&#39;un programme EVLP Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

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Médecine

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumeur primaire et MEF cellule d&#39;isolement pour étudier métastases pulmonaires

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Ouvrir trachéotomie acide gastrique Aspiration modèle murin de lésion pulmonaire aiguë Résultats dans Maximal aiguë non létaux Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Génération de Cultures de tissus pulmonaires humains de 3D (3D-SFLC) pour la modélisation de la maladie

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induire une lésion pulmonaire aigue chez la souris par instillation directe du lipopolysaccharide intratrachéal

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ quality exacerbated by excessive geographic transportation distance and stringent donor organ acceptance criteria pose limitations to current LTx efforts. Ex situ lung perfusion (ESLP) is an innovative technology that has shown promise in attenuating these limitations. The physiologic ventilation and perfusion of the lungs outside of the inflammatory milieu of the donor body affords ESLP several advantages over traditional cold static preservation (CSP). There is evidence that negative pressure ventilation (NPV) ESLP is superior to positive pressure ventilation (PPV) ESLP, with PPV inducing more significant ventilator-induced lung injury, pro-inflammatory cytokine production, pulmonary edema, and bullae formation. The NPV advantage is perhaps due to the homogenous distribution of intrathoracic pressure across the entire lung surface. The clinical safety and feasibility of a custom NPV-ESLP device have been demonstrated in a recent clinical trial involving extender criteria donor (ECD) human lungs. Herein, the use of this custom device is described in a juvenile porcine model of normothermic NPV-ESLP over a 12 h duration, paying particular attention to management techniques. Pre-surgical preparation, including ESLP software initialization, priming, and de-airing of the ESLP circuit, and the addition of anti-thrombotic, anti-microbial, and anti-inflammatory agents, is specified. The intraoperative techniques of central line insertion, lung biopsy, exsanguination, blood collection, cardiectomy, and pneumonectomy are described. Furthermore, particular focus is paid to anesthetic considerations, with anesthesia induction, maintenance, and dynamic modifications outlined. The protocol also specifies the custom device's initialization, maintenance, and termination of perfusion and ventilation. Dynamic organ management techniques, including alterations in ventilation and metabolic parameters to optimize organ function, are thoroughly described. Finally, the physiological and metabolic assessment of lung function is characterized and depicted in the representative results.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

This paper describes a porcine model of negative pressure ventilation ex situ lung perfusion, including procurement, attachment, and management on the custom-made platform. Focus is made on anesthetic and surgical techniques, as well as troubleshooting.

Perfusion pulmonaire ex situ de la ventilation à pression négative normamère : évaluation de la fonction pulmonaire et du métabolisme

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ ...

Lung Rapid Recovery Procurement Combined with Abdominal Normothermic Regional Perfusion in Controlled Donation after Circulatory Death

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years confirm that the outcomes after lung transplantation from cDCD are similar to those from brain death donors; however, the utilization of lungs from asystole donors remains low. Several reasons may be involved: different legal frameworks among countries and centers with different premortem interventions, inadequate lung donor care before procurement, or even poor experience with cDCD procedures and protocols.
Initially, the rapid recovery technique was commonly employed for the procurement of thoracic and abdominal organs in cDCD, but, in the last decade, abdominal normothermic regional perfusion (ANRP) with extracorporeal membrane oxygenation devices has become a useful method to restore blood flow to abdominal organs, allowing their quality improvement and their functional assessment prior to transplantation. This makes the donation procedure more complex and generates doubts about injury to the grafts due to dual temperature.
The aim of this article is to describe a protocol based on a single center experience with Maastricht III donors combining lung cooling rapid recovery in the thorax and abdominal normothermic regional perfusion. Tips and tricks focused on premortem interventions and lung procurement procedure techniques are explained. This may help to minimize the reluctance among professionals to use this combined technique and encourage other donor centers to use it, despite the increased complexity of the procedure.

The protocol combines a lung cooling rapid recovery technique with abdominal normothermic regional perfusion for abdominal graft procurement in controlled asystole donors, which is a safe and useful method to expand the donor pool.

Obtention d’un rétablissement rapide des poumons combinée à une perfusion régionale normamique abdominale dans le cadre d’un don contrôlé après une mort circulatoire

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years ...

Imagerie pulmonaire innovante à l’aide de sections de vibratome intégrées à l’agarose

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

Pleins feux sur l’auteur : Étude de l’expression spatiale des protéines à l’aide de coupes de tissu pulmonaire intégrées à l’agarose 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

Coupe automatisée par vibratome de tissu pulmonaire enrobé d’agarose pour l’imagerie par fluorescence multiplex

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...