Ce travail a été soutenu par une subvention de l&#39;aide pour la recherche scientifique sur des domaines innovants &quot;Mesoscopic circuits neuronaux» (n ° 22115002) et &quot;Réseau de la science du cerveau global&quot; (n ° 221S0003) du ministère de l&#39;Education, Culture, Sports, Science, et de la technologie, du Japon à AN et Grant-in-Aid pour jeunes scientifiques (B) (n ° 21700344) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) à Hong Kong

1. Les larves Préparation <ol><li> Maintenir voler lignes de OK6-Gal4, UAS-ChR2 ou OK6-Gal4, UAS-NpHR2 dans des flacons en plastique contenant de la nourriture à la mouche standard. </li><li> Étendre la pâte levure contenant tout-trans rétinal (ATR) à des concentrations appropriées (1 mm pour ChR2, 10 mm pour NpHR2 (&quot;NPHR&quot; pour faire court) sur une plaque de gélose au jus de pomme. </li><li> Ramassez 2 e ou 3 e stade larvaire des flacons et les mettre sur la plaque ATR contenant. </li><li> Les élever à 25 ° C dans l&#39;obscurité pendant une période de temps appropriée (1 jour pour ChR2, 2 jours pour NPHR.) </li></ol> 2. Configuration de microscope <ol><li> Joindre une caméra CCD (XCD-V60, Sony) à un microscope confocal classique (dans notre cas, FV1000, Olympus) avec une pièce jointe C-mount (grossissement 0,35 x). </li><li> S&#39;il ya un volet long de la trajectoire de la lumière de l&#39;objectif de la caméra CCD, qui ferme pendant le balayage laser, retirez-le soigneusement. Comme cette étape dépend de la microsface configuration, contactez le fabricant de microscope pour le support technique, si nécessaire. </li></ol> 3. Dissection <ol><li> Rincer les larves ATR alimenté avec de l&#39;eau pour enlever la nourriture résiduelle du corps. </li><li> Mettre la chenille sur un plat revêtu Sylgard, côté dorsal vers le haut (du côté dorsal possède deux tubes trachéaux s&#39;étendant longitudinalement, une de chaque côté de la ligne médiane dorsale). L&#39;épaisseur de la Sylgard est d&#39;environ 5mm. </li><li> Insérez une broche insecte (broches d&#39;insectes Austerlitz, Φ0.10mm, acier) dans la queue entre les trachées avec une pince (n ° 5 Inox, FST par Dumont, Suisse). Les Pins, à environ 10 mm de long, doivent être pliés ou découpés à être assez court (~ 2 mm de long) pour éviter de heurter et endommager la surface de l&#39;objectif. Ensuite, mettre le deuxième axe d&#39;insectes dans la tête de la larve à proximité de l&#39;hameçon de la bouche, structure noire en forme de griffe à l&#39;extrémité antérieure. </li><li> Ajouter Ca 2 + solution saline normale sans (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Saccharose 36 mM (pH 7,1)) pour maintenir la larve humide. </li><li> Faire une petite incision près de la queue avec micro ciseaux (MB-50-7, Napox, Japon). </li><li> De l&#39;incision, faire une coupe longitudinale le long de la ligne médiane dorsale vers la tête. Veillez à ne pas endommager le cordon nerveux ventral (VNC) et les axones. </li><li> Faire une petite incision à la tête latéralement. </li><li> Placez 4 broches à chaque coin de la paroi de corps disséqué. La paroi du corps doit être étiré assez de visualiser un modèle segmentaire de la paroi du corps, mais pas trop pour entraver le mouvement péristaltique. </li><li> Retirez les organes internes, sauf pour le cerveau et le VNC et rincer l&#39;échantillon avec Ca2 + sérum physiologique libres. </li><li> Réglez l&#39;orientation de la moelle épinière ventrale être bilatéralement symétriques en changeant la position et l&#39;orientation des axes d&#39;insectes sur la paroi du corps. Pour fixer la position de la corde nerveuse ventrale, insérer une aiguille à travers le tissu entre le cerveau et la bouche crochet vers le bas à la Sylgard. </li> &lt;li&gt; Remplacer le tampon avec 2 mM de Ca 2 + solution Ringer (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, saccharose 36 mM (pH 7,3)). </li></ol> 4. Imaging avec éclairage laser <ol><li> Fixer un objectif sec 4x (UPlanSApo 4x, NA 0,16, Olympus, Japon) dans le microscope confocal et mettre la préparation de larve sur la scène. </li><li> Obtenir une image de transmission de la préparation disséqué avec un laser rouge (633 nm) pour localiser la chaîne nerveuse ventrale par microscopie confocale. Pour cette analyse, assurez-vous de ne pas utiliser un laser 488nm ou 559nm, ce qui induit une stimulation indésirable de ChR2 ou NPHR, respectivement. </li><li> Définir la région d&#39;intérêt (ROI) sur l&#39;image de transmission. Mode zoom pourrait être utile pour la détermination détaillée du retour sur investissement. </li><li> Changez le jeu de filtres du microscope pour éclairer avec une lumière 488nm ou 559nm. </li><li> Éclairer la préparation d&#39;une lampe à halogène de visualiser la paroi du corps. Thpréparation de l&#39;e peut être surveillé par une caméra CCD attaché au microscope confocal. </li><li> Enregistrer le mouvement de la paroi du corps et de passer le faisceau laser sur et en dehors tout en surveillant le mouvement. </li></ol>

<ol>
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Neurosci. 28, 533-563 (2005).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Perturbation temporelle et locale de l&#39;activité neuronale est une technique précieuse pour analyser la dynamique du réseau de circuits neuronaux. Dans ce protocole, nous présentons une méthode pour manipuler l&#39;activité neuronale par optogenetics l&#39;aide d&#39;un laser. Directivité élevée du laser permet une stimulation de optogenetic plus localisée que la stimulation de champ large utilisation du mercure ou une lampe au xénon. Bien illuminations laser ont déjà été appliquées à optogenetics dans les études précédentes, les configurations spéciales comme la fibre de verre, micromanipulateur, et source laser, sont nécessaires dans la plupart des études précédentes. Dans ce protocole, nous utilisons une microscopie confocale classique pour l&#39;éclairage local. Puisque le système de microscope confocal est largement utilisée, cette méthode ouvre la possibilité d&#39;appliquer optogenetics haute résolution dans de nombreux laboratoires. Le protocole a deux points essentiels: la dissection des larves et la puissance du laser. Tout d&#39;abord, si le cerveau, la moelle épinière ventrale ou un nerf moteur est endommagé Duridissection ng, les larves présentent moins ou pas du mouvement péristaltique spontanée. La précision est donc essentiel, surtout quand faire une incision sur la face dorsale avec des ciseaux à ressort et enlever les organes internes avec une pince. Les détails concernant la dissection ont été rapportés précédemment 21. En second lieu, si la stimulation est suffisante à atteindre, une puissance laser d&#39;environ 0,1 à 1 mW / mm 2 pour CHR2 ou 1 ~ 10 mW / mm 2 pour NPHR est nécessaire. Nous avons évalué la puissance du laser en tant que puissance totale de lumière ci-dessous un objectif divisé par une surface estimée de l&#39;illumination. Nous avons mesuré la puissance totale de la lumière à l&#39;aide d&#39;un wattmètre (mobiken, Sanwa MI Technos, Japon). Nous avons estimé de la zone d&#39;illumination en tant que constante multipliée par la circulaire de carrés de la longueur d&#39;onde du laser, ce qui donne plus ou moins la zone éclairée dans la limite de diffraction. Puissance efficace d&#39;illumination de l&#39;échantillon peut être réglée non seulement par la puissance de la sortie du laser, mais aussi en changeant la vitesse de balayage et engourdier de répétitions. Nous avons scanné au laser avec 20-100 ps / pixel pour 63 fois. En outre, le niveau d&#39;expression de la protéine optogenetics et la quantité d&#39;ATR sont également essentiels pour l&#39;efficacité de la stimulation. Par conséquent, si les larves n&#39;a montré aucune réponse optogenetic, les points suivants doivent être vérifiés et corrigés: 1) la puissance du laser (en optimisant le système de microscope), 2) le niveau d&#39;expression de la protéine optogenetics (en cochant génotype et la température d&#39;élevage), et 3) le montant de ATR (en ajustant la concentration d&#39;ATR et la période d&#39;alimentation). NPHR nécessite une concentration élevée d&#39;ATR de ChR2 fait par des raisons inconnues 13. ChR2 fonctionne bien dans les larves élevées dans des aliments contenant moins ATR (par exemple 0,1 mm) que décrit ici (1 mM). Comme l&#39;alimentation des larves de 1 mM ATR est suffisante pour faire ChR2 photo-réactif, nous vous recommandons cette concentration pour le premier procès en ChR2 expériences. La concentration des ATR peut ensuite être ajustée en baisse de 1 mM. Quant à la durée d&#39;exposition pour ATR, nous recommandonsla durée décrite ici pour le contrôle de optogenetic robuste. Nous avons souvent échoué à observer la réponse optogenetic lors de l&#39;alimentation des larves d&#39;ATR pour une durée plus courte. Dans ce protocole, illumination laser et d&#39;acquisition d&#39;image sont commandés par un ordinateur séparé. Ainsi, la détection précise de modèle spatio-temporel de l&#39;illumination laser par la caméra CCD est essentiel pour l&#39;analyse des données. Si spot laser ou la ligne est faible sur l&#39;image CCD, vous devez optimiser la puissance de la lampe halogène et la valeur du gain de la caméra CCD pour visualiser l&#39;illumination laser tout en gardant la paroi du corps visible. Éclairage spatio-temporel indiqué dans ce protocole fournit des informations sur les circuits automobiles larvaires, mais la méthode a des limites. Quant à l&#39;aspect «spatiale», l&#39;emplacement de l&#39;éclairage est enregistrée par l&#39;image à faible grossissement CCD utilisé pour filmer les mouvements de la paroi du corps. En conséquence, la zone d&#39;éclairement peut être affecté au niveau des segments, mais pas au niveau cellulaire. Quant à la &quot;tTEMPORELLES &quot;aspect, décalage dans le temps entre la mise sur le balayage laser par microscope confocal et l&#39;éclairage par laser dépend du système de microscope confocal et l&#39;état de numérisation. Par conséquent, des essais par tâtonnement est nécessaire d&#39;ajuster le calendrier d&#39;éclairage. Depuis le moment de l&#39;illumination peut être déterminée dans les films d&#39;image CCD en utilisant un logiciel adéquat comme ImageJ, le facteur critique dans la résolution temporelle est cadence de l&#39;imagerie caméra CCD. Typiquement, nous fixons le taux de trame pour 7,5-15 images par seconde. Les progrès dans les outils optogénétiques nous donnent une chance de modifier le présent protocole. Nous avons utilisé 3 e stade larvaire possédant OK6-Gal4 et UAS-ChR2 [H134R] ou UAS-NpHR2. D&#39;autres outils de optogénétiques au lieu de ChR2 [H134R] ou NpHR2 comme ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 ou Arc peuvent augmenter l&#39;efficacité du contrôle de l&#39;activité 22. En outre, l&#39;utilisation d&#39;autres GAL4 lignes ou de l&#39;analyse à d&#39;autres stades de développement peuvent fournir plus d&#39;informations sur le moteur circuits. Dans ce protocole, l&#39;activité motrice a été contrôlé par des images de transmission de la contraction de la paroi de corps avec une caméra CCD. L&#39;activité des neurones moteurs avec des molécules de fluorescence sensibles au calcium (par exemple GCaMP) peut également être directement contrôlée tout en manipulant l&#39;activité neuronale avec ChR2 ou NPHR. Dans ce cas, l&#39;éclairage lumière bleue dans un vaste domaine et d&#39;une caméra CCD haute sensibilité (par exemple caméra EMCCD) sont utilisés au lieu d&#39;une lampe halogène et la caméra CCD normale précédemment décrits. Pour améliorer la résolution spatiale de la stimulation tout en surveillant le mouvement de la paroi corporelle, en utilisant une lentille d&#39;objectif supplémentaire peut être une méthode plus avancée: éclairement de la chaîne nerveuse ventrale par une lentille d&#39;objectif à grossissement élevé (par exemple, 40x) à partir de dessus de l&#39;échantillon et de contrôle de paroi corporelle par l&#39;objectif à faible grossissement (par exemple, 4 x) au-dessous de l&#39;échantillon. Ce système à double lentille peut nous permettre de stimuler le système nerveux en plus haute résolution spatiale. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Le protocole présenté ici peut être appliquée à d&#39;autres circuits neuronaux, outils optogénétiques fournies peuvent être exprimées dans le système nerveux et de préparation dans laquelle la lumière suffisante peut être livré dans le tissu neural peut être établie.

Locomotion avant péristaltique larves de drosophile se produit par la propagation de la contraction musculaire postérieure à partir de segments antérieurs. Ce mouvement est réalisé par l&#39;activation séquentielle des neurones moteurs au sein de la chaîne nerveuse ventrale le long de l&#39;axe longitudinal du corps. Pour examiner le circuit derrière cette activité de propagation motifs, perturbation locale de l&#39;activité neuronale pourrait être une approche informative. Bien test pharmacologique peut contrôler substance spécifique, comme neurotransmetteurs, dans le tissu neuronal, l&#39;effet des médicaments pharmacologiques peuvent être similaires entre les segments presque tous parce que le cordon nerveux ventral larvaire est structure répétitive composée de neuromères similaires le long de l&#39;axe longitudinal. Sinon, on pourrait exprimer optogenetic ou des molécules sondes sensibles à la température dans un petit nombre de segments. Toutefois, ces GAL4 lignes spécifiques sont très difficiles à générer. Nous présentons ici une méthode pour manipuler les neurones dans quelques segmentsments utilisant illumination laser. Profitant de l&#39;éclairage dans l&#39;espace confiné en microscopie confocale, on peut perturber l&#39;activité des neurones dans une région. Combiné avec le profil d&#39;expression de la sonde par sous-ensembles de GAL4 lignes spécifiques des neurones, cette méthode d&#39;illumination laser améliore considérablement la résolution spatiale de perturbation. Et parce que cette méthode ne nécessite qu&#39;un microscope confocal classique, l&#39;achat de matériel de laboratoire supplémentaire n&#39;est généralement pas nécessaire. Grâce à cette technique, nous avons examiné le rôle de l&#39;activité neuronale moteur lors de la propagation de sortie du moteur 13. En bloquant l&#39;activité des neurones moteurs dans quelques segments pendant le mouvement péristaltique, nous avons pu tester si l&#39;activité des neurones moteurs eux-mêmes est nécessaire pour la propagation du signal de sortie du moteur. Blocus locale et transitoire des neurones moteurs arrêté la propagation du mouvement péristaltique. Après le blocus a été enlevé, propagation est apparu sur le segment où la vague avait été arrêté. Ce phénomène suggère que, sans activation neuronale motrice, l&#39;onde de multiplication ne peut progresser le long de la chaîne nerveuse ventrale plus loin, et ainsi l&#39;activation des neurones moteurs est nécessaire pour le mouvement péristaltique. Nous avons précédemment rapporté des données détaillées et des discussions sur ce phénomène dans 13 Inada et al. (2011). Ici, nous décrivons la méthode de perturber l&#39;activité neuronale interactive tout en surveillant le mouvement des larves disséquées. En utilisant diverses GAL4 lignes et des séries de motifs spatio-temporels pour la manipulation de l&#39;activité, on peut enquêter sur un circuit logique à travers des propriétés de réponse de perturbation du circuit automobile.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td >Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BX61WI Microscope</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>BX61WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoview FV1000 confocal system</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>FV1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD camera</td>
 <td>Sony</td>
 <td>XCD-V60</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>all-trans retinal</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R2500-500MG</td>
 <td>200 mM stock in 95% EtOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silpot184</td>
 <td>Dow Corning Toray</td>
 <td>3255981</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

Drosophila larves de locomotion est un système modèle splendide de développement et physiologique neurosciences, en vertu de l&#39;accessibilité génétique des composants neuronaux sous-jacents dans les circuits 1-6. Demande de optogenetics 7,8 dans le circuit neuronal larvaire nous permet de manipuler l&#39;activité neuronale de manière spatialement et temporellement motifs 9-13. En règle générale, les spécimens sont largement éclairés par une lampe à mercure ou LED, donc la spécificité des neurones cibles est contrôlée par des systèmes d&#39;expression de gènes binaires tels que le système Gal4-UAS 14,15. Dans ce travail, afin d&#39;améliorer la résolution spatiale de «résolution sub-génétique», nous illuminés localement un sous-ensemble de neurones dans la moelle épinière ventrale utilisant des lasers mis en œuvre dans un microscope confocal classique. Tout en surveillant le mouvement de la paroi du corps des larves semi-intact, nous interactive activés ou inhibés activité neuronale avec channelrhodopsin 16,17 or halorhodopsine 18-20, respectivement. Par éclairage spatialement et temporellement limitée du tissu neural, on peut manipuler l&#39;activité des neurones spécifiques dans le circuit lors d&#39;une phase spécifique de comportement. Cette méthode est utile pour l&#39;étude de la relation entre les activités d&#39;un ensemble de neurones locale dans la moelle épinière ventrale et le modèle spatio-temporelle de la production automobile.

<html> Activation locale et transitoire des neurones moteurs avec ChR2. Nous avons exprimé ChR2 dans les neurones moteurs. Les axones des neurones moteurs émergeant de chaque projet de segment VNC à un segment correspondant de la paroi du corps. Lorsque nous avons stimulé un ou deux segments de la VNC avec un laser bleu, les muscles dans les segments correspondants exposés contractions (Figure 1). Inhibition locale et transitoire des neurones moteurs avec NPHR. Nous avons exprimé NPHR dans les neurones moteurs. Lorsque nous avons stimulé quelques (1 ~ 2) segments de la VNC avec un laser jaune pendant les contractions musculaires péristaltiques, l&#39;onde se propageant a été arrêté sur les segments correspondants de la paroi du corps (figure 2). Puis la vague redémarré à partir des segments arrêtés lorsque nous avons éteint l&#39;éclairage de laser 13. 50513fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figure 1 &quot;fo: content-width =&quot; 5,5 pouces &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Activation locale des neurones moteurs avec ChR2. A. Schéma de l&#39;activation locale de préparation filets. Par éclairage bleu-lumière de quelques segments de la moelle épinière ventrale exprimant ChR2 dans les neurones moteurs, les muscles dans les segments correspondants sont contractés (tête de flèche). B. images de transmission d&#39;une larve disséqué. Illumination locale de la corde nerveuse ventrale (flèche têtes) induit la contraction segmentaire des muscles de la paroi du corps (flèches). <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> Figure 2. Inhibition locale des neurones moteurs avec NPHR. A. Schéma de l&#39;inhibition locale de préparation filets. Par jaune-léclairage ight de quelques segments de la moelle épinière ventrale exprimant NPHR dans les neurones moteurs, la contraction des muscles pendant spontanément survenue mouvement péristaltique (tête de flèche en haut) sont détendus (tête de flèche dans le fond.) B. images de transmission d&#39;une larve disséqué . Éclairage local de la moelle épinière ventrale (pointes de flèches) a assoupli les segments de la paroi du corps spontanément sous contrat (flèches).

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Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Nous décrivons ici un protocole de manipulation optogenetic d&#39;activité des motoneurones, tout en surveillant les changements dans la production automobile (contraction musculaire) en semi-intactes<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves utilisant des lasers dans un microscope confocal classique. Cette technique permet aux chercheurs de réaliser perturbation locale de l&#39;activité neuronale dans quelques neuromères pour élucider la dynamique des circuits automobiles.

Optogenetic Perturbation de l&#39;activité neuronale avec illumination laser à semi-intactes<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K vues.  The University of Tokyo. Nous décrivons ici un protocole de manipulation optogenetic d'activité des motoneurones, tout en surveillant les changements dans la production automobile (contraction musculaire) en semi-intactes Drosophila Larves utilisant des lasers dans un microscope confocal classique. Cette technique permet aux chercheurs de réaliser perturbation locale de l'activité neuronale dans quelques neuromères pour élucider la dynamique des circuits automobiles.

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo laser axotomie en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Recherche

Neurosciences

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Méthodes locales et globales de l&#39;évaluation de nociception thermique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appétitive apprentissage olfactif associatif en<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Méthodes d&#39;enregistrement multi-unités pour caractériser l&#39;activité neuronale dans le Criquet (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt; Circuits olfactifs)

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimulation optogenetic de comportement de fuite en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Neural activité Propagation dans un hippocampe Préparation déplié avec un pénétrant Micro-réseau d&#39;électrodes

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracellulaires enregistrement de l&#39;activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Nouveau test pour froid dans nociception<em&gt; drosophile</em&gt; larves

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.