Ce travail a été financé en partie par le BBSRC (BB/1006478/1). PRR est le récipiendaire d&#39;une bourse de recherche de l&#39;Université Royal Society.

Une. Considérations stratégiques <ol><li> Le choix des semences cristaux utilisés pour des expériences de microseeding variera en fonction de l&#39;objectif de l&#39;expérience. Au début d&#39;un projet, il est utile de trouver plusieurs coups de cristallisation qui peuvent fournir des points de départ de rechange pour l&#39;optimisation de cristal. RMM réduit considérablement la nécessité pour l&#39;optimisation de cristal car les cristaux de bonne qualité sont plus susceptibles de se développer dans la zone métastable du diagramme de phase, c&#39;est à dire dans la région où après la perturbation ou la nucléation le système revient à l&#39;équilibre. Nous suggérons donc d&#39;utiliser RMM systématiquement dès que sont obtenus les premiers cristaux (ou, plus précisément, dès que les premiers cristaux cessent de croître). </li><li> Pour la première série de RMM, un stock de semences doit être faite avec autant de matière cristalline que possible. Si un seul bien est disponible qui contient des cristaux, ou si les cristaux sont petits, il peut être utile de mettre en place de multiples répétitions de lahit original (sans semis) pour augmenter l&#39;offre de cristaux. Si, cependant, on obtient des résultats différents de plusieurs, des cristaux d&#39;ensemencement peuvent être récoltées à partir de plusieurs conditions et mélangés ensemble. </li><li> Pour éviter une séparation de phase, les cristaux cultivés dans des conditions de haute teneur en sel doivent être récoltées séparément des cristaux cultivés dans des conditions de haute PEG. Si des cristaux à partir de plusieurs puits sont mélangés, une solution de réservoir qui est moins susceptible de donner des cristaux de sel doit être choisie pour la suspension d&#39;ensemencement. Par exemple, des concentrations élevées en phosphate, sulfate, calcium et magnésium doivent être évités. </li><li> Plus tard, dans un projet, il peut être important de chercher des cristaux de différentes cellules de l&#39;unité afin d&#39;améliorer la diffraction, éviter cristaux jumelés, et obtenir des cristaux qui sont appropriés pour des ligands de liaison. A ce stade, seuls les cristaux les plus appropriés (par exemple ceux qui diffractent meilleur) devraient être utilisés pour faire le stock de semences. Parfois tours répétés de microseeding sont nécessaires, où seul le «meilleur&quot;Cristaux sont utilisés pour faire le stock de semences pour le tour suivant. Si possible, une&quot; précipitation neutre &quot;tel que le PEG 3000 doit être utilisé pour suspendre les cristaux de semences pour encourager de nouveaux contacts de cristal et à cristalliser des complexes qui peuvent être instables en haut des solutions de sel-12. </li><li> Expériences de microseeding classique, où un état de cristallisation unique est utilisé, sont souvent utiles suite à l&#39;identification d&#39;une condition prometteuse et lors de l&#39;optimisation ultérieure. Il est souvent nécessaire de diluer le stock de semences afin d&#39;obtenir le nombre désiré de cristaux par goutte. Une expérience &quot;combinatoire&quot; de microseeding (où une série de stocks de semences de dilution croissante sont ajoutés à un état de cristallisation) est une méthode rapide pour trouver la dilution optimale du stock de semences. Cette approche est décrite ci-dessous. </li></ol> 2. Préparation de la semence Stock <ol><li> Faire une sonde en verre arrondi d&#39;une pipette Pasteur en verre à l&#39;aide d&#39;un bec Bunsen. <ol><li> Chauffer la pipette vers le milieu jusqu&#39;à ce qu&#39;elle devienne souple, puis retirez rapidement à partir de la flamme et le dessiner en tirant à part les extrémités. Objectif pour tirer vers le bas le verre à un diamètre inférieur à 0,25 mm. </li><li> Briser le verre à l&#39;endroit où il se situe autour de 0,25 mm et brièvement plonger l&#39;extrémité cassée dans la flamme. Répéter ce jusqu&#39;à ce qu&#39;un hémisphère de verre d&#39;un diamètre de ~ 0,75 mm est formé à l&#39;extrémité. Cette sonde est utile pour concassage matériau cristallin comme il est de taille appropriée pour la suppression des objets solides à l&#39;échelle 0,01-1,0 mm et ne pas endommager la surface plastique d&#39;une cristallisation plateau sous-ou bien lamelle. Grandes sondes (~ 1,0 mm) peuvent écraser les petits cristaux plus efficace parce que les cristaux sont piégés entre le verre et le plastique. </li></ol></li><li> Placez un tube de centrifugation de 1,5 ml contenant une graine perle sur la glace. </li><li> Inspecter un plateau de cristallisation pré-établie à l&#39;aide d&#39;un microscope binoculaire ou système d&#39;imagerie de cristal et sélectionnez un ou plusieurs appropriées puits du plateau à partir de laquelle récoltent matériau cristallin pour la génération du lot de plants. Tout matériau peut être utilisé y compris fines aiguilles, sphérolites, microcristaux et irréguliers, des cristaux mal formés. Le stock de semences doit être effectué dès que possible après que les cristaux cessent de croître, comme matériau âgée est plus susceptible d&#39;être partiellement réticulé, réduisant ainsi son aptitude à l&#39;emploi dans les expériences d&#39;ensemencement. En cas de doute quant à savoir si le matériau cristallin à récolter est un sel ou une protéine du puits peut être visualisé en utilisant un microscope à fluorescence UV ou d&#39;un système de formation d&#39;image avant l&#39;ouverture, ou le matériau cristallin peut être soumis à in-situ de l&#39;analyse par diffraction des rayons X. dans le bac. Lorsque vous utilisez les anciens cristaux de protéines d&#39;approche sera fluorescence sous irradiation UV, les cristaux de sel apparaîtront incolore. </li><li> Ouvrez le plateau de cristallisation choisi bien. Pour 96 puits assis plateaux de chute couper à travers la feuille d&#39;étanchéité supérieure en plastique autour du bien sélectionné USIng d&#39;une lame de scalpel. Pour 24 puits plateaux de goutte suspendue enlever la lamelle à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces. Inversez la lamelle et placez-le sur une surface propre stable. Retirer 50 pi de la solution de réservoir et de transférer ce liquide dans le tube à centrifuger contenant la perle de semences en sorte que le tube reste de la glace tout au long. </li><li> Écraser soigneusement les cristaux dans le subwell (bac 96 puits) ou lamelle (plateau de 24 puits) diminue, en utilisant la sonde de verre préparé dans la section 2.1, l&#39;affichage des résultats sous un microscope. Petits cristaux peuvent prendre plusieurs minutes pour écraser complètement. Cette étape permet à l&#39;expérimentateur de vérifier que les cristaux sont faciles à broyer et ne sont donc pas réticulé, et également qu&#39;ils ne sont pas des cristaux de sel. Les cristaux de sel produisent un clic distinctif qui peut être entendu et ressenti quand ils sont écrasés. Si les cristaux sont durs et difficiles à broyer essayer d&#39;obtenir et d&#39;utiliser des matériaux plus frais. </li><li> Retirer 5 ul de la solution du réservoir à partir du tube de la perle de semences et transfert à la même sous-équivalent (assis expérience de la goutte), ou lamelle couvre-objet (suspendus expérience de la goutte) contenant le matériau cristallin à être récoltées. Introduire à la pipette ce liquide de haut en bas 5-6 fois pour remettre en suspension comme la plupart des sous-puits ou lamelle contenu que possible. Retour à la suspension de tube de perle de semences et répéter cette étape deux fois plus, veiller à ce que le maximum de matière cristalline est récolté que possible. </li><li> Vortex la perle de semences pendant deux minutes, l&#39;arrêt toutes les 30 secondes pour refroidir le tube sur la glace. </li><li> Faites une série de dilution, la dilution du stock de graines dans une solution de réservoir par un facteur de 4 à 10 à chaque étape. En règle générale, trop de cristaux seront obtenus en utilisant un stock de semences non dilué, donc à utiliser les stocks de semences dilué pour contrôler le nombre de cristaux par puits. Au premier tour de RMM, il est important de ne pas diluer la solution stock de semences, car plus la concentration de graines les plus de coups de cristallisation seront obtenus. </li><li> Si ce n&#39;est pas pour être utilisés immédiatementment, transférer le stock de semences suspension et le stock de semences dilué à -20 ° C ou -80 ° C congélateur pour le stockage. Pour éviter des cycles répétés de gel-dégel, ce qui peut réduire l&#39;efficacité du stock de semences, entreposer ce produit dans de petites fractions de volume, c&#39;est à dire 10-20 pi. Une fois congelés, les stocks de semences peuvent être conservées indéfiniment jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> 3. Création de cristallisation Plateaux <ol><li> En fonction de la disponibilité des moyens de cristallisation et les préférences de l&#39;expérimentateur, le criblage de cristallisation RMM peut être effectuée en utilisant soit des plateaux à 24 puits employant la méthode de diffusion en phase vapeur goutte suspendue, ou des plateaux à 96 puits en utilisant la méthode de la chute de la diffusion de vapeur assise. plateaux de cristallisation pour RMM peuvent être établis à la main, en utilisant un distributeur de manutention robotisé liquide, ou une combinaison des deux. </li><li> Une expérience typique de RMM mis en place par la main comprendra, 1.0 solution de protéine pi, 1,0 pi état de cristallisation, et0,5 pi stock de semences. Une expérience typique mis en place à l&#39;aide d&#39;un robot de cristallisation comprendra, solution de protéine de 0,3 pi, 0,2 pi état de cristallisation, et 0,1 semences pi actions. </li><li> Pour effectuer le dépistage des RMM dans 24 puits suspendus plateaux d&#39;abandon, d&#39;une part, à l&#39;aide d&#39;une pipette manuelle, transférer 300 pl de chaque état de 96 puits écran état de cristallisation dans 10 ml de format de tube unique dans chaque puits de 4 x 24 puits cristallisation lubrifiées en usine plateaux. <ol><li> Transférer 1 ul de chaque condition de cristallisation dans chaque réservoir 300 pl sur la surface d&#39;une lamelle couvre-objet en plastique correspondante à partir de laquelle les deux bandes de renfort de protection avant et arrière ont été enlevés. </li><li> Pour les 1 pl de chaque condition de cristallisation ajouter 1 pl de solution de protéine suivie par 0,5 pi de cristal stock de semences. Inverser chaque lamelle couvre-objet de telle sorte que la goutte de liquide est orienté vers le bas et la position au-dessus du puits approprié. </li><li> Appuyez vers le bas sur la lamelle, la compression de la Sealing graisse et formant un joint sûr. Une fois que toutes les gouttes 96 sont établis, le plateau doit être transféré à un incubateur ou une chambre à température constante, habituellement dans la gamme de 4 à 18 ° C pour le stockage. </li></ol></li><li> Pour effectuer le dépistage des RMM dans 96 puits assis plateaux de déposer tout d&#39;abord transférer 20-50 pi de chaque état de 96 puits écran état de cristallisation en format bloc de puits profond dans chaque puits correspondant du plateau de cristallisation. Cette étape de transfert peut être effectué en utilisant soit un robot de cristallisation, ou par un transfert manuel à l&#39;aide d&#39;une pipette à 8 canaux. <ol><li> réservoir de transfert, de protéines et de semences d&#39;solutions aux gouttes à la main ou avec un robot en utilisant les volumes détaillés au paragraphe 3.1. Certains robots de cristallisation disponibles dans le commerce ne sont pas en contact distribution, et les graines de transfert d&#39;actions performant utilisant un tel système peut entraîner un blocage de la distribution de conseil ou tuyauterie associée. L&#39;ordre de distribution est variable: certains robots dispensent toutes les solutions simultanément. Sice n&#39;est pas possible, passer la protéine d&#39;abord, puis le réservoir, puis les stocks de semences. </li><li> Si un contact de distribution de robot n&#39;est pas disponible transfert des graines à l&#39;aide d&#39;une seringue en verre à faible volume munie d&#39;une aiguille émoussée. Rincer l&#39;aiguille en la faisant passer à travers la solution du réservoir, puis distribuer le stock de semences dans chaque goutte. </li><li> Sceller le plateau à l&#39;aide d&#39;une feuille d&#39;étanchéité transparent et le transférer à un incubateur ou une pièce à température constante pour le stockage. </li></ol></li></ol> 4. Inspection de cristallisation Plateaux <ol><li> Visualiser l&#39;ensemble des expériences de cristallisation à l&#39;aide soit d&#39;un microscope binoculaire ou d&#39;un système de formation d&#39;image à cristal. L&#39;ancien permet généralement à l&#39;utilisateur plus de contrôle sur la profondeur de vue et le degré d&#39;agrandissement de ce dernier, mais prend plus de temps. </li><li> Inspecter chaque sub-well/coverslip en séquence et enregistrer des preuves de la formation de cristaux. Les expériences doivent être inspectés une fois toutes les 24 heures pendant 5 jours après l&#39;établissement et lan puis une fois tous les 7 jours pour un maximum de 4 semaines. </li><li> Plusieurs cycles de RMM sont souvent nécessaires avant cristaux optimal de qualité de diffraction sont produites. </li></ol>

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Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Dans cet article, nous avons décrit une méthode générale pour RMM protéine dépistage de cristallisation. Nous avons démontré à l&#39;aide de deux protéines de test un d&#39;amélioration significative du taux de succès de la cristallisation en utilisant cette méthode. analyse de diffraction en utilisant le rayonnement synchrotron d&#39;un sous-ensemble de cristaux générés en utilisant les RMM et les méthodes non-RMM a révélé peu de variation dans la qualité de diffraction entre les cristaux cultivés...

De sa demande initiale par Perutz, Kendrew et collègues dans la détermination des structures de l&#39;hémoglobine et la myoglobine, les haut débit pipelines modernes automatisés de la génomique structurale consortiums, macromoléculaire cristallographie aux rayons X nous a offert un aperçu structurel sans précédent dans le monde de la protéine . Cette technique reste le procédé le plus largement applicable expérimental qui permet la visualisation directe de la structure des protéines à atomique, ou à proximité de résolution atomique (c&#39;est à dire dans la gamme de 1-3 Å). Une condition préalable à la diffraction des rayons X pour être appliqué à une protéine est qu&#39;elle doit d&#39;abord être cristallisé, et c&#39;est cette étape du processus qui reste le plus grand pas unique limitant la vitesse dans la détermination de la structure par des méthodes de diffraction 1, 2. Malgré des avancées significatives dans la compréhension du processus de cristallisation des protéines, et des améliorations majeures dans la qualité et la disponibilité des écrans de cristallisation,plateaux, et les technologies connexes, il reste impossible de prédire de façon fiable la probabilité de succès de cristallisation 3. Méthodes biochimiques et biophysiques peuvent être appliqués pour déterminer si une protéine d&#39;intérêt affiche des caractéristiques favorables pour la nucléation et la croissance cristalline, c&#39;est à dire qu&#39;il est ainsi pliée, homogène, monodisperse, etc, cependant, ces indications en aucun cas fournir un indicateur définitif de cristallisation propension. L&#39;ensemencement a longtemps été censé être une méthode viable pour améliorer le nombre, la taille et la qualité des cristaux existants ou matériau cristallin 4-7. Cette approche est basée sur l&#39;hypothèse qu&#39;une condition qui favorise la nucléation des cristaux peut ne pas être optimal pour la croissance cristalline ultérieure et vice versa. En transférant le matériau nucléé d&#39;un état à un autre, on peut tenter de découpler efficacement ces processus, donnant ainsi accès à un nouvel espace de cristallisation, encore inexploré,et par conséquent d&#39;augmenter le taux de réussite globale d&#39;une expérience de criblage. Méthodes établies ont été documentés pour (i) macroseeding, le transfert d&#39;un monocristal dans son intégralité d&#39;un état ​​à un autre 8, (ii) l&#39;ensemencement série, le transfert de matériau nucléé, généralement obtenu par l&#39;application d&#39;une pression directionnelle en utilisant par exemple la trichite d&#39;un chat de la surface d&#39;un cristal existant, suivi d&#39;un passage ultérieur de la moustache grâce à une nouvelle goutte de cristallisation 9, et (iii) microseeding &quot;classique&quot;, le transfert de cristal «graines», générés par la récolte broyé cristaux (ou cristallin matériel), dans des conditions similaires à celles qui ont donné les graines 10. Notamment tous les trois de ces méthodes sont longues et peu évolutive, certainement en comparaison à ce qui est réalisable avec la robotique moderne de cristallisation de manipulation des liquides. Ces facteurs ont contribué, à un certain niveau au moins, à la perception que les semencesING est une méthode pour être visité uniquement lorsque les autres approches ont échoué à porter ses fruits. Aléatoire matrice microseeding (RMM) est une innovation méthodologique récente qui combine les avantages de microseeding traditionnelle avec ceux de criblage à haut débit et l&#39;évolutivité 11-13. Cette approche repose sur la génération d&#39;un stock de semences, produit à partir de matière cristalline nucléée, qui peut être répartie dans / sur chaque sub-well/coverslip dans un écran de cristallisation 96 condition standard. Cette méthode est applicable à tous les deux assis ou suspendus expériences de diffusion de vapeur à goutte, établis à la main ou à l&#39;aide de la robotique de manipulation des liquides, dans 24 puits ou format de plaque de 96 puits. RMM a été démontré expérimentalement à augmenter de manière significative le taux de réussite de cristallisation, et produire des cristaux de meilleure qualité et la quantité de diffraction 11, 13, 14, et représente un outil novateur dans l&#39;arsenal des cristallographes d&#39;approches dans l&#39;oNgoing effort vers la réussite de cristallisation. Nous décrivons ici une méthode générale pour RMM et fournissons des exemples de données illustrant l&#39;efficacité de cette technique.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Aléatoire de dépistage de la matrice de microseed (RMM) est une technique de cristallisation de protéines dans lequel des cristaux de semences sont ajoutés aux écrans aléatoires. En augmentant la probabilité que les cristaux se développer dans la zone métastable du diagramme de phases d&#39;une protéine, fils de cristallisation supplémentaires sont souvent obtenus, la qualité des cristaux obtenus peut être augmentée, et une bonne alimentation des cristaux pour les expériences de collecte de données et de trempage est fourni. Nous décrivons ici une méthode générale pour RMM qui peuvent être appliquées soit à goutte assis ou suspendus expériences de diffusion de vapeur à goutte, établis à la main ou à l&#39;aide de la robotique de manipulation des liquides, dans 96 puits ou format de plateau de 24 puits.

(A) Exemple d&#39;une expérience RMM Pour démontrer l&#39;efficacité du dépistage RMM nous avons appliqué cette méthode à la cristallisation de poule lysozyme d&#39;oeuf blanc (HEWL) et foie de bovin catalase (BLC). Ces deux enzymes sont éminemment cristallisable et sont structurellement bien caractérisés des cibles 15, 16. En tant que tel à la fois de fournir d&#39;excellents sujets d&#39;essai avec qui pour illustrer le taux de réussite de cristallisation accrue réalis...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Nous décrivons ici une méthode générale pour le dépistage aléatoire de la matrice de microseed. Cette technique est illustrée à augmenter de manière significative le taux de dépistage des expériences de cristallisation de protéines de succès, de réduire le besoin pour l&#39;optimisation, et de fournir un approvisionnement fiable de cristaux pour la collecte des données et expériences ligand-trempage.

Améliorer le taux de réussite de cristallisation de protéines par hasard Microseed Matrice dépistage

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.7K vues.  University of Bristol.  Nous décrivons ici une méthode générale pour le dépistage aléatoire de la matrice de microseed. Cette technique est illustrée à augmenter de manière significative le taux de dépistage des expériences de cristallisation de protéines de succès, de réduire le besoin pour l'optimisation, et de fournir un approvisionnement fiable de cristaux pour la collecte des données et expériences ligand-trempage. 

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Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Recherche

Biologie

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Détection des métalloprotéinases matricielles fonctionnelle par zymographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Simple reconstruction microscopie électronique de particules du complexe Exosome Utilisation de la méthode aléatoire Tilt conique

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

Préparation de la recombinaison de protéines Mgm101 par la stratégie de marquage MBP basée

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

L&#39;échelle du génome interaction protéine-protéine Le dépistage par Protein-fragment complémentation Assay (PCA) dans les cellules vivantes

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...