Les auteurs tiennent à remercier leurs collègues et le personnel des laboratoires présents et passés qui ont soutenu le développement de cette technique. Le laboratoire de SP est soutenu par l&#39;Institut canadien de recherche en santé Subvention de fonctionnement MOP-84473 et Alberta Innovates-Health Solutions (financés par l&#39;Alberta Heritage Foundation for Medical Research Fonds de dotation). PDD a été soutenue par les Instituts nationaux de la santé accorde MD001091-01 et GM068855-02.

Une. Préparation de cultures bactériennes, Outils et réactifs (JOUR 1, après-midi) <ol><li> En fin d&#39;après midi, inoculer 1-5 ml de bouillon LB autoclave dans stérile (par exemple, 100 x 13 mm) des tubes à essai en verre borosilicate avec une petite aliquote de bactéries (E. coli ou V. cholerae). </li><li> Définissez les tubes à essai inoculés dans un tambour de rouleau logé à 37 ° C la température (ambiante ou chaude incubateur), tourner sur le tambour de rouleau à grande vitesse, et incuber O / N. </li><li> Préparer un épandeur de cellule sous la forme d&#39;un &quot;crosse de hockey&quot; à partir d&#39;une tige de verre en chauffant le milieu de la tige dans la flamme d&#39;un brûleur Bunsen jusqu&#39;à ce que le verre se ramollit et ensuite diriger le pli en douceur avec des ciseaux ou des pinces dans un angle de 135 ° . Chauffer la tige une fois de plus dans le point milieu entre l&#39;extrémité et la première courbure et la plier à un angle de 45 ° vers l&#39;intérieur (dans le sens inverse de la première courbure). </li><li> Préparer LB-agar sans antibiotiques et verser dans des boîtes de Pétri dans la préparation de laprotocole electrocompetence, et LB-agar plaques contenant l&#39;antibiotique approprié (selon le marqueur de résistance du vecteur à une électroporation), et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer un filtre stérilisé 2 mM de CaCl2 solution de V. cholerae, ou autoclave trou DDH 2 O pour E. coli, et conserver à 4 ° C. </li></ol> 2. La croissance de bactéries électrocompétentes (JOUR 2 Matin) <ol><li> Livrer 100 pi de la culture bactérienne O / N sur chaque plaque de gélose LB, les stocks de glycérol congelés peuvent également être utilisés et livrés directement sur la plaque. </li><li> Trempez hockey en forme de bâton cellule épandeur dans EtOH à 100%, les égoutter brièvement et brûler la EtOH restant à stériliser avant utilisation et la diffusion. Diffuser la culture bactérienne 100 pi O / N uniformément avec l&#39;épandeur de cellules de verre stérile veillant à ne pas perturber (pause) la surface de la gélose. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 4-6 heures, ou jusqu&#39;à ce que une pelouse fine de la croissance bactérienne soitvient distinguer. Les cellules sont les plus compétents lors de la croissance active. </li></ol> 3. Préparation des cellules électrocompétentes bactériennes (JOUR 2, après-midi) <ol><li> Récolter les bactéries avec une anse stérile veillant à ne pas percer ou couper la surface de l&#39;agar-agar. Une masse bactérienne de 2 mm de diamètre est suffisant pour une seule transformation. Typiquement, cela nécessite de raclage de la surface de la pelouse mince avec la boucle d&#39;inoculation deux ou trois fois. Plusieurs échantillons (typiquement entre 4-6) peuvent être collectées à partir de la même plaque. </li><li> Reprendre la masse bactérienne dans 1 ml de glace-froid CaCl2 2 mM (pour V. cholerae) ou le trou DDH 2 O stérile (pour E. coli) et bien mélanger jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y touffes sont visibles, garder sur la glace. </li><li> Centrifugeuse de chaque suspension bactérienne pendant 5 min à 5000 xg dans une microcentrifugeuse réfrigérée réglé à 4 ° C, ou dans une micro stockés dans une chambre froide réglé à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant, resuspterminer le culot bactérien dans le même volume de glacé 2 mM de CaCl2 ou le trou DDH 2 O stérile, et répéter l&#39;étape de centrifugation fait avant que deux fois supplémentaires pour un total de trois lavages. </li><li> Retirer le surnageant, remettre en suspension, puis desserrer le culot bactérien en détail dans 40 ul glacée CaCl2 2 mM stérile ou le trou DDH 2 O et garder sur la glace. </li></ol> 4. Transformation des bactéries électrocompétentes (JOUR 2, après-midi) <ol><li> Ajouter jusqu&#39;à 1 pg d&#39;ADN plasmidique (jusqu&#39;à 1 ul d&#39;eau ou de tampon Tris-EDTA) à la suspension bactérienne 40 pi et le transfert de ce mélange dans un pré-réfrigérés, stérile 0,2 cm d&#39;écart cuvette. La concentration en sel dans l&#39;échantillon d&#39;ADN doit être un peu, car elle contribue à arc électrique de l&#39;impulsion dans l&#39;étape suivante. </li><li> Insérer la cuve dans la chambre d&#39;électroporation du module de commande d&#39;impulsion, et l&#39;électroporation à 1,8 kV, 25 uF. La constante de temps doit être ~ 5,0 msec, et ne doit se produire un arc électrique. </li><li> Récupérer rapidement la suspension cellulaire par remise en suspension dans 1 ml de bouillon LB et transférer dans un tube à essai en verre borosilicate préalablement autoclave. </li><li> Laisser les cellules se rétablir en incubant dans des conditions de croissance gazeuses (dans un rouleau tambour) à 37 ° C pendant 30 min sans sélection par antibiotique. </li><li> Plaquer les bactéries sur les plaques de gélose LB préalablement préparés en présence de l&#39;agent sélectif approprié (antibiotique), et incuber à 37 ° CO / N. Si les bactéries sont transformées avec une concentration élevée de vecteur purifié (0,1 à 1 ug de plasmide superenroulé), délivrer 10 pi de culture bactérienne sur le bord de la plaque de gélose LB et avec une anse d&#39;inoculation strie stérile pour obtenir des colonies isolées en utilisant la méthode de la série de quadrant. Si le mélange de ligation a été transformé, livrer 100 ul de la culture bactérienne sur chaque plaque d&#39;agar et uniformément réparties avec le répartiteur de cellule en verre stérilisée. </li></ol> a Si la constante de temps est court (êtrefaible 3,5 ms), ou pulsation conduit à arc, puis re-précipiter l&#39;échantillon d&#39;ADN, laver avec de l&#39;EtOH à 70% deux fois pour éliminer les sels avant le séchage et la remise en suspension dans du tampon TE.

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

Aucune déclaration sont applicables.

L&#39;efficacité de transformation est soumise à une variété de facteurs, quelle que soit la méthode employée pour préparer des cellules compétentes. Les variables analogues s&#39;appliquent à cette méthode, un grand soin doit être pris une fois que les cellules sont récoltées à partir de la plaque de gélose telle sorte qu&#39;elles sont maintenues à la température froide constante (pas supérieure à 4 ° C). La pelouse bactérienne doit être en croissance active au moment de la collecte, les cellules doivent être en phase mi-logarithmique de croissance. La qualité de l&#39;ADN (c&#39;est à dire la contamination des sels) influe sur l&#39;efficacité de transformation. Plus précisément, lorsque l&#39;on utilise cette méthode, l&#39;agar-agar ne doit pas être décomposé sous forme de fragments de gélose dans la cuvette se produire un arc électrique de l&#39;impulsion. La plupart des problèmes rencontrés avec cette technique sont associés à deux questions; collecter les bactéries au cours de la fenêtre de temps voulue de la plaque de gélose quand elles sont en croissance active. Collecte trop tôt donnera le nombre de cellules insuffisants et rendra laracler la plaque de gélose LB frustrant parce que la &quot;pellicule&quot; qu&#39;ils forment est difficile à décoller de la surface de la plaque. Collecte des bactéries trop tard diminueront considérablement leur compétence. La fenêtre de temps va naturellement varier en fonction de la densité de l&#39;inoculum plaquées sur des plaques de gélose LB. La deuxième étape est critique pour maintenir la bactérie à froid (4 ° C) à partir du moment où elles sont soulevées hors de la plaque d&#39;agar et remises en suspension dans du CaCl2 ou le trou DDH 2 O jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient étalées sur de la gélose LB transformation suivante. Les tubes à centrifuger contenant les bactéries, les cuvettes et le tampon doivent être pré-refroidi et conservé dans la glace en tout temps jusqu&#39;à ce que les bactéries sont étalées. Toutefois, d&#39;autres problèmes peuvent survenir lorsque le trou DDH 2 O stérile ou CaCl2 contiennent précipité ou sont contaminés. Pour cette raison, nous recommandons de préparer ce réactif frais. transformation de dépannage est facilitée par y compris les contrôles lors de la transformation bacteria rendue compétente par toute méthode. Un contrôle négatif constitué d&#39;un lot de bactéries compétentes non transformées étalées sur une plaque de gélose LB contenant le marqueur sélectif va rapidement aider à déterminer si l&#39;antibiotique sur la plaque est efficace. Une transformation de contrôle positif avec une préparation de plasmide connu de bonne qualité et la quantité hébergeant le même marqueur sélectif que l&#39;échantillon expérimental sera utile pour déterminer si les bactéries sont compétents, mais aussi si l&#39;ADN transformé expérimental était en quantité suffisante ou de qualité. Les avantages de cette technique sont multiples, le procédé peut être effectué dans la même journée que la transformation est prévue pour. Nous avons constaté que le glycérol congelés bactérienne actions peut être plaqué directement sur la gélose LB sans aucune perte de electrocompetence, nous l&#39;avons fait dans des situations «d&#39;urgence» (après avoir oublié de commencer la culture de la nuit la veille). Bien que nous n&#39;avons pas pu tester etrès souche connue, tout E. coli ou de V. souche cholerae qui peut être transformée par électroporation a été prête à ce protocole dans nos mains. La technique est rapide, efficace, et les rendements de transformation efficacité comparables à ceux obtenus à partir de la préparation de bactéries électrocompétentes employant des méthodes traditionnelles. La méthode élimine la nécessité pour centrifugeuse à grande vitesse et rotors associés, un agitateur incubateur orbital et seaux à centrifuger stériles (conteneurs), et de grands volumes de tampon autoclave. Bien que le tableau des réactifs et des équipements spécifiques est assez complet, la plupart des laboratoires qui effectuent électroporation auront la plupart, sinon la totalité, de ces matériaux déjà disponibles. Peut-être plus important encore, la technique peut être facilement appliquée à générer des souches electrocompétentes spécifiques du laboratoire avec les milieux mutants rapidement. Nous ne sommes pas conscients des limitations de cette technique car elle a remplacé la méthode traditionnelle de préparation des électrocompetent bactéries dans nos laboratoires. Les résultats de nos expériences montrées ici ont été réalisées avec des cellules électro-compétentes fraîches produites avec la méthode traditionnelle qui avaient été stockés à -80 ° C pendant une durée de 1 semaine. Toutefois, les stocks de cellules électrocompétentes congelées perdent la compétence et la viabilité ou sur de longues périodes de stockage. Notre protocole abrégée permet la préparation de cellules électro frais le jour même de la transformation est prévue sans préoccupations au sujet de l&#39;âge du stock qui peut entraîner un rendement transformant diminué. Nous n&#39;avons pas essayé le stockage des cellules électrocompétentes produites en utilisant la méthode rapide pour une utilisation sur un autre jour que cela n&#39;a pas été nécessaire. Bien que non représenté ici, l&#39;efficacité des cellules électrocompétentes préparés en utilisant notre méthode rapide est suffisante pour les mélanges de ligature. Les transformations signalés pour non-O1 V. cholerae dans un article récent de Unterweger et al.17 ont été réalisées en utilisant des bactéries électrocompétentes préparés par le procédé décrit ici (sauf ceux effectués par conjugaison). Cette technique permet aux chercheurs de transformer des souches mutantes ayant des antécédents rapidement et efficacement sans avoir à préparer de grands lots de cellules. Cette préparation rapide de la méthode de bactéries électrocompétentes pourrait être adapté à d&#39;autres procaryotes qui ont été montrés à se prêter à l&#39;électroporation que le principe de préparation et les paramètres d&#39;électroporation vont être les mêmes que celles des protocoles traditionnels.

Depuis sa &quot;création au début des années 1980 1, l&#39;électroporation est devenue une technique de biologie moléculaire intégrante, probablement la méthode la plus couramment utilisée pour transformer / transfecter des cellules vivantes avec des acides nucléiques circulaires ou linéaires. Développé à l&#39;origine pour la transfection de cellules eucaryotes 1, électroporation a été ensuite adapté pour la transformation de E. coli 2, 3. En bactériologie, l&#39;électroporation est devenu le standard de laboratoire et a été modifié pour transformer un large éventail de bactéries, y compris Pseudomonas Gram négatif 4, salmonelles 5, vibrions 6, Serratiae, et Shigella 7; Clostridium Gram positif 8, bacilles 9, lactobacilles 10 et entérocoques 11. Même certains Archaebacteria ont été influencées par la transformation par électroporation, y compris Methanococci </em&gt; 12 et de l&#39;espèce Sulfolobus 13. Pour un examen complet s&#39;il vous plaît se référer à Aune et Aachmann 14. L&#39;efficacité de la transformation par électroporation est censément 10-20 fois plus élevée que la compétence chimique ou choc thermique 2. Cependant, tout comme la préparation de bactéries de la compétence chimique optimisée par Douglas Hanahan dans les années 1980 15, les cellules doivent également être prêts à être électrocompétent. L&#39;électroporation est un moyen rapide et efficace pour la transformation bactérienne, ce qui nécessite des bactéries électrocompétentes, de l&#39;ADN purifié, un module de commande d&#39;impulsions qui délivre l&#39;impulsion électrique, et une chambre qui reçoit les petites cuvettes jetables qui fonctionnent comme une électrode. En bref, le froid, les bactéries compétentes sont mélangés avec de l&#39;ADN plasmidique, soumises à une impulsion de haute tension dans une cuvette, remis en suspension dans un milieu de croissance, on incube à 30-37 ° C pendant 30-45 min, puis étalées sur milieu semi-solide (gélose nutritive plaques) avec l&#39;appropriate antibiotique sélectif. A la différence de l&#39;étape de pulsation, la préparation de électrocompétentes E. coli reste une procédure en plusieurs qui est traditionnellement réalisée dans des volumes importants. En bref, une culture d&#39;une nuit de bactéries est inoculée dans une fiole d&#39;Erlenmeyer de 100 ml à 1 litre de bouillon de Luria (LB), cultivées jusqu&#39;à la phase mi-logarithmique de croissance (DO600 &lt;1,0), et soumis à des lavages en série avec un non stérile ionique tampon ou de l&#39;eau distillée deux fois (le trou DDH 2 O) dans la diminution des volumes à 4 ° C. Un grand soin doit être pris pour maintenir les cellules à froid tout au long de la procédure entière, et d&#39;éviter toute contamination. Cela nécessite l&#39;utilisation de godets de centrifugation de l&#39;autoclave et des tampons non-ioniques ou des trou DDH 2 O, un agitateur incubateur orbital, un volume important à grande vitesse centrifugeuse réfrigérée et un ensemble de rotors. Les bactéries sont finalement remises en suspension dans un petit volume de tampon additionné de 10% de glycerol et aliquotes dans des volumes de 40 ~ ul, which sont stockés à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Stockage à basse température se traduit souvent par des efficacités de transformation a diminué en raison de la perte de viabilité dans le temps. Électrocompétentes cellules bactériennes sont également disponibles à partir d&#39;une variété de sources commerciales, mais seulement pour un nombre limité d&#39;(souvent recombinaison déficient) E. coli souches couramment utilisées comme hôtes pour propager une large gamme de plasmides. En conséquence les chercheurs s&#39;appuient sur des méthodes internes pour préparer leurs propres souches / mutants pour la transformation. Une alternative, le protocole rapide et efficace pour la préparation d&#39;électrocompétentes E. coli a été utilisé par quelques laboratoires de bactériologie moléculaire depuis un certain temps et a été étendu à des bactéries à Gram négatif supplémentaires, dans notre cas V. cholerae. L&#39;initiateur de protocole ne peut pas être identifié comme il a été optimisée par d&#39;autres chercheurs dans le temps. La méthode présentée ici a été utilisé dans notre laborators pour près de deux décennies, et notre objectif est de partager ce protocole utile avec nos pairs.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

L&#39;électroporation est devenue une méthode largement utilisée rapidement et efficacement pour introduire un ADN étranger dans une large gamme de cellules. Électrotransformation est devenue la méthode de choix pour l&#39;introduction d&#39;ADN dans des procaryotes qui ne sont pas naturellement compétentes. L&#39;électroporation est un procédé de transformation rapide, efficace et simplifié qui, en plus de l&#39;ADN purifié et des bactéries compétentes, nécessite de commande disponible dans le commerce et des cuvettes d&#39;impulsions gène. A la différence de l&#39;étape de pulsation, à la préparation de cellules électro-compétentes prend du temps et de main-d&#39;oeuvre impliquant des cycles répétés de centrifugation et lavages en diminuant le volume de l&#39;eau froide stérile, ou des tampons non-ioniques de grands volumes de cultures cultivées jusqu&#39;à la phase semi-logarithmique de croissance. Temps et d&#39;efforts peuvent être enregistrés par l&#39;achat de cellules électrocompétentes de sources commerciales, mais le choix est limité à couramment employé E. des souches de laboratoire coli. Nous diffusons présente un rapide etméthode efficace pour préparer électrocompétent E. coli, qui a été utilisé par les laboratoires de bactériologie pendant un certain temps, peut être adapté à V. cholerae et autres procaryotes. Bien que nous ne pouvons pas déterminer qui au crédit pour le développement de la technique originale, nous présente le rendre accessible à la communauté scientifique.

Nous avons effectué une série de transformations avec E. coli et V. cholerae transformation pour comparer l&#39;efficacité de notre méthode rapide avec une adaptation de la méthode (traditionnelle) décrit à l&#39;origine par Dower et al. 2 pour la préparation de bactéries électro-compétentes. Pour effectuer la préparation traditionnelle de cellules compétentes, 500 ml de LB dans un flacon d&#39;Erlenmeyer de L-2 ont été inoculées avec 500 ul de culture d&#39;une nuit de E. coli DH5a ou V. cholerae O395, incubés dans un agitateur orbital (215 rpm à 37 ° C) et récoltées à une DO 600 de 0,5 à 1,0 entre. Le ballon a été refroidi sur de la glace et les cultures centrifugé dans un rotor pré-réfrigéré à 4000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Les culots cellulaires ont été remis en suspension soigneusement dans 500 ml refroidi à la glace de 2 mM de CaCl2 pour V. cholerae et le trou DDH 2 O pour E. coli, et on centrifuge de nouveau dans les mêmes conditions. Les rondes subséquentes de la remise en suspension uned centrifugation ont été réalisés dans la diminution des volumes de 200 ml et 100 volumes en s&#39;assurant que la culture est restée réfrigérée à 4 ° C. Enfin, une remise en suspension et centrifugation dans un volume de 10 ml a été réalisé avec 10% de glycerol. Le culot final a été remis en suspension dans 2 ml de glycerol à 10% et 40 uL d&#39;aliquotes ont été congelées à -80 ° C et stocké non plus d&#39;une semaine avant l&#39;électroporation. conditions d&#39;électroporation incluant des paramètres d&#39;impulsion et la taille de la cuve étaient identiques pour les deux espèces de bactéries dans tous les électroporations quelle que soit la méthode de préparation de cellules compétentes. La seule différence, c&#39;est que nous avons effectué les lavages dans le trou DDH 2 O froid pour E. coli et froide 2 mM de CaCl 2 pour V. cholerae. Tableau 1 montre les résultats de bactéries transformées par électroporation à l&#39;identique mais rendues compétentes, soit avec le protocole rapide ou avec la méthode traditionnelle. Nous avons utilisé la souche O395 et DH5a comme communement utilisés, des souches représentatives de V. cholerae et E. coli, respectivement, des résultats similaires peuvent être obtenus avec d&#39;autres souches de la même espèce (mais pas tous souche unique a été testée) et probablement adaptées à d&#39;autres bactéries à Gram négatif et probablement au-delà. Pour vous assurer que le nombre de cellules égales étaient présents dans chaque lot pulsé, bactéries électrocompétentes générés en utilisant la méthode rapide ont été réunies lors de la collecte, mixte tenue homogène suspendus, et aliquotées en 40 volumes ul peu de temps avant l&#39;électroporation. Bactéries électrocompétentes générés en utilisant la méthode traditionnelle ont été traités de la même avant la congélation en 40 aliquotes. Après la livraison de l&#39;impulsion, chaque lot de 40 ul de bactéries par électroporation a été mis en suspension dans 400 ul de LB et dilué en série 01:10. Cent microlitres de chaque dilution ont été étalées sur de la gélose LB en présence de 100 ug / ml d&#39;ampicilline et réparties au moyen d&#39;un épandeur de cellule en verre stérileet on incube à 37 ° C pendant une nuit. Pour quantifier le nombre total de bactéries utilisées dans chaque transformation, volumes 40 ul de bactéries électrocompétentes de chaque lot préparé ont été dilués en série et étalées sur de la gélose LB sans antibiotique identique en parallèle. Une aliquote de bactéries aussi traités de chaque lot a été électroporation avec 1 pi de Tris-EDTA (TE) tampon mais sans ADN (transformation maquette), dilué en série et étalées sur gélose LB sans antibiotiques pour estimer le nombre de cellules perdues par la livraison de la impulsion électrique. Enfin, une variante supplémentaire de l&#39;expérience a été réalisée pour déterminer si les 30 min d&#39;incubation à 37 ° C dans 1 ml de LB après l&#39;électroporation, mais avant l&#39;étalement sur LB-agar affecteraient la récupération des cellules transformées. unités formant colonies (UFC) ont été dénombrées sur le jour suivant. Pour cette expérience, nous avons employé pUC18, un plasmide de laboratoire commun, et les lots de bactéries compétentes consistant en unnviron 10 8 UFC de cellules préparées en utilisant la méthode traditionnelle et 10 7 UFC pour cellules préparées en utilisant le protocole rapide. L&#39;électroporation seul (sans ADN) a réduit de 10 à 100 CFU viables par pli quelle que soit la méthode utilisée pour préparer les cellules électro-compétentes. Comme le montre le tableau 1, le rendement était transformant à l&#39;intérieur de la 10 6 -10 7 CFU / pg de plage de l&#39;ADN dans les trois expériences répétées (écarts-types indiqués entre parenthèses) pour E. coli (DH5a) et V. cholerae (O395) en utilisant respectivement la méthode longue traditionnelle pour la préparation de cellules électrocompétentes. Rendement transformant apparu diminué de 10 fois 10 5 -10 6 UFC / pg d&#39;ADN dans trois expériences répétées (écart-type entre parenthèses) pour E. coli et V. cholerae respectivement selon la méthode rapide. Pour cette raison, nous avons déterminé le pourcentage de bactéries transformées en divisant UFC transforméespar le nombre d&#39;UFC récupéré à partir de transformations &quot;simulées&quot; (sans plasmide) à partir de lots identiques par ailleurs des cellules compétentes. Le pourcentage de bactéries transformées était dans un journal (2.5-9.4%) indépendamment de la méthode de préparation et les espèces transformées (Tableau 1 nombres entre parenthèses). Ces résultats suggèrent que l&#39;efficacité de la méthode rapide est comparable à celle de la longue procédure traditionnelle de préparation de cellules compétentes et que les souches représentatives de Vibrio cholerae et Escherichia coli sont également ouvertes à la procédure rapide. Nous avons constaté que l&#39;efficacité de transformation, telles que pour les plasmides pUC18 hébergeant cassettes β-lactamase, n&#39;est pas affecté par le temps de récupération de 30 min dans du bouillon LB. Le même nombre de transformants a été récupéré si les cellules ont été étalées à la gélose LB en présence d&#39;ampicilline directement, après l&#39;électroporation, ou si elles ont été autorisées un temps de récupération de 30 à 45 mindans du bouillon LB à 37 ° C avant le placage. Nos résultats que résistance à l&#39;ampicilline ne nécessite pas de prolongement dans des conditions non sélectifs suggère que l&#39;expression β-lactamase se produit suffisamment rapide lors de la transformation. Toutefois, il convient de noter que nous avons effectué des dilutions en série de bactéries dans un bouillon LB pulsés, qui peuvent avoir contribué à la récupération à partir de la décharge électrique et de déclencher l&#39;expression du gène. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation graphique de la méthodologie pour la préparation rapide de bactéries électrocompétentes. Après 4-6 heures (en fonction de la densité de l&#39;inoculum) un nombre suffisant de bactéries peuvent être collectées pour effectuer quatre à six transformations à partir d&#39;une seule plaque de gélose LB. Pour assurer un nombre égal de cellules compétentes pour chaque volume final à une électroporation, les bactéries collectées à partir de la plaque de gélose LB ont d&#39;abord été mis en commun et ensuite lavés ensemble aliquoted dans 40 volumes de pi en fonction de la taille de la pastille (grandes pastilles ont été dilués dans des volumes plus importants divisible par 40 pi). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Nombre d&#39;ADN transformants / ug d&#39;ampicilline-résistant (transformants résistants à l&#39;ampicilline récupérés [%]) </td></tr><tr><td> Strain </td><td> Méthode traditionnelle </td><td> Méthode rapide </td></tr><tr><td> E. coli (DH5a) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tableau 1. L&#39;efficacité de transformation par microgramme d&#39;ADN (pUC18) de électrocompétent bacteria préparé par le procédé traditionnel par rapport à la méthode rapide. Toutes les transformations ont été réalisées avec 500 ng d&#39;ADN pUC18 (~ 80% d&#39;ADN surenroulé telle que visualisée par électrophorèse sur 1% de gel d&#39;agarose) et les cellules électroporées ont été dilués 10 fois dans du bouillon LB avant le plaquage de CFU sur LB-agar avec des antibiotiques. Contrôles de bactéries non-électroporation et de bactéries électroporées sans plasmide, dilués en série et étalées sur de la gélose LB sans antibiotique ont été effectuées pour chaque série de transformations afin de déterminer le nombre total de bactéries viables avant et après la pulsation. Les contrôles électroporation représentaient la ligne de base pour le pour cent des bactéries viables transformées avec succès.

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Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

L&#39;électroporation est un procédé couramment utilisé pour l&#39;introduction d&#39;ADN dans des bactéries dans un processus connu sous le nom de transformation. Les protocoles traditionnels pour la préparation de cellules électrocompétentes beaucoup de temps et de main-d&#39;œuvre. Cet article décrit une autre, rapide, et efficace méthode pour la préparation de cellules électrocompétentes actuellement employés par certains laboratoires.

Protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Et<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

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Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

76.3K vues.  University of Texas Brownsville.  L'électroporation est un procédé couramment utilisé pour l'introduction d'ADN dans des bactéries dans un processus connu sous le nom de transformation. Les protocoles traditionnels pour la préparation de cellules électrocompétentes beaucoup de temps et de main-d'œuvre. Cet article décrit une autre, rapide, et efficace méthode pour la préparation de cellules électrocompétentes actuellement employés par certains laboratoires. 

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Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: organisme modèle pour étudier la pathogenèse bactérienne - Interview

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An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un test pour mesurer l&#39;activité des Escherichia coli Inductible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Criblage à haut débit activité endoglucanase fongique dans les Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocoles pour la mise en œuvre d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sur la base du système d&#39;expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Détection de Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 par les cellules PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Purification non chromatographique de polypeptides recombinants élastine et de leurs fusions avec des peptides et des protéines<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...