Nous remercions le Dr Agnès Viale et le MSKCC génomique Laboratoire central d&#39;assistance technique. Ce protocole a été élaboré avec le soutien du Centre de Cancérologie Geoffrey Beene et la Fondation fermier de famille.

Une. Préparation des réactifs et de l&#39;ADN Remarque: Ce protocole décrit le traitement simultané et l&#39;analyse des 24 échantillons (par exemple 12 paires tumeur / normal), mais peut être adaptée pour des lots plus petits et plus grands. échantillons d&#39;ADN peuvent provenir de FFPE ou tissu frais congelé, les échantillons cytologiques, ou de sang. Typiquement, à la fois la tumeur et le tissu normal du même patient sont profilées conjointement de manière à distinguer les mutations somatiques de polymorphismes héritées. Le protocole commence immédiatement après l&#39;extraction d&#39;ADN. <ol><li> Aliquote de 50 à 250 ng (250 ng recommandé) de l&#39;ADN extrait par échantillon, on le dilue dans 1 x Tris-EDTA (pH 8,0) tampon d&#39;un volume final de 50 ul, dans des tubes à fond rond Covaris distinctes. </li><li> Cisailler l&#39;ADN sur l&#39;instrument Covaris E220 dans les réglages de cisaillement suivants: 360 sec à 10 facteur de marche, 175 PIP, et 200 cycles par rafale. </li><li> Décongeler AMPure Perles XP (__gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ tableau 2) à température ambiante. Décongeler tous buffre et enzymes sur la glace avant l&#39;étape appropriée. </li></ol> 2. Module de réparation de fin - Préparation bibliothèque <ol><li> Préparez le mélange maître de réparation de fin dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 10 pi de 10x NEBNext Fin réparation Reaction Buffer (tableau 2), 5 pi NEBNext Fin enzyme de réparation Mix (tableau 2), 35 pl nucléase stérile libre H 2 O. </li><li> Aliquoter les 50 ul de chaque ADN cisaillé dans des puits séparés d&#39;une plaque à 96 puits. Ajouter 50 pi de mélange maître de réparation de fin prêts à chaque réaction. Incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 20 ° C. </li></ol> 3. Réparation Poster Fin Clean-up <ol><li> Ajouter 2x volume (200 pi) de AMPure Perles XP (__gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ tableau 2) pour chaque échantillon et la pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x en utilisant une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Placez sur le support magnétique (tableau 2 </strong&gt;) à température ambiante pendant 15 min jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon apparaît clairement. </li><li> Retirez délicatement et jeter clairement la prise de surnageant soin de ne pas déranger les perles. Certains liquide peut rester dans les puits. </li><li> Avec des tubes sur le support, ajouter doucement 200 ul de fraîchement préparée de 80% d&#39;éthanol pour chaque échantillon et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 sec. Avec précaution, éliminer l&#39;éthanol par pipette. </li><li> Répétez l&#39;étape 5, pour un total de deux lavages à l&#39;éthanol. S&#39;assurer que tous éthanol a été éliminée. Retirer du support magnétique et laisser sécher à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Reprendre billes séchées 44,5 M ul stérile 2 O. Doucement, toute pipette volume vers le haut et vers le bas 10x bien mélanger. S&#39;assurer que les perles ne sont plus fixés sur le côté du puits. </li><li> Incuber billes en suspension à température ambiante pendant 2 min. Placez sur support magnétique pendant 5 min jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon apparaît clairement. </li><li> Transférer doucement 42 pi de surnageant clair contenant l&#39;échantillon à un nouveau puits. La procédure peut être arrêtée sans danger à ce step et les échantillons conservés à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 7 jours. Pour redémarrer, dégeler les échantillons congelés sur glace avant de poursuivre. </li></ol> 4. Préparation Bibliothèque - Module dA-Tailing <ol><li> Préparer le mélange maître dA-Tailing dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 5 pi de 10x NEBNext réaction dA-Tailing tampon (tableau 2), 3 pi (3 &#39;5&#39; exo-) fragment de Klenow (tableau 2 ). </li><li> Ajouter 8 pi du prêt master mix dA-Tailing à chaque puits contenant 42 ul d&#39;ADN de fin réparé. Incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Effectuer un poste dA-Tailing nettoyage: Répétez les étapes 3.1 à 3.8 en utilisant 2x volume (100 pi) de perles, mais remettre en suspension dans H 2 O stérile à un volume final de 33,75 pi. La procédure peut être arrêté en toute sécurité à cette étape et les échantillons conservés à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 7 jours. Pour redémarrer, dégeler les échantillons congelés sur glace avant de poursuivre. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Préparation Bibliothèque - Adapter Module ligature <ol><li> Préparer le mélange maître de ligature dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 10 pi de 5x NEBNext ligature rapide Reaction Buffer (New England Biolabs, tableau 2), 5 pi rapide ADN ligase de T4 (tableau 2). </li><li> Ajouter 15 pi de mélange maître de ligature dans chaque puits contenant l&#39;ADN dA à queue. </li><li> Ajouter 1,25 ul de 25 uM NEXTflex l&#39;adaptateur approprié à code-barres (tableau 2) à chaque puits. Chaque échantillon doit recevoir un code-barres adaptateur séparé. Incuber dans un thermocycleur pendant 15 min à 20 ° C. </li><li> Effectuer un poste adaptateur ligature nettoyage: Répétez les étapes 3.1 au 3.8 en utilisant un volume 1x (50 pi) de perles, mais remettre en suspension dans H 2 O stérile à un volume final de 50 ul. </li><li> Répétez les étapes 3.1 à 3.8 pour un second volume de 1x (50 pi) de nettoyage, mais remettre en suspension dans H 2 O stérile à unvolume final de 23 ul. La procédure peut être arrêté en toute sécurité à cette étape et les échantillons conservés à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 7 jours. Pour redémarrer, dégeler les échantillons congelés sur glace avant de poursuivre. </li></ol> 6. Amplification bibliothèque <ol><li> Préparer le mélange maître KAPA HiFi dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 25 pl 2x KAPA HiFi HS RM (tableau 2), 1 pl de chacune des 100 uM Primer 1 et Primer 2 (Tableau 3). </li><li> Ajouter 27 pi de mélange maître à chaque puits contenant le produit de ligature. Régler la pipette à 50 pi et délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 10x. </li><li> Placez dans le thermocycleur pour les cycles de PCR suivantes: dénaturation initiale de 45 sec à 98 ° C, 10 cycles de 15 sec à 98 ° C, 30 secondes à 60 ° C, 30 secondes à 72 ° C, et l&#39;extension finale de 1 min à 72 ° C. </li><li> Effectuez une post-amplification de nettoyage: Répétez les étapes 3.1 à 3.8 à l&#39;aide1x volume (50 ul) de AMPure XP Beads, et remettre en suspension dans de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à un volume final de 30 ul. </li><li> Quantifier la concentration de chaque bibliothèque à l&#39;aide qubit Large gamme de dosage (Life Technologies, tableau 2) selon les instructions du fabricant. </li></ol> 7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Bibliothèque hybridation, lavage, et Amplification <ol><li> Dégel universelles et l&#39;indice de blocage des oligonucléotides (tableau 3), SeqCap EZ bibliothèque, et NimbleGen composants de capture (ADN COT, tampons d&#39;hybridation 2x, et composant hybridation A, tableau 2) sur la glace. Tous les inhibiteurs d&#39;oligonucléotides sont stockés dans les stocks de travail de 1 mM. Notre SeqCap EZ Library est une piscine sur mesure de sondes de capture englobant tous les exons codant pour des protéines de 279 gènes associés au cancer, mais d&#39;autres dessins personnalisés et catalogue peuvent être utilisés. </li><li> Préparer une piscine de 1 mM de bloqueurs indice d&#39;oligonucléotides correspondant à l&#39;annonce code-barres spécifiqueséquences Aptor utilisés dans la préparation bibliothèque. Mélanger 1 pi de chaque bloqueur, et vortex. </li><li> Dans un nouveau tube de 1,5 ml microtubes stériles, ajouter 5 ul d&#39;ADN COT 1mg/ml, 2 pi de 1 mM bloquant universel et 2 pi de la piscine 1 mM des inhibiteurs indice d&#39;oligonucléotides. </li><li> Piscine 24 bibliothèques à code-barres en une seule réaction. Ajouter un total de 1 à 3 ug de mise en commun, une bibliothèque de séquence à code à barres (préparé ci-dessus) au mélange de capture. Pour 24 échantillons, 100 ng par échantillon est recommandé. Lorsque la mise en commun des tumeurs et des échantillons normaux appariés, nous avons recommandé d&#39;ajouter plus de bibliothèque de tumeurs (par exemple de 100 ng par la tumeur et 50 ng par normale) de sorte qu&#39;ils sont séquencées à une plus grande profondeur de la couverture. </li><li> Fermez le bouchon du tube et faire 15-20 trous dans le haut de la capsule avec un 18-20 G ou plus petite aiguille. Speed ​​Vac les échantillons bibliothèque / COT ADN / à oligos amplifiés dans le vide concentrateur d&#39;ADN sur feu vif (60 ° C). </li><li> Une fois complètement sec vers le bas, réhydrater avec 7,5 ul de 2x hybridationtampon sation et 3 pi de composant hybridation A. Le tube doit maintenant contenir les éléments suivants: 5 pg d&#39;ADN COT, pg la variable de bibliothèque de l&#39;échantillon amplifié, 1000 pmol d&#39;Universal et Index oligos, tampon 7,5 pi 2x d&#39;hybridation, 3 pi hybridation composant A dans un volume total de 10,5 pi. </li><li> Couvrez les trous dans le couvercle avec un petit morceau de ruban adhésif de laboratoire. Vortex l&#39;échantillon pendant 10 secondes et centrifuger à la vitesse maximale pendant 10 s. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 95 ° C pendant 10 min pour dénaturer l&#39;ADN, suivi par une centrifugation à vitesse maximale pendant 10 s à température ambiante. </li><li> Dans un nouveau tube de PCR 0,2 ml de bande, préparer 2,25 pi aliquote de SeqCap EZ sondes de capture Bibliothèque et 2,25 pi de stérile nucléase libre H 2 O et ajouter le contenu de l&#39;étape 7.7. Pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. </li><li> Incuber dans un cycleur thermique à 47 ° C pendant 48-96 h. Régler et maintenir la température du couvercle de l&#39;appareil à cycles thermiques à 57 ° C. </li><li> Folmarches basses dans le chapitre 6 du Guide de la v3.0 de la NimbleGen SeqCap EX Bibliothèque SR utilisateur (tableau 2) pour le lavage et la récupération de l&#39;ADN capturé. </li><li> Suit les étapes du chapitre 7 du protocole Roche NimbleGen pour l&#39;amplification de l&#39;ADN capturé avec les modifications suivantes: <ul type="disc"><li> Utilisez 2x KAPA HiFi polymérase (tableau 2) au lieu de Phusion haute fidélité PCR Master Mix </li><li> Utilisez 100 uM Primer 1 et 2 Primer énumérés dans le tableau 3. </li><li> Exécuter les conditions de PCR suivantes: dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 sec, 11 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 30 secondes, et extension finale à 72 ° C pendant 5 min . Maintenir à 4 ° C. </li></ul></li><li> Quantifier la concentration de l&#39;ADN amplifié à l&#39;aide capturé qubit haute sensibilité Assay (tableau 2) selon les instructions du fabricant. </li><li> Analyser la qualité de l&#39;ADN capturée à l&#39;aide Agilent BioAnalyseur puce ADN HS (tableau 2) selon les instructions du fabricant. <ul type="disc"><li> Le rendement de la PCR doit être d&#39;au moins 100 ng (gamme 100-1000 ng). </li><li> La longueur des fragments de moyenne doit être comprise entre 150 à 400 paires de bases. </li></ul></li></ol> 8. Illumina Salut-Seq séquençage <ol><li> Diluer l&#39;ADN capturé amplifié à 14 heures, et de charger l&#39;échantillon sur une seule voie d&#39;une cellule de débit Illumina HiSeq 2000. Séquence appariée de gamme paire 75 but lit selon les instructions du fabricant. Dans notre expérience, une voie est suffisante pour produire une couverture de séquence unique de 500 700x par exemple sur 279 gènes pour une piscine de 24 échantillons. </li><li> Logiciel Illumina (Real Time Analysis) permet de convertir des images haute résolution à des intensités de cluster de fonder des appels et des scores de qualité. Utilisation CASAVA pour démultiplexer les données en fonction de l&#39;identité de code à barres et générer des fichiers de FASTQ individuels pour chaque échantillon. </li></ol> 9. Données Anallyse <ol><li> Garniture séquences d&#39;adaptation à partir de l&#39;extrémité 3 &#39;de la séquence se lit en utilisant des fichiers FASTQ Cutadapt ( <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). La longueur minimale de chevauchement (-O) est égal à 3 avec un taux d&#39;erreur (-e), de 1%. La longueur de la base minimale de conservation des apparié lit après la coupe est de 25. </li><li> Alignez séquence lit les hg19 du génome humain de référence en utilisant l&#39;outil de Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 12. Exécutez les étapes de post-traitement y compris le marquage double, le réalignement de séquence multiple local, et le score de qualité de base recalibrage en utilisant l&#39;analyse du génome Toolkit (GATK) en fonction de leurs meilleures pratiques standard ( <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = meilleures pratiques</a> ) 13. Quand de multiples échantillons de profilage à partir du même patient (par exemple, identifié tumorales et normales), le réalignement de séquences multiples local devrait être perforMED conjointement. La sortie de ces étapes de post-traitement est un fichier de BAM pour chaque échantillon, qui contient toutes les séquences, de qualité, et des informations d&#39;alignement et peut être chargé directement dans la génomique intégrative Viewer (IGV) pour la visualisation de lit et des variants de séquence 14. </li><li> Calculer la séquence des mesures de performance en utilisant des outils Picard ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Mesures d&#39;information comprennent le taux alignement, la distribution de la taille des fragments, GC-contenu biais de couverture associés, sur cible spécificité de capture, la PCR en double taux, la complexité bibliothèque, et signifier la couverture cible. Des valeurs représentatives sont affichées dans la figure 1. Les fréquences des allèles sur les sites de polymorphisme communs calculés en utilisant DepthOfCoverage de GATK sont utilisés pour surveiller la contamination de l&#39;ADN non lié et de veiller à ce que les échantillons appariés provenaient des mêmes patients. Les analyses informatiques suivants dépendent de la présence de appariéséchantillons tumoraux et normaux pour la détection d&#39;altérations génétiques somatiques. Tumeurs inégalés peuvent également être analysées à l&#39;aide d&#39;un échantillon de contrôle normal séparé, mais la plupart des mutations somatiques ne peuvent être facilement distingués des variants de séquence héritées. </li><li> Appel variants nucléotidiques simples somatiques (SNVs) pour chaque paire de la tumeur à la normale à l&#39;aide d&#39;un appelant de la mutation somatique, comme muTect 15, SomaticSniper 16, 17 ou Strelka. Nous utilisons muTect avec des critères de filtrage modifiés, ce qui permet pour les variantes à faible (non nulle), chiffres d&#39;allèles dans l&#39;échantillon normal, tant que la fréquence de l&#39;allèle est au moins 5 fois plus grande dans la tumeur. Des variantes appelées récurrente dans un panneau d&#39;ADN normaux sont supprimés comme des artefacts systématiques susceptibles de séquençage ou l&#39;alignement. Chaque SNV passant filtres est ensuite examiné avec soin en utilisant IGV. </li><li> Appel indels somatiques pour chaque paire de la tumeur à la normale à l&#39;aide d&#39;algorithmes tels que SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, 19 ou SOAPindel </sup&gt;. Nous utilisons SomaticIndelDetector selon les critères suivants: au moins 10% la fréquence des allèles d&#39;au moins 3 supportant lit, ou au moins 2% de la fréquence des allèles d&#39;au moins 10 lectures de support. Nous laissons pour indels ayant un faible (non nulle), chiffres d&#39;allèles dans l&#39;échantillon normal, tant que la fréquence de l&#39;allèle est au moins 5 fois plus grande dans la tumeur. Indels appelés dans un groupe d&#39;ADN normaux sont supprimés, comme ci-dessus. Chaque indel passant filtres est ensuite examiné avec soin en utilisant IGV. </li><li> Extrapoler copie statut de nombre de couverture de la séquence à exons cibles. Pour chaque échantillon, procéder à une normalisation Loess de la couverture de séquence moyenne de tous les exons cibles, régression sur le pourcentage de GC. Ajustez les valeurs de couverture non normalisées en soustrayant l&#39;ajustement Loess et ajouter la couverture médiane échantillon entier. Calculer le ratio de la couverture de la séquence normalisée pour tous les exons cibles pour les paires de tumeurs à la normale. En l&#39;absence d&#39;un échantillon normal identifié et / ou pour diminuer le bruit, d&#39;autre diploïde au genre identifiétémoins normaux dépourvus de variants du nombre de copies de la lignée germinale peuvent être utilisés. Déterminer somatiques gains et pertes de nombre de copies en fonction des augmentations ou diminutions du taux de couverture. </li><li> Appelez réarrangements somatiques impliquant les gènes du cancer où au moins un point d&#39;arrêt génomique tombe à l&#39;intérieur ou à proximité d&#39;un intervalle ciblée du génome. Algorithmes suggérés incluent GASV 20, breakdancer 21, CREST 22, et Dranger 23. Inversions intrachromosomiques, des suppressions et duplications en tandem peuvent être distingués en fonction de la position relative et l&#39;orientation de soutenir lit en paires discordantes. Tous les réarrangements candidats devraient être examinées manuellement à l&#39;aide IGV. Nous vous recommandons validation expérimentale par séquençage PCR et Sanger à travers les points d&#39;arrêt de réarrangement putatifs. </li></ol>

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G., Easton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREST+maps+somatic+structural+variation+in+cancer+genomes+with+base-pair+resolution.">CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution.</a> Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).</li><li>Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+rearrangements+across+cancer+reveal+classes+of+samples+with+distinct+patterns+of+DNA+breakage+and+rearrangement-induced+hypermutability.">Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability.</a> Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

Dr Berger a reçu des honoraires de conseil et financement de la recherche de la Fondation de médecine, une société de diagnostic de cancer.

Notre essai IMPACT produit un taux élevé d&#39;alignement, le taux sur la cible haut, couverture cible haute et haute sensibilité pour la détection des mutations, indels, et du nombre de copies des modifications. Nous avons démontré la capacité de notre essai IMPACT à l&#39;ADN de séquence à la fois frais congelé et archivé échantillons FFPE de faible apport d&#39;ADN. En effectuant le séquençage de l&#39;exon ciblé de gènes associés au cancer principaux, on peut obtenir une couverture de séquence tr?...

L&#39;identification des événements génétiques tumorales «driver» dans oncogènes clés et des gènes suppresseurs de tumeurs joue un rôle essentiel dans le diagnostic et le traitement de nombreux cancers 1. Efforts de recherche à grande échelle en utilisant le séquençage massivement parallèle &quot;nouvelle génération&quot; ont permis l&#39;identification de plusieurs de ces gènes associés au cancer au cours des dernières années 2. Cependant, ces plates-formes de séquençage nécessitent généralement de grandes quantités de l&#39;ADN isolé à partir de tissus congelés frais, ce qui présente donc une limitation importante dans l&#39;analyse et la caractérisation des mutations de l&#39;ADN à partir de tissus conservés, tels que la paraffine fixés au formol noyé (FFPE) des échantillons de tumeurs. Amélioration des efforts pour caractériser efficacement et de manière fiable l&#39;information génomique &quot;action&quot; d&#39;échantillons tumoraux FFPE permettront l&#39;analyse rétrospective d&#39;échantillons précédemment mis en réserve et encourager davantage les approches individualisées à la gestion du cancer. Traditionnellement, d moléculairelaboratoires iagnostic se sont appuyés sur fastidieuses, des méthodologies bas-débit telles que le séquençage Sanger et PCR en temps réel pour le profilage ADN mutation. Plus récemment, des méthodes plus-débit utilisant la PCR multiplex ou spectrométrie de masse génotypage ont été développées pour étudier des mutations somatiques récurrentes dans les gènes du cancer clés 3-5. Ces approches sont cependant limitées par le fait que seuls les &quot;points chauds&quot; mutations prédésignés sont dosés, ce qui les rend impropres à la détection de mutations d&#39;inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs. Séquençage massivement parallèle offre plusieurs avantages par rapport à ces stratégies, y compris la possibilité d&#39;interroger les exons entiers pour les mutations à la fois communs et rares, la capacité de révéler d&#39;autres catégories d&#39;altérations génomiques tels que les gains et les pertes du nombre de copies, et une plus grande sensibilité de détection dans des échantillons hétérogènes 6, 7 . Séquençage du génome entier représente l&#39;approche la plus complète pour la découverte de la mutation, si elle est relativement coûteux et encourt grandes exigences de calcul pour l&#39;analyse des données et le stockage. Pour les applications cliniques, où seule une petite fraction du génome peut être d&#39;intérêt clinique, deux innovations particulières dans la technologie de séquençage ont eu un effet transformateur. Tout d&#39;abord, à travers l&#39;exon capture à base d&#39;hybridation, on peut isoler l&#39;ADN correspondant à des gènes associés au cancer clés de mutation ciblée profilage 8,. Deuxièmement, grâce à la ligature des codes-barres moléculaires (par exemple des séquences d&#39;ADN 6-8 nucléotides de long), on peut regrouper des centaines d&#39;échantillons par séquençage terme et profiter pleinement de la capacité croissante des instruments massivement parallèles de séquençage 10. Lorsqu&#39;ils sont combinés, ces innovations permettent tumeurs être profilée pour un coût moindre et à un débit plus élevé, avec des exigences de calcul plus petits 11. En outre, par la redistribution de la couverture de séquence avec seulement les gènes les plus critiques pour l&#39;application particulière, on peut Achieve plus grande profondeur de séquençage pour la sensibilité de détection plus élevé pour les événements de basse fréquence de l&#39;allèle. Nous décrivons ici notre test IMPACT (Mutation profilage intégrée des objectifs du cancer à une action), qui utilise l&#39;exon capture sur un code à barres piscines de la bibliothèque de séquence par hybridation en utilisant personnalisés oligonucléotides pour capturer tous les exons codant pour des protéines et sélectionnez introns de 279 gènes associés au cancer clés (tableau 1 ). Cette stratégie permet l&#39;identification de mutations, indels, nombre de copies des modifications, et sélectionner réarrangements structuraux impliquant ces 279 gènes. Notre méthode est compatible avec l&#39;ADN isolé à partir de deux tissus congelés et FFPE frais ainsi que de fines aspire à aiguilles et d&#39;autres spécimens de cytologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody> 
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6050L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext dA-Tailing Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6053L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext Quick Ligation Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6056L</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter Genomics</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEXTflex PCR-Free Barcodes &#8211; 24</td>
			<td style="width:247px;">Bioo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">514103</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HiFi Library Amplification Kit</td>
			<td style="width:247px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:137px;">KK2612</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">COT Human DNA, Fluorometric Grade</td>
			<td style="width:247px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:137px;">05 480 647 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;">05 634 261 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SeqCap EZ Library Baits</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:247px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32850</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32851</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent DNA HS Kit</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;">5067-4626, 4627</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Covaris E220</td>
			<td style="width:247px;">Covaris</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:247px;">Ambion</td>
			<td style="width:137px;">AM10027</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Illumina Hi-Seq 2000</td>
			<td style="width:247px;">Illumina</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

Les efforts visant à détecter et enquêter sur des mutations oncogènes clés sont révélés précieux pour faciliter le traitement approprié pour les patients atteints de cancer. La mise en place de haut-débit, le séquençage massivement parallèle &quot;nouvelle génération&quot; a aidé la découverte de beaucoup de ces mutations. Pour améliorer l&#39;utilité clinique et translationnelle de cette technologie, les plates-formes doivent être à haut débit, le coût-efficace, et compatible avec de la paraffine fixés au formol (FFPE) intégré échantillons de tissus qui peuvent donner de petites quantités d&#39;ADN dégradé ou endommagé. Ici, nous décrivons la préparation de banques d&#39;ADN code-barres et multiplexés suivie d&#39;une hybridation de capture sur la base-des exons ciblés pour la détection de mutations associées au cancer dans les tumeurs congelées et FFPE fraîches par séquençage massivement parallèle. Cette méthode permet l&#39;identification de mutations de la séquence, le nombre de copies des modifications, et sélectionner réarrangements structuraux impliquant tous les gènes ciblés. Séquençage de l&#39;exon offres ciblées til bénéficie d&#39;un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, conférant ainsi une haute sensibilité pour détecter des mutations de basse fréquence.

Une piscine de 24 banques de séquences à code-barres (12 paires de tumeurs à la normale) a été capturée à l&#39;aide des sondes correspondant à tous les exons codant pour des protéines de 279 gènes du cancer et séquencé comme 2 x 75 pb lit sur une seule voie d&#39;une cellule d&#39;écoulement HiSeq 2000. Tumeur et les bibliothèques normales ont été rassemblées dans un rapport de 2:1. des mesures de performance de l&#39;échantillon pour un mélange d&#39;échantillons d&#39;ADN de tumeur congelés sont ...

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Nous décrivons la préparation de banques d&#39;ADN code-barres et ultérieure capture d&#39;exon base hybridation pour la détection de mutations clés associés au cancer dans des échantillons de tumeurs cliniques par séquençage massivement parallèle &quot;prochaine génération&quot;. Séquençage de l&#39;exon ciblée offre les avantages d&#39;un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, donnant ainsi une grande sensibilité pour la détection de mutations de basse fréquence.

Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

detecting-somatic-genetic-alterations-tumor-specimens-exon-capture

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K vues.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.  Nous décrivons la préparation de banques d'ADN code-barres et ultérieure capture d'exon base hybridation pour la détection de mutations clés associés au cancer dans des échantillons de tumeurs cliniques par séquençage massivement parallèle "prochaine génération". Séquençage de l'exon ciblée offre les avantages d'un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, donnant ainsi une grande sensibilité pour la d?...

Vidéo: Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

T CD4 + des lymphocytes capturer en utilisant une puce jetable microfluidiques pour le VIH

Recherche

Biologie

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Dans reprogrammation in vivo de cellules somatiques adultes à la pluripotence par surexpression de facteurs Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear Amplification Mediated PCR &amp;#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

Amplification linéaire d&#39;une PCR - Localisation des éléments génétiques et caractérisation de Unknown ADN flanquant

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Essais Reporter massivement parallèles dans des cellules de mammifères en culture

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.