Les embryons et les larves de Drosophila melanogaster sont faciles à manipuler et leur développement s'effectue selon des mécanismes existant dans d’autres organismes tels que les mammifères. L’apprentissage du prélèvement et de la préparation des embryons et larves est une étape préliminaire à beaucoup de processus expérimentaux allant de la biologie comportementale à celle du développement. Cette vidéo va porter sur les méthodes standards de culture et de prélèvement d’embryons et de larves de drosophiles, procédures essentielles à l’utilisation de cet organisme modèle polyvalent.
L’étude de l’embryon de la drosophile a fourni un excellent aperçu de la façon dont les gènes régulent le développement, que ce soit l’ARN messager exprimé comme un gradient dans l’ovocyte, ou les gènes qui génèrent le plan du corps segmenté suivant l’axe antéro-postérieur. Certains de ces gènes, tels que les gènes à boîte homéotique, sont hautement conservés entre cet insecte et les mammifères.
La nature robuste des embryons de drosophile leur permet de résister à des environnements hostiles et aux produits chimiques, ce qui les rend extrêmement pratiques à étudier.
Après fécondation, une mouche femelle peut pondre jusqu’à 100 embryons par jour, qui écloront en larves après 12 à 15 heures.
Pour manipuler les embryons de drosophile, ceux-ci doivent d’abord être cultivés.
Les embryons sont cultivés dans des chambres de ponte souvent appelées "pondoirs".
Pour assembler le pondoir, faites premièrement des trous dans le récipient ou coupez-en une partie et couvrez le avec un matériau poreux pour permettre la ventilation. Prenez ensuite une plaque de gélose au jus de pomme ou de raisin, disposez-y la pâte de levure en stries et grattez les plaques en leur centre. La présence de pâte de levure entrainera la ponte.
Ajoutez rapidement les mouches au pondoir, retournez le pondoir afin d’avoir la plaque au fond de celui-ci et placez-le dans l’incubateur. Après écoulement du temps d’incubation souhaité, retournez le pondoir et tapez-le énergiquement sur la paillasse 2 ou 3 fois. Les mouches tombent au fond du pondoir et sont momentanément désorientées. Remplacez rapidement l’ancienne plaque de gélose avec une nouvelle plaque couverte de pâte de levure. Pour obtenir des embryons ayant un âge optimal, changez les plaques toutes les 1 à 3 heures.
Les plaques contiendront des centaines d’embryons, particulièrement près des stries et de la levure. 20 mouches de chaque sexe doivent produire 100 à 200 embryons par heure. Les embryons peuvent maintenant être prélevés.
Les outils nécessaires au prélèvement des embryons sont: une passoire ou un tamis, qui peut varier considérablement en taille et en complexité, un pinceau et de l’eau distillée.
Tout d'abord, détachez les embryons en immergeant les plaques dans de l’eau distillée tout en brossant gentiment la surface avec un pinceau. Eliminez ensuite le liquide par filtration en versant le mélange sur le tamis. Rincez les embryons à l’eau.
Le rinçage est souvent suivi par une étape de déchorionation, l’élimination de la membrane extérieure dure de l’embryon, ou chorion.
La déchorionation peut être effectuée manuellement par la dissection de l’embryon hors de l'enveloppe de chorion. Une autre option est de placer les embryons dans une solution d’eau de javel à 50%. Le chorion se dissout en 2 à 10 minutes, comme l'indique la disparition des appendices dorsaux. Rincez abondamment à l’eau distillée de façon à vous assurer que l’embryon nu n’est pas endommagé par l’eau de javel. La déchorionation est une étape pré-requise aux techniques telles que la micro-injection ou l’imagerie en temps réel.
Maintenant que vous avez un aperçu de l’embryologie, de la culture et du prélèvement des embryons, continuons avec la prochaine étape du cycle de vie de la drosophile : la larve.
Les larves de drosophiles ont trois stades larvaires ou mues. Le premier stade dure une journée, le deuxième encore une journée, et le troisième deux jours de plus. Les larves dans leur premier ou deuxième stade larvaire se trouvent dans la nourriture du flacon entre 1 et 3 jours après la mise en place d’un croisement. Au 4ème jour, les larves du 3ème stade larvaire migrent sur les parois du flacon où elles finiront par former des cocons appelés les pupes.
Les larves sont souvent utilisées expérimentalement en raison de leurs disques imaginaux. Les disques imaginaux sont des organes partiellement développés connus pour former des organes entiers chez la mouche adulte. Par exemple, un disque imaginal de l’œil deviendra l’œil adulte, des disques d’antennes deviendront les antennes et des disques imaginaux des ailes deviendront les ailes. L’étude des disques imaginaux a débouché à des découvertes majeures chez la drosophile, notamment le rôle des gènes homéotiques dans la formation des structures.
La culture de larves est plus simple que celle d'embryons car elle ne nécessite pas le transfert des mouches dans des chambres spéciales.
Les larves peuvent être retirées individuellement à l’aide de pinces ou de spatules. Pour la collecte de grandes quantités de larves au premier stade larvaire, vous pouvez utiliser une méthode alternative à base de solution de saccharose. Cette solution est plus dense que les larves et les fait flotter.
Ajoutez la solution de saccharose au flacon, ce qui fait remonter les larves à la surface. Séparez la nourriture en plaçant le flacon sous rotation. Enlevez alors les larves avec un pinceau ou une pipette, et récoltez-les pour les expériences.
Maintenant que nous avons décrit les techniques de culture et de prélèvement d'embryons et de larves, voyons quelles sont leurs applications expérimentales.
Les larves de drosophiles étant mobiles, elles peuvent être utilisées pour des expériences comportementales.
Ici, vous voyez un "test rampant", qui est utilisé pour évaluer le comportement locomoteur de la drosophile sous des conditions spécifiques. Le test rampant mesure la distance de déplacement des larves afin d’observer les effets d’un médicament sur la fonction motrice. Les larves prélevées sont immergées dans une solution de saccharose contenant un médicament connu pour compromettre la motilité.
La micro-injection est une procédure utilisée pour créer des mouches de fruit génétiquement modifiées, connues comme mutants transgéniques, par l’insertion d’un matériel génétique conçu sur mesure sous la forme d’un plasmide d’ADN circulaire.
Ces embryons sont déchorionés en les roulant physiquement sur du scotch double face afin d’éviter que les produits chimiques ne les détériorent. Les embryons peuvent alors être soumis à l'injection de plasmides qui codent des protéines, telles que la tubuline couplées avec des protéines rapporteuses de fluorescence telles que la GFP. Des expériences peuvent alors être effectuées pour visualiser les procédés cellulaires tels que la mitose dans des lignées de mouches transgéniques connues.
Les embryons peuvent être utilisés pour observer la présence de produits de transcription par hybridation fluorescente in situ.
Dans cette expérience, la présence d’un produit désiré issu de transcription d'ARNm est observée dans les embryons entiers par microscopie à fluorescence. Les embryons sont immobilisés par une solution bi-phasique qui les déchorione et par conséquent les prépare au marquage. Les embryons déchorionés sont localisés dans la couche inférieure. Après marquage par immunofluorescence, la présence de la protéine d'intérêt peut être observée par microscopie à fluorescence.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le prélèvement et la préparation d’embryons et de larves. Nous avons décrit la culture, le prélèvement et la préparation des embryons et des larves ainsi que certaines applications importantes liées aux organismes lors des premières étapes de développement. Merci de votre attention!
