Nous remercions le Dr Mickey Yang pour l&#39;édition et commentaires, et les Drs. Lei Zhang Peng Bo et de l&#39;aide. Ce travail a été soutenu par le Bureau de la science, Bureau des sciences fondamentales de l&#39;énergie du ministère de l&#39;Énergie des États-Unis (contrat n °. DE-AC02-05CH11231), le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health (pas . R01HL115153), et l&#39;Institut national de sciences médicales générales des National Institutes of Health (pas. R01GM104427).

1 Préparation de la solution de coloration fraîche négatif à 1% (p / v) <ol><li> Mettez 1 mg Uranyle formate (UF) de poudre dans une bouteille en verre contenant 100 ml d&#39;eau déminéralisée dans une pièce sombre ou boîte. </li><li> Agiter la solution O / N à la température ambiante dans une chambre / boîte sombre. Envelopper la bouteille de solution avec du papier d&#39;aluminium pour empêcher la lumière de frapper la solution. </li><li> Filtrer la solution à travers doucement 0,2 pm (taille des pores) filtre monté sur une seringue de 5 ml. La solution filtrée a été recueilli dans des tubes Falcon plusieurs couverts d&#39;une feuille d&#39;aluminium. La seringue de filtre doit être enveloppée d&#39;un papier d&#39;aluminium pour empêcher l&#39;exposition de la lumière. </li><li> Filtrer la solution à travers de nouveau 0,02 pm (taille des pores) monté sur filtre seringue de 1 ml. La solution filtrée a été recueilli et aliquote dans des flacons de 2 ml. Les seringues et des flacons étant recouvertes d&#39;une feuille d&#39;aluminium avant de les utiliser. </li><li> Geler immédiatement les flacons aliquotes en utilisant une pince à long manche, submergeant les flacons dans un récipient rempli d&#39;azote liquideaprès que la solution a été filtrée. </li><li> Transférer les flacons congelés dans un congélateur à -80 ° C pour le stockage et l&#39;utilisation future. </li></ol> 2 Préparation du poste de travail négatif de coloration et d&#39;incubation Workstation <ol><li> Décongelez un flacon de solution UF 1% dans un bain-marie réglé à la température ambiante. Assurez-vous que la feuille d&#39;aluminium reste enroulé autour du flacon pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Filtrer la solution après qu&#39;elle soit complètement décongelé à l&#39;aide d&#39;une feuille d&#39;aluminium enroulée seringue de 1 ml monté avec un filtre 0,02 pm. Recueillir la solution filtrée dans une nouvelle feuille d&#39;aluminium flacon enveloppé, et l&#39;a placé sur la glace dans une boîte de glace de chapeau couvert d&#39;attente pour l&#39;utilisation. </li><li> Faire plaques de solution par un doigt de poussée longue feuille de Parafilm ~ 8 de pouce sur la surface d&#39;une plaque de cristallisation de protéines vide. Il va générer des rangées de plaques circulaires avec un diamètre d&#39;environ 5 mm. Faire 6 assiettes à chaque endroit de la ligne les plaques Parafilm sur une surface de glace aplati à l&#39;intérieur d&#39;une glace contiennentcouvercle er, comme un poste de travail de coloration. </li><li> Pipette ~ 35 ul d&#39;eau désionisée sur chacune des trois plaques de gauche dans chaque rangée, et pipettes ~ 35 ul filtrés solution UF à droite, trois plaques dans chaque rangée. Couvrir le poste de travail de coloration avec un couvercle pour éviter toute exposition à la lumière avant la coloration des protéines. </li><li> Préparer une station d&#39;incubation de la grille EM par remplissage d&#39;une boîte vide à mi-chemin avec de la glace, et ensuite collé à un élément de suspension qui peut être monté sur une base de support. Placez la pince à épiler de l&#39;échantillon dans le hangar, dans lequel les conseils des pinces sont proches de la surface de la glace. La moitié couvre les conseils des pincettes par la hauteur boîte de lèvre. Une boîte de glace idéal pour faire une station d&#39;incubation utilise une embouts de pipette contenant vide. </li></ol> 3. OPNS opération <ol><li> Décharge luminescente du film mince de carbone recouvert de 300 mailles des grilles EM de cuivre pendant 10 sec. </li><li> Procurez-vous un réseau avec des pincettes et accrocher la pince à épiler dans le cintre en gardant la grille à 45 ° d&#39;inclinaison et 1 pouce au-dessus de la glacesurface à l&#39;intérieur de la station d&#39;incubation. </li><li> Diluer l&#39;échantillon de protéines avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD) à une concentration finale en protéine de 0,01 ~ à ~ 0,005 mg / ml. 4 pi ~ fort dilué l&#39;échantillon immédiatement après la dilution du côté de la grille EM du carbone. (DPBS peuvent être modifiés à un autre tampon si la protéine est sensible à DPBS) </li><li> Incuber l&#39;échantillon sur les grilles EM ~ 1 min à l&#39;intérieur de la station d&#39;incubation. </li><li> Enlever l&#39;excès de solution par l&#39;intermédiaire de toucher rapidement le bord de la grille avec un papier filtre. </li><li> Appuyez sur la grille rapidement à la première goutte (~ 35 pi) de la surface de l&#39;eau pure au sommet de la feuille Parafilm juste après l&#39;excès de solution a été retiré sur la grille de EM. Et puis enlever l&#39;excès d&#39;eau rapidement avec un papier filtre. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.6 pour encore deux fois par lavage de la grille EM sur les deux gouttes d&#39;eau restantes sur le parafilm (étape 3.6 et 3.7 peuvent être ignorées si l&#39;échantillon est très sensible à l&#39;eau). </li><li> Faire flotter le gri EMD immédiatement sur la surface de la première goutte de UF solution juste après l&#39;excès d&#39;eau sur la grille EM a été retiré. Et puis incuber pendant 10 sec. Assurez-vous de terminer les procédures de lavage de l&#39;eau à moins de 3 secondes avant la grille flottante sur la surface de la solution UF. Plus le temps de lavage, meilleure est la qualité sera. </li><li> Nettoyer la pince à épiler en pénétrant dans les conseils dans un papier filtre pour ~ 2 - 3 fois. </li><li> Retirer l&#39;excès de solution sur la grille par contact avec le bord de la grille avec le papier filtre, puis flotter la grille de la deuxième baisse de l&#39;UF. </li><li> Continuer étape ci-dessus 3.10 sur la deuxième goutte. </li><li> Flotter la grille sur le troisième gouttelette de solution UF et couvrir le poste de coloration pour ~ 1 min. </li><li> Etape facultative: laver la grille rapidement sur une surface de l&#39;eau comme décrit au paragraphe 3.6. Cette étape supplémentaire bénéficiera échantillons contenant plus de particules d&#39;or libres chargés ou tache de fond. </li><li> Enlever l&#39;excès de solution en contact avec le papier-filtre de the ensemble de grille arrière (opposée à la face de carbone). Séchez la grille sous un léger courant d&#39;azote gazeux à température ambiante juste après l&#39;observation d&#39;absorption sur le papier filtre la solution. </li><li> Placez la grille sur une feuille de papier filtre dans une boîte de Pétri, et couvrir le plat partiellement avec un capuchon à sécher pendant au moins 30 min sous RT. Pour certains échantillons, placer la grille dans un incubateur à 40 ° de la cuisson pendant une heure. </li><li> Rangez la grille dans une case de la grille de EM pour l&#39;avenir EM examen. </li></ol> 4. EM examen <ol><li> Alignez le TEM correctement avant EM examen des petites protéines sur la grille. <ol><li> Vérifiez la résolution de la plus haute Thon-anneau visible qui est le spectre d&#39;un film de carbone amorphe de puissance pour déterminer si le TEM a été aligné correctement. Depuis le TEM est partagée par de nombreux utilisateurs différents, le MET a souvent pas correctement aligné. </li><li> Vérifiez soigneusement le spectre de puissance sur la zone de film de carbone de l&#39;échantillon pour ajuster la conditio d&#39;alignementn de la machine. Les plus fortes Thon anneaux visibles sont mieux que la résolution ciblée. NOTE: À titre d&#39;exemple d&#39;un bon alignement d&#39;un TEM LaB6 à incandescence dont moins de 120 kV haute tension, plus de 20 Thon-anneaux peuvent être visualisées, dans lequel, la résolution correspondante peut être mieux que 5,0 Å. Cette Thon torique a été obtenue par transfert de Fourier d&#39;un film de carbone amorphe sous une défocalisation imagée de ~ 1,6 um et une dose de 20,4 e / A2 (figure 5). REMARQUE: Observation de la haute résolution Thon-anneau est une condition nécessaire, mais pas une condition suffisante pour un bon alignement. Pour réaliser effectivement les images à haute résolution, de nombreux autres paramètres sont également importants, tels que la qualité de l&#39;échantillon, dégâts d&#39;irradiation, de charge et de la dérive ainsi que le débit de dose d&#39;éclairage. </li></ol></li><li> Apportez la défocalisation revenir à près de Scherzer mise au point pour l&#39;imagerie des petites protéines sur une zone idéalement teinté. </li><li> Recherche pour la zone &quot;trouble&quot; à image. Une zone idéalement coloré est habituellement situé à proximité du bord de la surface de la tache plus épais, ce qui ressemble à un domaine &quot;trouble&quot; sur la grille depuis l&#39;épaisseur de la tache n&#39;est généralement pas répartie uniformément sur ​​la grille recouverte de carbone (Figure 6). Généralement, un faible grossissement (&lt;100x) était d&#39;aider à trouver ces zones nuageuses avant de zoom pour l&#39;imagerie. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Par rapport aux techniques conventionnelles NS, OPNS peuvent éviter des artefacts Rouleaux (Figure 1 et 9), offrant haute résolution fiable et raisonnable (~ 1 nm) des détails structurels de petites protéines (Figure 2). Par rapport à la cryo-EM, OPNS fournit un procédé à haut débit et peut examiner une grande variété de protéines et d&#39;interactions protéine-protéine 6. Cependant, OPNS a toujours ses inconvénients. Par rapport à NS classiques, OPNS implique: i) les mesures plus complexes dans la préparation des échantillons; ii) à l&#39;aide d&#39;une substance radioactive, UF; iii) le maintien de la tache fraîche en raison de la puissance de la tache inférieure UF raison de sa sensibilité à la lumière; iv) pour empêcher la précipitation de la solution UF doit être stocké dans -80 ° C et nécessite décongélation avant utilisation; v) et enfin tout UF doit être traité comme déchet dangereux. Par rapport à la cryo-EM, OPNS fournit relativement plus faibles des images de résolution et aucune garantie pour tout artefact pas encore découvertà l&#39;avenir. Effets procéduraux de fonctionnement NS sur la formation des lipoprotéines de rouleaux NS protocoles pour la préparation de protéines pour examen 16,29-36,55 peuvent être classées en trois grands groupes de méthodes 50: mélange 55, goutte-à-goutte 16, et les procédures de lavage 29. i) Le protocole de mélange nécessite le mélange préliminaire de la coloration et de la protéine échantillon à un rapport spécifique, et ensuite l&#39;application de la solution mélangée sur un film de carbone déposé sur une grille, enfin enlever l&#39;excès de solution avec du papier filtre avant séchage à l&#39;air pour EM examen 55. ii) Le protocole goutte-à-goutte comporte l&#39;application (~ 4 ul) goutte de l&#39;échantillon directement à une grille EM revêtue de sit permettant de carbone pendant environ 1 min, retirer ensuite la solution de l&#39;échantillon en excès avant l&#39;application d&#39;une goutte (~ 4 pi) de la tache solution sur le même côté de la grille. Après ~ 1 min d&#39;incubation, retirer les excess tache par contact avec du papier filtre propre, enfin soumettre à séchage à l&#39;air 16,56-58. iii) Le protocole de lavage (Figure 7) nécessitant l&#39;application de la solution échantillon à une grille EM revêtue de carbone pendant 1 min, puis lavage avec de l&#39;eau désionisée trois fois à droite après avoir enlevé l&#39;excès de solution à chaque fois par un papier filtre 3,29,30. OPNS protocole a été modifié à partir de cette procédure de lavage. Types et les effets sur la formation des lipoprotéines de rouleaux taches NS En Nouvelle-Écosse, la diffusion des électrons plus forte en raison de taches de métaux lourds fournir contraste des protéines 17-20,59. Échantillons NS peuvent en outre subir des doses plus élevées de rayonnement, et améliorer les caractéristiques de protéines par un contraste plus net négatif 8,9,60. Les taches de métaux lourds peuvent être classés comme suit: les tensioactifs anioniques, y compris l&#39;acide phosphotungstique (PTA) 16, 14 et de la méthylamine tungstate tungstate de silicium 61; cation etic, tel que l&#39;acétate d&#39;uranyle (UC) 62, UF 3,29,30, et nitrate d&#39;uranyle (ONU) 63. Une des taches NS anioniques qui est le plus couramment utilisé est le PTA 33,64-67. PTA est un hétéropolyacide, qui est généralement utilisé dans un pH de 7,0 à 7,5. PTA peut également être utilisé pour une coloration positive 3,16,68. Les charges négatives des PTA peuvent médiation des interactions électrostatiques avec des lipides insaturés chargés positivement groupes de tête, comme POPC, sur les deux surfaces de lipoprotéines et liposomes. PTA peut provoquer une formation de rouleaux à travers cette interaction 29,30 29,30 régulier même dans la salinité de la mémoire tampon (figure 1). taches d&#39;uranyle, comme d&#39;UC, UF et l&#39;ONU sont des choix alternatifs pour cationiques métaux taches et UC lourds en particulier est fréquemment utilisé pour NS d&#39;une variété de spécimens biologiques 62,69,70. Des expériences ont trouvé UF ne provoque pas de rouleaux de lipoprotéines contenant des lipides insaturés d&#39;acides gras, comme les POPC. Cependant, UF peut encore induire rouleaux lipoprotéines de formation qui contient des lipides saturés d&#39;acides gras, tels que la phosphatidylcholine de dimyristoyl (DMPC) et de 1-hexadécanoyl-2-octadécanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (PSPC). Le mécanisme détaillé de cette interaction n&#39;est pas connue. UA / UF / ONU peut tous les travaux à des valeurs de pH inférieures allant de 3,5 à 4.6. De telles valeurs de pH plus faibles ne peuvent pas convenir à certaines macromolécules biologiques qui sont sensibles à un pH de 14,71. Fait intéressant, l&#39;UA / UF peut fixer la structure des protéines en quelques millisecondes par un mécanisme inconnu 72. Contrairement PTA, UA / UF est plus semblable à un sel qu&#39;un acide. UF aurait peut donner de meilleurs résultats que 73 UA, dans lequel, les taches UF et de l&#39;ONU ont des tailles de grains plus petits que d&#39;UC (UF: 0,3 nm, de l&#39;ONU: ~ 0,5 nm) 3,74. Un exemple intéressant, la structure-comme des détails secondaires d&#39;une petite protéine (53 kDa CETP) peut être directement visualisé des micrographies premières quand UF a été utilisé comme réactif coloration négative par suite de latôt cryo-positif-coloration (cryo-PS) méthode (Figure 8) 6 rapporté. Dans cryo-PS, l&#39;échantillon coloré était surgelé en suivant cryo-EM procédure de préparation des échantillons à la place de la procédure de séchage dans le protocole OPNS, ce qui peut provoquer l&#39;effondrement de la structure secondaire. La cryo-PS est une méthode de contraste élevé et des images haute résolution des petites protéines 75. Depuis les images cryo-PS ont inversé contraste par rapport à ceux du protocole cryo-NS 22 signalé, mais ont cohérente contraste de l&#39;image à celles des images cryo-EM classiques, donc il a été nommé la méthode cryo-PS. Les images cryo-PS montrent que le réactif de coloration, Uranyle formate, pénètre dans la surface moléculaire, contestant la vision conventionnelle que la coloration peut visualiser que la structure de surface extérieure. Le mécanisme de la manière dont le formiate d&#39;uranyle pénètre dans la surface moléculaire est inconnue. Une possibilité est que le cation uranyle protéine se lie disponibles groupes carboxyle, et donc laentourant glace vitreuse est de densité inférieure à la coloration de la protéine et des groupes uranyle, agissant ainsi comme une tache positive. La méthode cryo-PS est similaire à la méthode remplacement isomorphe multiple (MIR), qui était une approche commune pour résoudre le problème de la phase de cristallographie aux rayons X 76-78. Dans MIR, des échantillons de cristal sont trempés avec une solution atome lourd, y compris l&#39;uranium, pour obtenir une forme isomorphe à sa forme native. L&#39;ajout de l&#39;atome lourd parfois n&#39;affecte pas les dimensions de la cellule de formation de cristaux ou unitaires, mais fournit des informations supplémentaires de la structure cristalline détermination 76-78. En bénéficiant du petit grain de UF, cryo-PS pourrait fournir un contraste élevé et une image haute résolution d&#39;une seule protéine, ce qui est important pour les études de structures de protéines, surtout quand on considère que presque toutes les protéines sont naturellement dynamique et hétérogène en solution. Pour la validation de cette méthode cryo-PS, nous ouvrons à toute épreuve aveugle du champ EM. </p&gt; Sel effets de la concentration sur la formation de rouleaux dans les lipoprotéines Utilisation de la ZEP traditionnelle réactif de coloration négative, la formation de rouleaux observée est plus probablement liée à des interactions lipides au lieu d&#39;interaction des protéines. L&#39;imagerie des échantillons de POPC vésicules de liposomes préparés selon la salinité considérable (0,5 M NaCl), la salinité moyenne (0,25 M NaCl), relativement faible salinité (NaCl 0,1 M), et de l&#39;eau pure (Figure 9), les micrographies électroniques montrent la formation de rouleaux était corrélée à la concentration en sel (Figure 9A - D). Utilisation UF réactif de coloration négative, aucun des rouleaux a été observée dans POPC vésicule liposome échantillon 30 (figure 2L), ce qui suggère la procédure de lavage afin de réduire rapidement la concentration en sel juste avant la coloration est une condition nécessaire mais non pas indépendamment suffisante pour empêcher rouleaux dans POPC connexe échantillons. imagerie TEM petite protéine nécessite un état ​​de focalisation quasi-Scherzer. Imagerie TEM réussie de petites protéines à plus haute résolution nécessite deux conditions critiques, un alignement correct du faisceau et un état d&#39;acquisition de focalisation proche Scherzer. i) Un alignement correct du faisceau peut être évaluée en fonction du nombre de cycles (Thon visibles du spectre de puissance) sur le transfert de Fourier d&#39;une image d&#39;un film de carbone au titre d&#39;un relativement haut défocalisation. La meilleure est la condition d&#39;alignement de la poutre, les anneaux plus Thon peut être visualisé et mesurable l&#39;image .. ii) L&#39;acquisition en vertu d&#39;un Scherzer près-focus est une autre condition critique. Une stratégie de norme traditionnelle pour imager des échantillons biologiques utilise généralement élevés défocalisation (1 - 2 pm et même plus), ce qui peut améliorer le contraste de l&#39;image échantillon biologique 79. Cette stratégie est significatif différent de la stratégie classique pour imager la structure de résolution atomique de matériaux durs, qui souventutilise un accent Scherzer près (~ 50 nm de défocalisation). Bien que, d&#39;une défocalisation plus élevé pourrait renforcer biologique contraste de l&#39;échantillon, les signaux haute résolution seraient en partie éliminés. En conséquence, la complicité de signal à haute résolution serait inférieur à un état supérieur d&#39;imagerie de défocalisation. La raison en est que, l&#39;image de TEM est la convolution de la structure de l&#39;échantillon et l&#39;instrument de FCE. Le FCT est une courbe oscillant contre la fréquence, dans lequel la courbe souvent oscillé traversant amplitude zéro à haute fréquence. Chaque fois que la FCE à travers zéro, le signal de structure échantillon à cette fréquence spécifique sera éliminé (zéro fois un nombre est égal à zéro). Le signal à cette fréquence éliminée ne peut jamais être récupéré par n&#39;importe quel algorithme de correction d&#39;FCT (un zéro divisé par zéro peut être n&#39;importe quel nombre aléatoire à la place du signal de structure d&#39;origine). Sous supérieur imagerie de défocalisation, le FCT osciller beaucoup plus agressive, donc le FCT traverse amplitude zéro plus fréquemment, par conséquent,les signaux de structure à un plus grand nombre de fréquences spécifiques seront éliminés. Les plusieurs signaux qui sont éliminés, le moins la complicité de l&#39;image auront. Notamment, la complicité de l&#39;image ne peut pas être récupéré ou corrigée par une correction de la FCE. Cependant, un certain nombre d&#39;images acquises sous différentes inachevées défocalise peut être utilisé pour remplir les lacunes à l&#39;autre pour obtenir un signal de structure complet de la structure de l&#39;échantillon au moyen d&#39;un procédé de calcul de moyenne, dans lequel une même résolution atomique de 9 à 12 peut être obtenue. La méthode de calcul de la moyenne est une approche puissante pour parvenir à la structure de certaines protéines hautement symétriques et des protéines structurellement apparentées rigides. Cependant, il reste encore difficile dans l&#39;étude structurale des petites et asymétriques protéines, en particulier pour la dynamique des structures et des protéines flexibles, tels que des anticorps et HDL. Calcul de la moyenne est basée sur l&#39;hypothèse que les particules de protéines sont identiques à la structure et la conformation mais différent dans les orientations, mais beaucoup de protéines sont connues pour subir fluctuation thermodynamique en solution. En appliquant la méthode de la moyenne sans connaître préalablement les protéines thermodynamiques fluctuations de fluctuation, la structure moyenne peut souvent provoquer des domaines ou 10,80 variation locale dans la résolution 81 dans les reconstructions cryo-EM manquant. Le succès dans la réalisation de la reconstruction 3D de petites protéines, telles que 53 kDa de la CETP et de la structure 3D d&#39;une protéine unique, tel que 160 anticorps kDa IgG1, les avantages de l&#39;utilisation de la condition de formation d&#39;image de mise au point proche Scherzer dans une condition d&#39;alignement. Bien que le contraste de l&#39;image semble faible dans les quasi-Scherzer images floues, le contraste peut être facilement améliorée en appliquant simplement un filtrage passe-bas pour réduire le bruit à haute fréquence dans le fond. Nous croyons, la quasi-Scherzer concentrer images véhiculent les signaux structurelles maximales, et peut augmenter la précision de l&#39;alignement de particules et de renforcer l&#39;efficacité dans la reconstruction 3D à une particule et particule individuelle reconstruction de la tomographie électronique.

La compréhension de la fonction des protéines nécessite la connaissance de la structure des protéines. Détermination de la structure est difficile pour des protéines dont les masses moléculaires sont à 40 - 200 kDa. Cristallographie aux rayons X est limitée par la cristallisation des protéines; résonance magnétique nucléaire (RMN) est limitée à des masses moléculaires inférieures à 40 kDa, alors que cryo-microscopie électronique (cryo-EM) a des difficultés à la fois l&#39;acquisition de l&#39;image et en trois dimensions (3D) des reconstitutions de petites protéines, dont les masses moléculaires sont inférieures à 200 kDa. Notamment, plus de 50% de protéines ont une masse moléculaire dans la gamme de 40 - 200 kDa 1,2, comme les méthodes actuelles sont difficiles à étudier des protéines de cette taille, une nouvelle méthode est nécessaire. Bien que la plupart des microscopes électroniques à transmission (TEM) sont capables de la résolution atomique, c&#39;est à dire, mieux que 3 Å de résolution, la réalisation même une structure proche de résolution nanométrique à partir d&#39;un des échantillons biologiques est assez défging 7. dégâts d&#39;irradiation, faible contraste, les écarts structurels ainsi que des artefacts tels que la déshydratation nuisent tous à haute résolution TEM imagerie 3,8. Parmi les diverses approches de TEM, cryo-EM est une méthode d&#39;arête de coupe de pointe et de réaliser des structures de résolution atomique de grandes macromolécules hautement symétriques dans des conditions physiologiques proches de 9-12. L&#39;échantillon cryo-EM est préparé éclair congélation de la solution d&#39;échantillon, l&#39;intégration dans les macromolécules glace vitreuse, qui est ensuite imagé à des températures cryogéniques, tels que la température du liquide de l&#39;azote ou de l&#39;hélium 13. Cryo-EM est avantageux en ce que les échantillons ne présentent aucun des artefacts et sont presque natif dans la structure 8-12. Cryo-EM a ses inconvénients: i) des dispositifs supplémentaires sont nécessaires pour être installé ou acheté pour mettre à jour un instrument de TEM standard pour une capacité cryo-EM. Les dispositifs comprennent: anti-contaminateur, porte-cryo, logiciels en mode à faible dose et sensi faible dosecaméra CCD tive, bien que les prix de ces appareils sont beaucoup plus bas que le prix de l&#39;instrument de TEM elle-même; ii) le fonctionnement cryo-EM a besoin plus de temps que l&#39;opération NS. Examen d&#39;un échantillon cryo-EM nécessite souvent plus de temps pour préparer des échantillons et faire fonctionner l&#39;appareil de TEM que celle de NS parce cryo-EM, il faut traiter des difficultés supplémentaires, y compris: liquide opération de température de l&#39;azote, l&#39;échantillon de charge, la dérive de l&#39;imagerie, des gradients de température, à faible dose opération de modèle, l&#39;échantillon sensibilités de rayonnement et les limites de dosage. Ces mesures supplémentaires vont ralentir la vitesse d&#39;acquisition des données utiles par rapport à l&#39;acquisition de données NS, bien que quelques images cryo-EM peuvent certainement être obtenus en 1 heure ou moins par des experts cryo-EM avec l&#39;instrument préparé avec un gradient de température équilibrée; iii) les utilisateurs ont besoin de formation supplémentaire, comme la manipulation de l&#39;azote liquide, gel grilles cryo-EM, un fonctionnement à faible dose, la mesure de la dose, la manipulation de la charge, à la dérive et de la connaissance dans l&#39;imagerie processer; iv) l&#39;absence d&#39;imagerie reproductible pour les mêmes cryo-échantillon au cours des différentes séances de TEM. Spécimens Cryo-EM sont facilement endommagées par la contamination de la glace pendant spécimen chargement et le déchargement de / vers l&#39;instrument TEM. Ce dommage est particulièrement préoccupant lorsque les échantillons sont difficiles à être isolé / purifié 14; v) de petites protéines (&lt;200 kDa de masse moléculaire) sont difficiles à imager en raison du faible contraste; vi) le faible contraste et de bruit élevé des images cryo-EM réduit la valeur de corrélation croisée entre les images, par conséquent, diminuer la précision globale de la détermination des orientations de protéine, les conformations et les classifications, en particulier pour des protéines qui sont structurellement souple et varient naturellement en solution 4,5. Coloration négative (NS) est relativement &quot;ancienne&quot; et méthode historique de tout laboratoire, avec n&#39;importe quel type EM, peut utiliser pour examiner la structure de la protéine. Brenner et Horne d&#39;abord développé le concept of de coloration, il ya un demi-siècle négatif pour l&#39;examen de virus 15. NS est réalisé par enduction de l&#39;échantillon avec des sels de métaux lourds chargées. Ce concept originaire d&#39;microscopie optique et la pratique de l&#39;intégration des bactéries dans une solution de tache fournir obscurité autour des spécimens, ce qui permet plus contraste de l&#39;image lors de la visualisation de l&#39;image négative 16. Etant donné que les ions de métaux lourds ont une plus grande capacité de dispersion des électrons par rapport aux atomes moins denses dans les protéines de 17 à 20, et aux taches revêtement de métal lourd permet une limitation de la dose la plus élevée avec un contraste amélioré. Spécimen NS peuvent fournir des images à contraste élevé 8 pour faciliter la détermination de l&#39;orientation des particules et de la reconstruction 3D que les images de cryo-EM. NS traditionnels, malheureusement, peuvent produire des artefacts induits par les interactions protéines-tache, comme l&#39;agrégation général, la dissociation moléculaire, d&#39;aplatissement et d&#39;empilage 8,21,22. Pour lipides liés proteins, comme les lipoprotéines 16,23-30, un des résultats de l&#39;artefact commun dans les particules qui sont empilés et emballés ensemble dans un rouleaux (Figure 1) 31-36. De nombreuses études de lipoprotéines, comme l&#39;électrophorèse sur gel non dénaturant de polyacrylamide gradient, cryo-EM étudie 13,29,37-40, 39,41 spectrométrie de masse, et les données de diffraction de petits angles de rayons X 42 montrent toutes les particules sont des particules de lipoprotéines isolées au lieu d&#39;empiler naturellement un ensemble formant rouleaux 21,29,30,35,42-45. L&#39;observation de la formation de rouleaux par NS classiques est peut-être causée par des interactions dynamiques entre les lipoprotéines composées des apolipoprotéines (apo) et des phospholipides qui sont structurellement souple en solution 13,29,30,46-49 et la sensibilité au protocole NS standard. Pour identifier cet artefact, l&#39;apolipoprotéine E4 (ApoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) lipoprotéines de haute densité (HDL) échantillon ont été utilisés comme un échantillon de test et la cryogénieImages EM pour une norme sans artefacts 29, le dépistage des spécimens NS préparés sous une série de conditions. En comparant les tailles de particules et de formes obtenues à partir de NS et cryo-EM, le type de réactif de coloration et de la concentration en sel se sont révélés être de deux paramètres essentiels provoquant les phénomènes Rouleaux bien connus. Ainsi, un protocole coloration négative optimisé (NPO) a été signalé. Par OPNS, le phénomène bien connu de rouleaux de apoE4 HDL a été éliminé par OPNS (figure 2A). L&#39;analyse statistique a démontré OPNS rendements des images très semblables (moins de 5% d&#39;écart) de taille et de forme par rapport à ceux de cryo-EM, mais le contraste a été éliminé. Les validations des OPNS ont été réalisées par l&#39;examen de l&#39;élimination de l&#39;artefact de rouleaux de la quasi-totalité des classes ou sous-classes de lipoprotéines échantillons de 6,29,30,50,51, notamment l&#39;apoA-I de 7,8 nm (figure 2B), de 8,4 nm (figure 2C) , 9,6 nm discoidal reconstitué HDL (rHDL) (figure 2D), 9,3 nm sphérique rHDL (figure 2E), HDL humaine plasmatique (figure 2F), le lipide libre apoA-I (figure 2G), le HDL plasmatique (figure 2H), lipoprotéines de basse densité (LDL ) (figure 2I), une lipoprotéine de densité intermédiaire (IDL) (Figure 2J), lipoprotéines de très basse densité (VLDL) (figure 2K), et des liposomes POPC (figure 2L) 30. Validations supplémentaires ont été réalisées par l&#39;imagerie des petits et asymétriques protéines, y compris la 53 kDa protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) (Figure 3A - C) 6,29, et très flexible 160 kDa anticorps IgG (figure 4A et B) 4,5,29 , 52, et deux protéines de structure bien connue, et GroEL protéasome (figure 2 M et N). Pour nécessiter de validation supplémentaire de colleagues, nous sommes ouverts à toutes tests à l&#39;aveugle sur cette méthode OPNS. OPNS comme un protocole à haut débit a également été utilisée pour étudier le mécanisme de la protéine par l&#39;intermédiaire de l&#39;examen des centaines d&#39;échantillons de petites protéines, telles que la CETP qui a été lient à diverses protéines de moins d&#39;une des conditions de la série (y compris la CETP interaction à quatre classes de lipoprotéines, recombiné HDL, plasma HDL, LDL et VLDL, avec / sans 2 anticorps, H300 et N13, sous 9 fois d&#39;incubation, y compris 3 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h et 72 h, moins de quatre rapports molaires, à savoir 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, et les trois dilutions, à savoir 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml et 0,001 mg / ml, ainsi que des échantillons de contrôle additionnels, y compris CETP seul, LDL seul, et VLDL seul, avec triples tests d&#39;expériences ci-dessus par des personnes différentes) 6,29. OPNS images de la CETP fourni des images à contraste élevé avec assez petits détails structurels; nous permettant de reconstruire une carte de densité 3D de 53 kDa sma succèsprotéine CETP II (Figure 3D - F) par la reconstruction de particules unique. En outre, les images à fort contraste OPNS nous fournissent un signal suffisant d&#39;une protéine individuelle (figure 4A - C), qui nous a permis d&#39;atteindre la résolution intermédiaire (~ 1,5 nm) d&#39;un seul (un objet, pas de moyenne) la structure d&#39;anticorps IgG 3D via la méthode (Figure 4E - J) tomographie électronique individu de particules (IPET) 5. La description détaillée de la stratégie IPET de reconstruction, de la méthodologie, processus étape par étape et l&#39;analyse de la variation structurelle ont été précédemment rapporté 4. Un film sur les procédures de reconstruction d&#39;anticorps IPET, y compris les images brutes et les résultats intermédiaires, carte de densité 3D et accueil structurelle était aussi la disposition du public par ligne sur YouTube 5. Comparaison des reconstructions 3D à partir de différentes particules anticorps individuels pourrait révéler la dynamique de protéines et conformational changements au cours des réactions chimiques 4,5. Considérant que plus de 50% de protéines ont une masse moléculaire allant de 40 à 200 kDa 1,2, le succès dans l&#39;imagerie de ces petites protéines en témoigne cette méthode OPNS est un outil utile pour pousser les frontières de EM classique vers les petites et asymétriques déterminations structurelles et découvertes mécanisme . Ainsi, le protocole détaillé est fourni ci-dessous.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:547px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Stain: Uranyl Formate</td>
			<td style="width:159px;">The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.</td>
			<td style="width:137px;">02545-AA</td>
			<td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">SYRINGE: 1ML NORM-JECT</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-491</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Syringe filter: 0.2 &#956;m&#160;</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">28145-487</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Syringe filter: 0.02 &#956;m filter (Anotop 10)</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">6809-1002</td>
			<td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:159px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Parafilm: 4 in. x 125 ft.</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">470152-246</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 300 mesh</td>
			<td style="width:159px;">Pacific Grid-Tech</td>
			<td style="width:137px;">Cu-300CN</td>
			<td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 200 mesh</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">CF200-Cu</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Tweezer: Dumont Tweezer L5</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">72882-D</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Milli-Q Advantage A10</td>
			<td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Filter Paper: Grade 1 circles</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">1001-090</td>
			<td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
			<td style="width:137px;">NA</td>
			<td>Any type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glow Discharge Unit</td>
			<td style="width:159px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:137px;">91000</td>
			<td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-520</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-524</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Filter Tips: VWR Signature 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">37001-528</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Pipet</td>
			<td style="width:159px;">Pipetman</td>
			<td style="width:137px;">F161201 and F167300</td>
			<td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy

Détermination de la structure des protéines est plutôt difficile pour les protéines de masse moléculaire entre 40 - 200 kDa. Étant donné que plus de la moitié des protéines naturelles ont une masse moléculaire comprise entre 40 - 200 kDa 1,2, une méthode robuste et à haut débit d&#39;une capacité de résolution nanométrique est nécessaire. Coloration négative (NS) microscopie électronique (EM) est une approche facile, rapide et qualitative qui a souvent été utilisé dans les laboratoires de recherche d&#39;examiner les interactions de structures de protéines et protéines-protéines. Malheureusement, les protocoles de NS conventionnels génèrent souvent des artefacts structurelles sur les protéines, en particulier avec les lipoprotéines qui se forment habituellement exposer des artefacts Rouleaux. En utilisant des images de lipoprotéines de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) en tant que norme, les paramètres clés de NS conditions de préparation de l&#39;échantillon ont été récemment examinés et présentés comme le protocole optimisé NS (OPN), un protocole NS classique modifié 3. Artefacts comme rouleaux peut être fortement limitée par NPO, fournissant en outre un contraste élevé avec assez haute résolution (près de 1 nm) des images de petites et asymétriques protéines. Ces images à haute résolution et un contraste élevé sont même favorables à une protéine individuelle (un seul objet, pas de moyenne) reconstruction 3D, tel qu&#39;un anticorps 160 kDa, par la méthode de tomographie électronique 4,5. En outre, OPNS peuvent être un outil à haut débit à examiner des centaines d&#39;échantillons de petites protéines. Par exemple, le mécanisme précédemment publiée de 53 kDa de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) impliqué l&#39;examen d&#39;imagerie et de centaines d&#39;échantillons 6. Considérant cryo-EM rarement avec succès images protéines inférieure à 200 kDa n&#39;a pas encore publié une étude portant sur le dépistage plus d&#39;une centaine conditions de l&#39;échantillon, il est juste d&#39;appeler OPNS une méthode à haut débit pour l&#39;étude de petites protéines. Espérons que le protocole OPNS présenté ici peut être un outil utile pour repousser les limites de EM et d&#39;accélérer les études électromagnétiques dans petite structure de la protéine, la dynamique et les mécanismes.

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Plus de la moitié des protéines sont de petites protéines (masse moléculaire &lt;200 kDa) qui sont difficiles pour les deux électrons imagerie de microscope et des reconstructions tridimensionnelles. Coloration négative optimisé est un protocole robuste et à haut débit pour obtenir un contraste élevé et des images de petites protéines ou des complexes asymétriques dans différentes conditions physiologiques résolution relativement élevée (~ 1 nm).

Optimisé coloration négative: un protocole à haut débit pour examen petites et asymétrique structure des protéines par microscopie électronique

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

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Research

JoVE Journal

Environment

43.0K vues.  The Molecular Foundry.  Plus de la moitié des protéines sont de petites protéines (masse moléculaire 

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

À haut débit Fluorometric Mesure de sol Potentiel activités enzymatiques extracellulaires

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Recherche

Environnement

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as plant-soil feedbacks (PSF) have large effects on plant performance, and create environmental heterogeneity that depends on the community composition. Understanding the importance of PSF for plant community assembly necessitates understanding of the role of heterogeneity in PSF, in addition to mean PSF effects. Here, we describe a protocol for manipulating plant-induced soil heterogeneity. Two example experiments are presented: (1) a field experiment with a 6-patch grid of soils to measure plant population responses and (2) a greenhouse experiment with 2-patch soils to measure individual plant responses. Soils can be collected from the zone of root influence (soils from the rhizosphere and directly adjacent to the rhizosphere) of plants in the field from conspecific and heterospecific plant species. Replicate collections are used to avoid pseudoreplicating soil samples. These soils are then placed into separate patches for heterogeneous treatments or mixed for a homogenized treatment. Care should be taken to ensure that heterogeneous and homogenized treatments experience the same degree of soil disturbance. Plants can then be placed in these soil treatments to determine the effect of plant-induced soil heterogeneity on plant performance. We demonstrate that plant-induced heterogeneity results in different outcomes than predicted by traditional coexistence models, perhaps because of the dynamic nature of these feedbacks. Theory that incorporates environmental heterogeneity influenced by the assembling community and additional empirical work is needed to determine when heterogeneity intrinsic to the assembling community will result in different assembly outcomes compared with heterogeneity extrinsic to the community composition.

Understanding the role of environmental heterogeneity in species coexistence has typically focused on types of heterogeneity that are extrinsic to the community&#8217;s species composition. We provide novel detailed methods for creating soil heterogeneity treatments using soils subject to plant-soil feedback conditioning, or heterogeneity intrinsic to the community composition.

Protocole expérimental pour l&#39;hétérogénéité du sol Manipulation des plantes induite

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Multimodales méthodes optiques Microscopie Reveal Polyp tissus Morphologie et structure dans Caribbean Reef construction Coraux

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Criblage à semi-haute de la sécheresse de tolérance potentiel dans la laitue (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) de matériel génétique dans les collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Haut-débit dépistage des Variations récalcitrant dans la biomasse lignocellulosique: Total lignine, la lignine monomères et enzymatique sucre sortie

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Administrer et détecter des marques de protéines sur les arthropodes pour la dispersion de la recherche

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. These bees select cavities that are suitable nest sites for birds, resulting in competition. The difficulty of removing bees and their defensive behavior makes a prevention protocol necessary. Here, we describe a push-pull integrated pest management protocol to deter bees from inhabiting bird boxes by applying a bird safe insecticide, permethrin, to repel bees from nest boxes, while simultaneously attracting them to pheromone-baited swarm traps. Shown here is an example experiment using Barn Owl nest boxes. This protocol successfully reduced colonization of Barn Owl nest boxes by Africanized honey bees. This protocol is flexible, allowing adjustments to accommodate a wide range of bird species and habitats. This protocol could benefit conservation efforts where AHB are located.

Preventing colonization of bird nest boxes by invasive Africanized honey bees is important for conservation efforts of nest-site limited birds. We provide an integrated pest management approach to &#34;push&#34; bees away from nest boxes with a repellant insecticide, permethrin, and &#34;pull&#34; them toward pheromone baited swarm traps.

Un protocole push-pull pour réduire Colonisation des oiseaux Nichoirs par les abeilles

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the landscape has complex and varied soil morphology, an accompanying disparity in flow paths for leachate through the soil macropore and matrix structure is present. The rate of flow through these paths is further affected by antecedent soil moisture. Lysimeters are used to quantify flow rate, volume of water and concentration of nutrients leaching downward through soils. While many lysimeter designs exist, accurately determining the volume of water and mass balance of nutrients is best accomplished with bounded lysimeters that leave the natural soil structure intact. 
Here we present a detailed method for the extraction and construction of soil core lysimeters equipped with soil moisture sensors at 5 cm and 25 cm depths. Lysimeters from four different Coastal Plain soils (Bojac, Evesboro, Quindocqua and Sassafras) were collected on the Delmarva Peninsula and moved to an indoor climate controlled facility. Soils were irrigated once weekly with the equivalent of 2 cm of rainfall to draw down soil nitrate-N concentrations. At the end of the draw down period, poultry litter was applied (162 kg TN ha-1) and leaching was resumed for an additional five weeks. Total recovery of applied irrigation water varied from 71% to 85%. Nitrate-N concentration varied over the course of the study from an average of 27.1 mg L-1 before litter application to 40.3 mg L-1 following litter application. While greatest flux of nutrients was measured in soils dominated by coarse sand (Sassafras) the greatest immediate flux occurred from the finest textured soil with pronounced macropore development (Quindocqua).

A detailed method for extraction and assembly of intact soil core lysimeters and their use for study of leachate and associated loss of nutrients from surface applied poultry litter is demonstrated.

Un protocole pour la collecte et la construction de sols Lysimètres Core

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

Haut-débit, Microscale protocole pour l’analyse des paramètres de traitement et les qualités nutritionnelles du maïs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

3 Dimensions (3D)-imprimé le modèle pour l’embryon de poisson zèbre haut débit parant

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...