Travaux microscopie électronique à Cheng de laboratoire est en partie le soutien par des subventions du NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 et P50GM082250 (à A. Frankel)), et une subvention du Programme de recherche UCSF percée biomédicale, le Prix des Débouchés et de New Technology Award.

1. Préparation de l&#39;EM grilles pour revêtement carbone <ol><li> Remplir un bécher de verre avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Utiliser une pipette en verre de laisser tomber une seule goutte de collodion (~ 20 pi, 2% dans l&#39;acétate d&#39;amyle, Sciences Electron Microscopy, PA, Etats-Unis) sur la surface de l&#39;eau. Le collodion se propage à former une couche mince en plastique à l&#39;eau / air en surface; Remarque: Une première goutte de collodion peut être utilisée pour effacer de la surface de l&#39;eau de toute particule de poussière. Après avoir retiré le film de la première goutte, la surface de l&#39;eau est exempte de poussière. </li><li> Placez les grilles EM, 400 ou 200 mesh Gilder grilles Cu achetés auprès de Ted Pella Inc (Etats-Unis), un par un sur la couche de plastique flottant à la surface de l&#39;eau; Nous lieu habituellement 50 ~ 100 grilles dans un schéma proche d&#39;emballage, avec la brillante côté de la grille vers le bas dans la couche de plastique (fig. 1A). Remarque: 400 mailles des grilles sont bons pour la routine négatifs grilles EM tache, tandis que 200 grilles mailles sont bons pour recueillir des images paires d&#39;inclinaison. </li><li> Couper une tarteCE de papier avec des dimensions légèrement plus grandes que la zone où les grilles sont placées sur la couche de plastique. Placez le papier soigneusement au-dessus de la grille (Fig. 1B), et attendre que le papier devient complètement mouillée (Fig. 1C). Remarque: Différents types de papier sont différents taux d&#39;absorption d&#39;eau. Il est important que le papier n&#39;absorbe pas l&#39;eau trop vite. Par exemple, régulièrement papier filtre n&#39;est pas bon pour cette fin parce qu&#39;il absorbe l&#39;eau trop vite et fait beaucoup de rides. Le film de carbone à base de papier froissé n&#39;est pas plat, et donc pas bon pour la collecte des images paires d&#39;inclinaison pour la reconstruction d&#39;inclinaison aléatoire 3D conique. On doit tester différents papiers pour trouver une qui me convienne. Dans notre laboratoire, nous avons été en utilisant des papiers à partir des blocs-notes acheté de l&#39;épicerie locale. Parfois, le papier journal a également été jugée appropriée. Une autre option est d&#39;utiliser le papier de riz relativement épais utilisé pour la calligraphie chinoise / japonaise. </li><li> Rapidement faire des incisions sur le film plastique autour et à proximitéle papier trempé. Immédiatement après, utiliser une paire de pinces pour ramasser le papier avec les grilles en sandwich entre le film plastique et le papier. Placez le papier dans une boîte de Pétri avec des grilles vers le haut pour le séchage de l&#39;air (Fig. 1D); Note: Il est important de laisser le papier sécher à l&#39;air. Séchage trop rapide génère de nombreuses rides dans le document. </li></ol> 2. Grilles revêtement carbone <ol><li> La machine de carbone revêtement utilisé dans notre laboratoire est un Cressington 208C Haute Turbo Vacuum Coater carbone (Ted Pella). Notre système est équipé d&#39;un moniteur Cressington épaisseur du film, qui mesure l&#39;épaisseur du film de carbone revêtu basé sur le principe que la fréquence d&#39;oscillation d&#39;un cristal de quartz est changé par la masse d&#39;un film déposé sur sa surface. Toutefois, le protocole décrit ici n&#39;a pas besoin d&#39;un moniteur d&#39;épaisseur, car il n&#39;est souvent pas disponible dans tous les laboratoires. </li><li> Aiguiser une tige de carbone en utilisant un taille-crayon (Ted Pella) et des tiges de carbone de charge en carbone enduit machine (figure 2A). Deux tiges, l&#39;une avec un bout pointu et l&#39;autre avec une extrémité plate sont placés les uns contre les autres. </li><li> Appliquer de la graisse à vide sur la moitié de la surface dépolie d&#39;une lame de verre et le placer à côté de la grille (figure 2B). Seule la moitié de la zone dépolie de la lame de verre devrait être couvert avec de la graisse à vide. Note: La zone avec de la graisse à vide ne sera pas changer de couleur après le revêtement de carbone. Le contraste entre les zones adjacentes, avec et sans graisse à vide fournit une estimation de l&#39;épaisseur du carbone revêtu. </li><li> Placez le papier avec des grilles du stade de machine d&#39;enduction de carbone. Placez la lame de verre à côté de la grille (figure 2C). Remarque: On peut aussi les grilles premier transfert revêtu du film plastique pour une lame de verre avant le revêtement, en cas de nombreuses grilles tombent du papier. </li><li> Pompe à vide de la chambre, et attendre que le vide atteint un niveau de 10 -5 Torr. Remarque: Un revêtement à faible dépression génère souvent des étincelles nombreuses, ce qui entraîne de nombreuses particules de carbone sur les grandesla grille. </li><li> Augmenter le courant très lentement. L&#39;extrémité pointue de la tige de carbone deviendra d&#39;abord rouge, puis blanc comme le courant augmente. Ne regardez pas la pointe haute luminosité directement à l&#39;œil nu. Arrêtez l&#39;augmentation actuelle lorsque le revêtement commence. La lame de verre change de couleur du blanc au gris clair et gris foncé. L&#39;obscurité de la glisse est corrélée à l&#39;épaisseur du film de carbone étant couché. Tourner le courant OFF pour arrêter revêtement lorsque l&#39;épaisseur souhaitée a été réalisée (Fig. 2D). Note: 1) Après plusieurs procédés de revêtement de carbone, revêtement de l&#39;intérieur de la cloche de verre pourrait assombrir sa couleur. Cela rend le film carbone revêtu apparaissent plus épaisse qu&#39;elle ne l&#39;est réellement. 2) Une tige de carbone affûté peut être utilisé pour le revêtement de plusieurs années. La netteté de la pointe est réduite progressivement après chaque revêtement. Le courant maximum est influencée par la netteté de la tige de carbone. Une tige fraîchement aiguisée avec de plus petit diamètre nécessite une relative inférieureactuelle de s&#39;évaporer de carbone. Plus tard revêtement peut exiger un peu plus élevée. </li><li> Purger l&#39;enceinte sous vide et retirez grilles recouvertes pour une utilisation ultérieure. Remarque 1. La méthode la plus précise de contrôler l&#39;épaisseur de carbone est d&#39;utiliser un moniteur épaisseur du film. Ou on peut calibrer la couleur qualitativement contre l&#39;épaisseur précise mesurée par le moniteur. Une épaisseur de carbone utile pour cette technique se situe entre 3 et 7 nm. </li></ol> C&#39;est une méthode simple et facile à préparer une grande quantité de grilles de carbone revêtu, généralement ~ 100 grilles par la préparation. Les grilles contiennent une couche de plastique mince, qui n&#39;a généralement pas d&#39;incidence sur la qualité de l&#39;image colorées négativement. Cependant, les grilles préparées dans cette méthode ne convient pas à cryoEM. Cette couche de plastique peuvent être enlevés par le trempage des grilles dans le chloroforme pendant plusieurs heures. 3. Préparer une solution de formiate d&#39;uranyle (0,75%) pour les négatifs EM tache. Le protocole détaillé a étédécrite précédemment 5 <ol><li> Peser 37,5 mg de formiate d&#39;uranyle dans un petit bécher; </li><li> Ajouter 5 ml d&#39;eau bouillante et remuer pendant 5 minutes dans l&#39;obscurité; </li><li> Ajouter 10 ul de NaOH 5M, continuent remuer pendant 5 minutes; </li><li> Filtrer la solution à l&#39;aide d&#39;une seringue (Fisherbrand, 13mm filtre seringue, 0,2 um, Nylon non-stériles, numéro de catalogue 09-720-5) filtre, et de stocker la solution filtrée dans un tube Falcon 8ml recouvert de papier d&#39;aluminium; Poudre de formiate Remarque. Uranyle peuvent être achetés auprès de Sciences Electron Microscopy (Hatfield, PA), numéro de catalogue 22451. Solution de formiate d&#39;uranyle est sensible à la lumière et doivent être tenus à l&#39;écart de la lumière directe, par exemple en recouvrant le tube Falcon de papier d&#39;aluminium. Une solution fraîchement préparée a une couleur jaune pâle (figure 3A). Solution de teinture peut être gardé sur le banc pour une à deux semaines avant qu&#39;elle ne commence précipitation. Formiate d&#39;uranyle est acide avec un pH ~ 4. Ajout de NaOH augmente le pH, mais il en ajoutant trop rapidementou en excès peut causer la tache à précipiter. En plus de générer l&#39;inverse, le formiate d&#39;uranyle corrige également l&#39;échantillon de protéine. Parce que le taux de fixation est si rapide, le faible pH n&#39;a généralement pas d&#39;incidence sur les conformations de protéines ou de la formation des protéines complexes 7. </li></ol> 4. Protocole pour la préparation de coloration négative EM grille. Ce protocole a été décrite en détail précédemment 5 <ol><li> La grille de carbone à décharge luminescente revêtue, à l&#39;aide PELCO GlowDischarge easiGlow système (Ted Pella Inc, États-Unis). Le courant utilisé est de 15 mA et les grilles sont lueur déchargée pendant 30 sec. Remarque. Glow-déchargée des grilles doit être utilisé juste après lueur de déchargement. Nous utilisons souvent des grilles en moins de 2 heures après la décharge luminescente. </li><li> Placez deux gouttes d&#39;eau distillée 20 pi et deux gouttes de solution de formiate de 25 pi uranyle sur un morceau de parafilm (figure 3B). </li><li> Tenir une lueur déchargée grille à l&#39;aide inverse force anti-capillarité forceps avec la voitureBon revêtement vers le haut. Note: Il est nécessaire d&#39;utiliser des anti-capillarité forceps. Sinon, l&#39;échantillon liquide sera aspiré par les grilles de la force capillaire entre les pinces. </li><li> Appliquer échantillon de protéine 2μl à la lueur déchargée grille, et d&#39;attendre 30 sec. Remarque: Le temps d&#39;attente et la durée de la décharge luminescente influence sur la concentration des protéines adsorbées sur la grille. Échantillons très dilués prennent plus de temps d&#39;adsorption. Toutefois, prolongée d&#39;adsorption peut changer la concentration du tampon, depuis les vapeurs d&#39;eau. Pour obtenir une bonne répartition des particules dans la grille nécessite peu d&#39;essai et d&#39;erreur démarche. </li><li> Blot hors de l&#39;échantillon en utilisant un papier filtre. </li><li> Touchez la surface de la grille d&#39;une goutte d&#39;eau puis éponger hors de l&#39;eau avec un papier filtre. Répéter l&#39;opération avec la chute de 2e eau. </li><li> Touchez la surface de la grille à la première goutte de brève tache. Blot hors la solution tache avec un papier filtre. </li><li> Touchez la surface de la grille de la deuxième baisse de la tache pendant 20 secondes. Blot off solution de tache avec un papier filtre. </li><li> Sécher la grille à l&#39;aide du vide. Remarque: on peut aussi laisser des grilles sur le banc ou dans une hotte chimique à l&#39;air sec. L&#39;avantage du vide sec est que l&#39;on peut observer les grilles de l&#39;EM immédiatement. L&#39;artefact possibles générées par un séchage rapide est inégale tache. </li></ol> 5. Microscope électronique à transmission <ol><li> Le microscope utilisé dans cette démonstration est un T12 Tecnai (FEI Company) équipé d&#39;une caméra Gatan 4K x 4K CCD. </li><li> Brièvement vérifier l&#39;alignement du microscope avant d&#39;insérer l&#39;échantillon; Note: Ceci n&#39;est nécessaire qu&#39;une fois par EM session. Dans un microscope modèle, à proximité de l&#39;alignement parfait ne peut être sauvé précédemment. Chargement un tel fichier alignement devrait rétablir l&#39;alignement de microscope à un état presque parfait. </li><li> Chargez la grille EM dans le seul titulaire spécimen d&#39;inclinaison standard. </li><li> Insérer porteur en CompuStage de T12. Attendez que le cycle de pompage à compléter. </li><li> Insérez le support dans la colonne. &lt;/ Li&gt; <li> Accent mis échantillon et une défocalisation désirée, habituellement-1.5um. Remarque: mise au point peut être réalisé soit par mise au point manuelle en utilisant la méthode de contraste minimum ou en utilisant la caméra CCD pour capturer des images en direct et de calculer en direct du spectre de puissance de Fourier. </li><li> Enregistrer une image en utilisant la caméra CCD; </li><li> Dans les images d&#39;échantillons négativement protéines colorées, les protéines sont souvent considérés avec un contraste blanc, à savoir la densité blanc contre un fond plus sombre. Notez que bien que les concentrations de protéines dans différentes zones de la même grille sont généralement assez semblables, on ne observent les différents niveaux de tache dans différentes zones de la même grille. Parfois, les zones pu coloration inégale ou même coloration positive (protéine apparaît sombre sur fond clair), alors que certaines autres régions ont parfaite tache. Il est souvent nécessaire de rechercher la grille pour repérer un bon endroit pour l&#39;imagerie. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Voici des exemples de bonnes images de façon négative staéchantillons Ined, rate de cheval de ferritine (figure 4A), Fab (figure 4B), 20S du protéasome archées (Fig. 4C) et nucléosome (figure 4D), sont présentés. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" /> Figure 1. Préparation des grilles de carbone revêtu d&#39;EM négatifs tache. A) Placer les grilles EM un par un dans un modèle d&#39;emballage fermé sur la surface du film au collodion. B) Placer une feuille de papier légèrement plus grand que la zone des grilles. C) Attendez jusqu&#39;à ce que le papier est complètement mouillée. D) Ramassez le papier avec les grilles d&#39;air de séchage. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" /> Figure 2. . Revêtement grilles EM avec le carbone A) Configuration de l&#39;évaporateur de carbone: placer les deux tiges de carbone dans l&#39;appareil de revêtement, avec une tige (sur la gauche) aiguisée à un bout point. La tige d&#39;autres (à droite) a une surface plane et entrer en contact avec la pointe du point de celui de la face de side. B) Placer une petite quantité de graisse à vide d&#39;un côté d&#39;une lame de verre encouragée. La zone dans le cadre noir a graisse à vide. C) Installation des grilles pour le revêtement. Les lames de verre sont utilisés pour maintenir le papier en position. La flèche indique la zone avec de la graisse à vide. D) Après le revêtement, la couleur de la lame avec de la graisse à vide couvertes ne change pas la couleur. Le contraste indique l&#39;épaisseur de carbone revêtu. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" /> Figure 3. Illustrant la procédure de coloration négative. A) fraîchement préparés (à gauche) solution de formiate d&#39;uranyle est transparent, sans signe de précipités. Après 1 ~ 2 semaines, commencer à accumuler des précipités dans le fond dans le fond du tube. B) Placez deux gouttes (~ 25 pi) d&#39;eau distillée et deux gouttes de solution de formiate d&#39;uranyle dans un morceau de parafilm. Utilisez une paire d&#39;anti-capillarité pince pour tenir une lueur déchargée recouvert de carbone grille de EM avec le côté de carboneen place. Une goutte d&#39;échantillon (~ 2μl) est placé dans la grille. C) Après une attente de 30 secondes, éponger la solution avec un papier filtre. D) Retourner la grille de toucher le côté de l&#39;échantillon de la grille avec la première goutte d&#39;eau. Répétez l&#39;étape C et D pour terminer le processus de coloration. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" /> Figure 4. Exemples de EM images d&#39;échantillons de protéines colorées négativement. Un ferritine) Cheval rate, B) fragment de liaison à l&#39;antigène (Fab), C) 20S du protéasome archées et D) nucléosome. Toutes les images ont été enregistrées avec le même grossissement. La barre d&#39;échelle est 20nm.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Coloration négative EM est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les structures 3D des échantillons protéine purifiée, comme l&#39;utilisation aléatoire d&#39;inclinaison conique 8 méthode, qui nécessite la collecte d&#39;une paire d&#39;images avec un échantillon provenant inclinée à 60 ° et un de la même zone mais non incliné, pour calculer les reconstructions 3D des complexes macromoléculaires. De plus, une coloration négative EM peut avoir de nombreuses autres applications, telles que le dépistage de deux dimensions (2D) des cristaux de 9 protéines membranaires, la visualisation des complexes de protéines dans différentes conformations 10, ou tout simplement pour la visualisation de l&#39;homogénéité et / ou de l&#39;hétérogénéité des échantillons purifiés protéines ainsi fournir des rétroactions à améliorer les procédures de purification des protéines, etc Il peut être un test puissant pour biochimistes. Dans cet article, nous avons présenté les protocoles allant de la préparation des grilles recouvert de carbone à la collecte des images de façon négative échantillons de protéines colorées en un microscope électronique. Comme illustré ici,la procédure est assez simple et facile à suivre. Si vous essayez de calculer les reconstructions 3D de l&#39;échantillon observé par la méthode d&#39;inclinaison aléatoire conique, il est nécessaire d&#39;acquérir des images paires d&#39;inclinaison. Cependant, si on effectue l&#39;analyse des particules unique est le but, les multiples images Untilted suffira. Dans les deux cas, le traitement d&#39;image supplémentaire est nécessaire et cela dépasse le cadre de cet article vidéo. Comme avec n&#39;importe quelle méthode, il ya des variations à ces protocoles. Formiate d&#39;uranyle fonctionne très bien en tant que réactif à coloration négative dans la plupart des cas. Acétate d&#39;uranyle est un autre réactif couramment utilisé coloration négative. Il fonctionne très similaire que le formiate d&#39;uranyle, mais avec une taille de grain et, dans de nombreux cas, un contraste plus faible que le formiate d&#39;uranyle. L&#39;avantage d&#39;utiliser l&#39;acétate d&#39;uranyle est que la solution dure plus longtemps que le formiate d&#39;uranyle. On n&#39;a pas besoin de préparer une solution fraîche chaque semaine un ou deux. Formiate et l&#39;acétate d&#39;uranyle deux sont acides. Une préoccupation évidente est que lesfaible pH pourrait induire des changements dans l&#39;échantillon de protéine étudiée. Les deux solutions fonctionnent aussi comme des taches de fixateurs de protéines. Une étude antérieure a montré que les deux échantillons de protéines réparer au plus vite 7. Cette fixation rapide rend le faible pH moins important. Pendant le processus de coloration, un échantillon de la protéine se fixe avant le faible pH peut induire des changements. Néanmoins, d&#39;autres négatifs réactifs tache, tels que le molybdate d&#39;ammonium et l&#39;acide phosphotungstique, peuvent donner de meilleurs résultats pour la coloration des échantillons lorsque le pH faible est une préoccupation 7. Molybdate d&#39;ammonium et l&#39;acide phosphotungstique avoir un pH approximativement neutre, mais le contraste des échantillons de protéines produites par ces taches est généralement inférieure à formiate d&#39;uranyle.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Collodion </td><td> Sciences Electron Microscopy, PA, Etats-Unis </td><td> 12620-30 </td><td> 30ml, 2% dans l&#39;acétate d&#39;amyle </td></tr><tr><td> Gilder grilles Cu </td><td> Ted Pella Inc, États-Unis </td><td> G400/G200 </td><td> 400/200 mailles </td></tr><tr><td> Cressington 208C Haute Coater carbone sous vide Turbo </td><td> Ted Pella Inc, États-Unis </td><td> 9260 </td><td></td></tr><tr><td> Double souligné tige de carbone </td><td> Ted Pella Inc, États-Unis </td><td> 58 </td><td></td></tr><tr><td> Formiate d&#39;uranyle </td><td> Sciences Electron Microscopy, PA, Etats-Unis </td><td> 16984-59-1 </td><td> 99,9% de pureté </td></tr><tr><td> Système de PELCO GlowDischarge easiGlow </td><td> Téd Pella Inc, États-Unis </td><td> 91000 </td><td> Achat à la pharmacie locale </td></tr><tr><td> Whatman n ° 1 filtre papier </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-805E </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain em: from grid preparation to image acquisition

Simple microscopie électronique de particules (EM), à la fois teinté négatifs ou congelé hydraté échantillons biologiques, est devenu un outil polyvalent en biologie structurale 1. Ces dernières années, cette méthode a obtenu de grands succès dans l&#39;étude de structures de protéines et de complexes macromoléculaires 2, 3. Comparé à d&#39;électrons cryomicroscopie (cryoEM), dans lequel la protéine hydratée échantillons congelés sont noyées dans une couche mince de glace vitreuse 4, coloration négative est une méthode simple de préparation d&#39;échantillons dans lesquels des échantillons de protéines sont noyées dans une couche mince de sel métallique lourde séchées pour augmenter 5 Contrairement spécimen. Le contraste amélioré de tache négative EM permet l&#39;examen de relativement petite des échantillons biologiques. En plus de déterminer trois dimensions (3D) la structure des protéines purifiées ou des complexes protéiques 6, cette méthode peut être utilisée à des fins beaucoup plus large. Par exemple, une teinture négative EM peut être facilement utilisé pour visualiser purifiéeéchantillons de protéines, d&#39;obtenir des informations telles que l&#39;homogénéité / hétérogénéité de l&#39;échantillon, la formation de complexes protéiques ou des assemblages de grande taille ou simplement pour évaluer la qualité d&#39;une préparation de protéines. Dans cet article, vidéo, nous présentons un protocole complet pour une utilisation EM pour observer l&#39;échantillon de protéines colorées négativement, de la préparation des grilles de carbone enduit pour négatifs EM tache pour acquérir des images de l&#39;échantillon colorées négativement dans un microscope électronique fonctionnant à tension d&#39;accélération 120 kV. Ces protocoles ont été utilisés couramment dans notre laboratoire et peut être facilement suivi par les utilisateurs novices.

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualisation des échantillons de protéines par microscopie électronique à coloration négative (EM) est devenue une méthode d&#39;analyse structurelle populaires. Il est utile pour l&#39;analyse structurelle quantitative, comme le calcul d&#39;une reconstruction 3D des molécules étudiées, et aussi pour un examen qualitatif de la qualité des préparations de protéines. Dans cet article nous présentons des protocoles détaillés pour la préparation des grilles EM, la coloration de l&#39;échantillon et la visualisation de l&#39;échantillon dans un microscope électronique. Les utilisateurs novices peuvent suivre ces protocoles à utiliser facilement et négatifs EM tache comme un test de routine, en plus d&#39;autres dosages biochimiques, pour évaluer leurs échantillons de protéines.

Visualisation protéines et de complexes macromoléculaires par EM négatif Tache: de la préparation de grille pour l&#39;acquisition d&#39;images

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

visualizing-proteins-macromolecular-complexes-negative-stain-em-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

58.3K vues.  University of California San Francisco. Visualisation des échantillons de protéines par microscopie électronique à coloration négative (EM) est devenue une méthode d'analyse structurelle populaires. Il est utile pour l'analyse structurelle quantitative, comme le calcul d'une reconstruction 3D des molécules étudiées, et aussi pour un examen qualitatif de la qualité des préparations de protéines. Dans cet article nous présentons des protocoles détaillés pour la préparation des grilles ...

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

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Bio-ingénierie

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Préparation des hydroxy-PAAm hydrogels pour découplage des effets de la mécanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Améliorer 2D et 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles utilisant macromoléculaire Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

L&#39;agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Préparation et caractérisation des nanoliposomes pour le piégeage des protéines globulaires hydrophiles bioactives

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

Utilisation de la magnétométrie pour surveiller l’incorporation cellulaire et la biodégradation subséquente des nanoparticules d’oxyde de fer synthétisées chimiquement

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...