Les auteurs remercient Teele Palumaa d&#39;assistance avec les chiffres. Financé par le projet Grant 1008046 du Conseil de recherches médicales, en Australie Santé nationale et du.

Une. Dissociée de l&#39;hippocampe Neuron Culture <ol><li> Préparer des lamelles de verre (borosilicate): <ol><li> Laver à l&#39;éthanol à 100%. </li><li> Sécher à l&#39;air sous irradiation UV. </li><li> Manteau de Poly-D-lysine (0,5 mg / ml dans un tampon de borate 0,15 M, pendant une nuit à 4 ° C). </li><li> Le jour suivant (le jour de la culture), laver 3 fois dans du PBS puis enduire de la laminine (2,5 pg / ml, de la laminine de souris normal) + 5% v / v de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS) dilué dans du PBS pendant 2 h à 37 ° C. </li></ol></li><li> Disséquer embryonnaires jour 18 (E18) hippocampes de rats et de recueillir dans PBS contenant du calcium et du magnésium, refroidi sur glace. REMARQUE: tous les protocoles expérimentaux impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité d&#39;éthique animale de l&#39;Université de Melbourne. </li><li> Préparer la papaïne et de solutions de DNase I de la papaïne dissociation Kit selon les instructions du fabricant. <ol><li> Ajouter la solution de 50 ul DNase I à 1 ml de solution de papaïne. </li><li> REMARQUE: Une foisd&#39;abord préparée, la solution de papaïne et les solutions DNase I peuvent être distribués séparément en portions aliquotes (0,5 ml et 25 uL d&#39;aliquotes de la papaïne et de la DNase I, respectivement) et stockés à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Enlever autant que possible PBS et incuber hippocampe (une litière à partir d&#39;embryons) avec 1 ml de papaïne / solution de DNase I à 37 ° C pendant 15 à 20 min. Tapotez doucement le tube pour mélanger le contenu de deux fois au cours de la période d&#39;incubation. </li><li> Triturer le tissu hippocampique doucement (en évitant la génération de bulles) avec une pipette Pasteur siliconée 10-15x-poli à la flamme jusqu&#39;à ce que la dispersion de la cellule est obtenue et peu, s&#39;il y en a, des morceaux de tissu restent non dissocié. </li><li> Couche avec précaution la suspension cellulaire dissociée sur un coussin de 3 ml de 4% p / v de sérum albumine bovine (BSA) dans la solution de Hanks Balanced Salt plus additifs (HBSS +, voir la section 1.6.1). <ol><li> Préparer cette solution de gradient par étape en dissolvant le BSA à température ambiante sans agitationanneau dans HBSS contenant 2 mM de CaCl2, 1 mM MgSO 4, 4 mM NaHCO 3 et 40 mM de glucose (HBSS +), puis filtre stérile et conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> Centrifugeuse 100 xg, 7 min dans une centrifugeuse de paillasse avec un rotor swing-out. </li><li> Retirer le surnageant en prenant soin de ne pas aspirer le culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire en douceur avec une flamme poli (silicone) de pipette Pasteur (ou un bleu pointe de la pipette 1 ml) dans 1 ml de milieu Neurobasal complète (avec 2% de B27, 0,5 mM de L-glutamine supplémenté avec 1% de FCS). </li><li> Comptez deux aliquotes de 10 ul en utilisant un hématimètre (NB seulement compter les cellules en phase de lustrage et cellules &quot;live&quot;). </li><li> Plate neurones primaires sur des lamelles de verre revêtues préparées à l&#39;avance (0,75-1 x 10 5/18 mm lamelle en plaque de 12 puits). Immédiatement avant le placage, aspirer l&#39;excès de solution de laminine / sérique de lamelles et le remplacer par un milieu de culture de neurones primaires (voir ci-dessous). NB Le n requisombre de lamelles doit être déterminé à l&#39;avance que la préparation de la lamelle est commencée la veille de la culture (voir l&#39;étape 1.1). </li><li> Culture rat primaire E18 Les neurones de l&#39;hippocampe pour jusqu&#39;à 21 jours in vitro (DIV) en milieu Neurobasal, 2% B27, 0,5 mM de L-glutamine additionné de 1% de FCS (inactivé par la chaleur). Effectuer un changement de la moitié de moyenne à 7 DIV et hebdomadaire par la suite. L&#39;anti-mitotique fluorodésoxyuridine / uridine est ajouté à 7 DIV; 1/1, 000 dilution de 10 mM de chaque nucléoside) pour empêcher la prolifération des cellules gliales. </li></ol> 2. Incubation de l&#39;anticorps avec Live neurones <ol><li> Au cours de la première semaine de la culture, les neurones se développent tonnelles dendritiques et par semaine 2-3, les neurones ont suffisamment mûri pour être soumis à la synaptogenèse 6,7. <ol><li> Au temps expérimental points / s, appliquer l&#39;anticorps primaire des puits en triple contenant les neurones embryonnaires primaires sur des lamelles. Ajouter une fraction aliquote de l&#39;anticorps directement dans le milieu de culture deles neurones primaires de la dilution finale désiré Remarque: Dans notre exemple, un antisérum polyclonal de lapin dirigé contre une forme sécrétée recombinante de la protéine ont été dilués au 1/500 en ajoutant 2 ul à 1 ml de milieu de culture dans les puits, une centrifugation pendant 10 min , 13 000 xg, RT peut être incorporé avant de prendre une aliquote d&#39;anticorps que cela va enlever toute matière particulaire et peut aider à réduire le fond. </li><li> Pour les témoins de sérum pré-immun, ajouter une quantité équivalente de sérum pré-immun (à la même dilution finale). Si pas de sérum pré-immun est disponible, ajouter le volume équivalent de milieu Neurobasal ou PBS (pas de contrôle de l&#39;anticorps primaire). En variante, si un anticorps primaire approprié est disponible qui reconnaît la région intracellulaire / s de la protéine, cet anticorps peut être ajouté à un contrôle de puits dans le but de tester la spécificité de la coloration de la surface. </li><li> Remettre les cellules dans l&#39;incubateur de culture pendant 1-4 h (cette période d&#39;incubation peut être déterminée empiriquement). Dans notre experiments, ​​l&#39;anticorps était présent pendant toute la période, bien que la conception expérimentale pourrait incorporer une impulsion d&#39;anticorps suivie d&#39;une autre période d&#39;incubation après lavage de départ (une expérience pulse-chase) afin d&#39;évaluer l&#39;évolution dans le temps de l&#39;internalisation. Facultatif: Cette incubation peut être réalisée à température ambiante ou même sur de la glace pour ralentir le taux basal de l&#39;internalisation de la protéine, si nécessaire. Si elle est effectuée dans un environnement non-contrôlé de CO 2, le milieu doit être remplacé par celui qui n&#39;est pas en mémoire tampon bicarbonate avant l&#39;addition de l&#39;anticorps / antisérum. ATTENTION: Les cultures de neurones matures (&gt; 14 jours, et en particulier en culture des neurones embryonnaires de souris) ne tolèrent pas bien les changements de moyennes complets. </li></ol></li><li> Nous avons utilisé des temps d&#39;incubation pour cette première étape de l&#39;internalisation des anticorps de 1 h, 2 h et 4 h avec de bons résultats bien que le temps optimal dépend de l&#39;abondance de la protéine d&#39;intérêt ainsi que la dynamique de la traite des protéines dans la cells à l&#39;étude. REMARQUE: Les images à deux couleurs représentées sur résultats représentatifs ont été obtenus avec une incubation de 1 heure à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire. </li><li> Après incubation pendant la période désirée, aspirer hors du milieu contenant l&#39;anticorps. Laver les puits en douceur mais rapidement une fois avec du PBS à température ambiante. </li></ol> 3. Demande d&#39;anticorps secondaire de cellules fixes, Unpermeabilized <ol><li> Fixer les neurones avec du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate pH 7,2, 5 min à température ambiante Remarque: pour de meilleurs résultats, utilisez fixateur fraîchement préparé; également utiliser correctif qui a été stocké à -20 ° C et complètement décongelés afin que personne ne paraformaldéhyde précipité est évident . ATTENTION: fixateur Paraformaldéhyde doit être préparé et manipulé dans une hotte. </li><li> Retirer correctif à partir de puits (transfert de conteneur de déchets liquides dans une hotte) et rincer 3 fois avec PBS. <ol><li> Facultatif: Si vous le souhaitez, pour économiser sur les réactifs d&#39;anticorps, les lamelles peuventêtre soigneusement retirée de la plaque de 12 puits avec une pince et placé du côté de la cellule-haut, sur une feuille de Parafilm prévue sur la base d&#39;une plaque de culture jetable. </li><li> Les solutions peuvent alors être déposés à la pipette doucement sur les lamelles couvre-objet de sorte qu&#39;elles soient complètement couvertes sans l&#39;injection d&#39;une solution sur le bord de la lamelle couvre-objet sur le Parafilm. </li><li> Cette technique est appropriée pour des incubations à court terme (1-2 h), cependant plus incubations (par exemple la nuit) devraient être effectuées dans une chambre humidifiée. En variante, les lamelles peuvent être placés de nouveau dans les puits de la plaque à 12 puits pour l&#39;incubation pendant une nuit et un volume suffisants doivent être ajoutés afin de s&#39;assurer que les lamelles ne se dessèchent pas. </li></ol></li><li> Bloc pendant 30 min à température ambiante avec 5% de BSA dans du PBS (Remarque: Ne pas ajouter de détergent à la solution de blocage à ce stade, car il est important que les cellules ne sont pas perméabilisées). </li><li> Afin de marquer la protéine de surface avant de procéder à la détectiontion de la protéine intériorisée, appliquer le premier marqué par fluorescence 2 ° anticorps de choix. Remarque: Dans l&#39;exemple décrit ici, l&#39;antisérum primaire a été soulevée dans le lapin (anticorps en interne) à une isoforme sécrétée recombinante 4. Ainsi, pour le premier anticorps secondaire pour détecter la région extracellulaire de l&#39;isoforme transmembranaire à la surface des neurones unpermeabilized, nous avons utilisé âne anti-lapin DyLight 649 (1/200 dilué dans du PBS contenant 5% de BSA). Il est recommandé de centrifuger les solutions d&#39;anticorps secondaire dilué (10 min, 13 000 xg, RT) avant de les utiliser. </li><li> Incuber les lamelles pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Lavez lamelles (dans les puits), 2x 5 min avec du PBS. </li></ol> 4. Blocage avec excès vierge 2 ° anticorps <ol><li> Bloquer les neurones unpermeabilized avec une forte concentration (&gt; 0,1 mg / ml) de non marqué anticorps 2 °. <ol><li> L&#39;anticorps 2 ° sans étiquette devrait être soulevée contre l&#39;espèce dans laquellel&#39;anticorps primaire a été élevée (dans ce cas le lapin) par incubation pendant une nuit à température ambiante. </li><li> Pour ce protocole, un fragment F ab AffiniPure Chèvre anti-lapin IgG (H + L) a été utilisé à une concentration de 0,13 mg / ml. NOTE: L&#39;incubation d&#39;une nuit a été jugé essentiel comme une période d&#39;incubation plus court (2 heures) était insuffisante pour permettre un blocage complet de l&#39;anticorps primaire qui n&#39;a pas été entièrement fixé par l&#39;anticorps secondaire marqué. </li></ol></li><li> Lavez lamelles (dans les puits), 2x 5 min avec du PBS. </li><li> Après cette étape de blocage, après la fixation des cellules avec du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate pH 7,2, 5 min à température ambiante. Rincer avec du PBS (2x) après élimination du fixateur (transfert fixateur de réservoir de déchets liquides dans une hotte). </li></ol> 5. Perméabilisation et l&#39;application de la deuxième fluorescence conjugué 2 ° anticorps <ol><li> Et bloquer perméabiliser les cellules avec 5% de BSA dans du PBS contenant 0,1% de Triton-X-100 à la chambre temperature pendant 30 min. </li><li> Retirer la solution de blocage (en prenant soin de ce que les lamelles ne se dessèchent pas). Ajouter la 2 ° anticorps deuxième fluorescence conjugué marqué avec un fluorophore différent. <ol><li> REMARQUE: Il doit être possible de distinguer ce tag fluorophore de celui précédemment utilisé, en fonction des filtres d&#39;excitation / émission disponibles sur le microscope confocal (voir ci-dessous). </li><li> Pour l&#39;exemple présenté dans ce protocole, un Alexa Fluor 488 âne conjugué anti-lapin 2 ° anticorps a été utilisé (1/200 dans du PBS, 5% de BSA et 0,1% de Triton-X-100). Incuber 2 heures à température ambiante, puis retirer la solution d&#39;anticorps de 2 °. </li></ol></li><li> Lavage des lamelles couvre-3x 5 min avec du PBS et, enfin, se laver rapidement à l&#39;eau déminéralisée. </li></ol> 6. Montage et imagerie <ol><li> Mont lamelles couvre sur des lames de verre avec un milieu contenant de montage antifade aqueuse (par exemple Vectashield) et laisser sécher. Conserver dans l&#39;obscurité à 4 ° C pour oppréservation de timal de l&#39;intensité du signal fluorescent. </li><li> Image en immunocolorée cellules sur un microscope confocal. <ol><li> Excitation et d&#39;émission des filtres appropriés pour la détection des deux signaux de fluorophores doivent être disponibles. </li><li> Si différentes conditions expérimentales doivent être comparés (par exemple, les taux d&#39;internalisation de moins de 8,9 dépolarisés ou les conditions de contrôle), veiller à ce que tous reproduisent des lamelles de différentes conditions sont imagées avec les mêmes paramètres d&#39;acquisition d&#39;images. La densité intégrée des régions standards d&#39;intérêt ou les attributs de punctas (nombre, taille) des images résultant peut alors être mesurée en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image standard (par exemple Fidji / ImageJ, Metamorph). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins.">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li><li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression.">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li><li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons.">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li><li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines.">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li><li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures.">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li><li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture.">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li><li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+reversible,+activity-dependent+dendrite+formation.">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li><li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP.">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li><li>Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity.">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li><li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1/NgCAM+trafficking.">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li><li>Arancibia-C&#225;rcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+localization,+surface+stability+and+endocytosis+of+neurotransmitter+receptors+by+antibody+labeling+and+biotinylation+approaches.">Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches.</a> The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).</li><li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation).">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li><li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+adaptors+&#8211;+social+networking+at+the+plasma+membrane.">Endocytic adaptors &#8211; social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La technique décrite ici est complémentaire de celle de la biotinylation de la surface cellulaire (passé en revue par ARANCIBIA-carcamo et al.) 12 et elle est la méthode de choix pour la conservation de l&#39;information au sujet de la localisation subcellulaire de la protéine internalisé, pourvu d&#39;un anticorps primaire approprié pour une épitope extracellulaire est disponible. En outre, la quantification du trafic de protéines / internalisation au fil du temps peut être effectué (en f...

En instituant la fonction des protéines nouvellement identifiées, l&#39;enquête de la localisation subcellulaire et le trafic de la protéine en question peut fournir des indices importants sur le rôle probable / s de 1,2 de protéine. L&#39;analyse bioinformatique du transcriptome du néocortex développement 3 nous a fourni une liste de gènes présentant une expression altérée au cours de cerveaux de souris corticogenèse. Nous avons alors adopté une approche de coup de grâce de gène de s&#39;assurer que la protéine codée par l&#39;un de ces gènes, sez6, a un rôle clé dans le développement des neurones. Nous avons observé que le gène lié à la saisie-6, ou Sez6, la protéine se trouve dans les dendrites en développement et est également présent dans les épines dendritiques, des structures spécialisées sur les dendrites qui reçoivent et intègrent les signaux excitateurs. De plus, lorsque cette protéine est absente, les dendrites et les synapses excitateurs ne parviennent pas à former correctement 4. L&#39;isoforme dominante probable de la protéine présente des caractéristiques d&#39;un transmembranrécepteur de l&#39;e, bien que, lors de la distribution subcellulaire de la protéine immuno-a été examinée par microscopie confocale ou par microscopie immuno plupart, sinon la totalité, du signal apparu associé à de petites vésicules dans le compartiment somato-dendritique avec peu ou pas de protéine marquée sur la membrane plasmique à la surface de la cellule. Afin de montrer définitivement que ce récepteur putatif avec un grand domaine extracellulaire prédit est traite à la membrane plasmique, nous avons adopté une approche de cellules vivantes en utilisant l&#39;antisérum nous avions généré à une portion extracellulaire de la protéine à marquer la protéine à la surface cellulaire. En combinant cette approche &quot;alimentation anticorps&quot; avec deux applications d&#39;anticorps secondaire différentielle marqué séparées par une étape de blocage vaste et une étape de perméabilisation, nous avons pu identifier deux piscines différentes de protéines qui se distinguent par liaison à des anticorps secondaires marqués par fluorescence portant Déess différentetags Ent. Ainsi, nous avons pu distinguer protéine qui avait été intériorisé par endocytose lors de l&#39;étape d&#39;incubation anticorps de la protéine qui soit resté sur la surface de la cellule ou a été victimes de la traite à la surface au cours de cette période. En utilisant cette méthode, nous avons établi que la protéine d&#39;intérêt est un trafic à destination et à partir de la surface cellulaire dans les neurones. Par conséquent, cette technique relativement rapide et simple s&#39;est avéré plus instructif que les méthodes d&#39;immunocytochimie traditionnels ou pré-enrobage microscopie électronique immunologique, malgré le fait que nous avons utilisé le même antisérum polyclonal de lapin pour toutes ces techniques. Cette technique est généralement applicable à n&#39;importe quelle protéine transmembranaire a fourni une bonne anticorps reconnaissant des épitopes de domaines extracellulaires est disponible. La technique a déjà été utilisée pour étudier le trafic de récepteur du récepteur de glutamate GluR1 sous-unité 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

Afin de démontrer la localisation à la surface cellulaire d&#39;un récepteur transmembranaire putatif dans des neurones en culture, nous avons appelé la protéine sur la surface des neurones vivants avec un anticorps primaire spécifique dirigé contre une portion extracellulaire de la protéine. Étant donné que les récepteurs sont victimes de trafic vers et depuis la surface, si les cellules sont perméabilisées puis après fixation à la fois à la surface cellulaire et la protéine interne sera détecté par le même anticorps secondaire marqué. Ici, nous avons adapté une méthode utilisée pour étudier le trafic de la protéine («d&#39;alimentation d&#39;anticorps») de façon différentielle des protéines de l&#39;étiquette qui a été internalisée par endocytose au cours de l&#39;étape anticorps d&#39;incubation et de protéines qui soit resté sur la surface de la cellule ou est d&#39;un trafic à la surface au cours de cette période, . La capacité de distinguer ces deux groupes de protéines a été rendu possible grâce à l&#39;incorporation d&#39;une étape de blocage pendant la nuit avec l&#39;anticorps secondaire non marqué très concentré après une incubatio initialen des neurones unpermeabilized avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence. Après l&#39;étape de blocage, la perméabilisation des neurones admis détection de la piscine internalisée avec un anticorps secondaire fluorescent marqué avec un fluorophore différent. Grâce à cette technique, nous avons pu obtenir des informations importantes sur la localisation subcellulaire de ce récepteur putatif, révélant qu&#39;il était, en effet, de la traite à la surface cellulaire dans les neurones. Cette technique est largement applicable à toute une gamme de types de cellules et des protéines de surface cellulaire, en fournissant un anticorps approprié à un épitope extracellulaire est disponible.

La technique d&#39;immuno-coloration fluorescente bicolore présenté ici est utile pour le marquage des domaines extracellulaires des protéines transmembranaires dans des cellules vivantes (représenté schématiquement sur ​​la figure 1). Au cours de la période d&#39;incubation, les immunoglobulines se lient les épitopes accessibles et une proportion de la population de molécules de protéine, conjointement avec l&#39;anticorps lié, est endocytose. En outre, la protéine nouvellement synthét...

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Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Nous décrivons un procédé pour marquer la protéine à la surface des neurones vivants en utilisant un anticorps polyclonal spécifique à des épitopes extracellulaires. Protéine liée par l&#39;anticorps sur la surface de la cellule et ensuite internalisée par endocytose peut être distinguée de la protéine restante sur, ou à un trafic, de la surface au cours de l&#39;incubation.

Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

differential-labeling-cell-surface-internalized-proteins-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K vues.  The University of Melbourne.  Nous décrivons un procédé pour marquer la protéine à la surface des neurones vivants en utilisant un anticorps polyclonal spécifique à des épitopes extracellulaires. Protéine liée par l'anticorps sur la surface de la cellule et ensuite internalisée par endocytose peut être distinguée de la protéine restante sur, ou à un trafic, de la surface au cours de l'incubation. 

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) de fluorescence protéines marquées dans les épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de culture

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Recherche

Neurosciences

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Enregistrement simultané des signaux calciques de neurones identifiés et le comportement alimentaire des Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe cultures Slice

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.