Ce travail a été financé par une subvention des IRSC (MOP394808) et une chaire de recherche du Canada à CMCEWO était le récipiendaire d&#39;une bourse d&#39;études supérieures du CRSNG.

Remarque: Ce protocole est largement compatible avec différents modèles monocouches plaqué cellules / tissus culture, les schémas de traitement de la toxicomanie, et les objectifs en matière d&#39;étiquetage. Ainsi, en utilisation réelle, de nombreux paramètres spécifiques varient en fonction de la conception expérimentale. Ici, les références à ces paramètres définis par l&#39;utilisateur sont génériques. conditions d&#39;exemple, tel qu&#39;il est utilisé pour obtenir les résultats représentatifs, sont inclus en italique. 1. Solutions <ol><li> Préparer du tampon de lavage en mélangeant du tampon Tris 0,1 M hypertonique (300 mM) de solution saline et 0,05% de polysorbate 20; pH 7,4 à température ambiante. </li><li> Préparer un tampon de blocage. À 0,05 M Tris-Buffered hypertonique (300 mM) Saline ajouter 0,05% polysorbate 20, 3% de sérum albumine bovine (BSA) et 0,1% de gélatine de poisson froid de la peau et ajuster le pH à 7,4 à température ambiante. </li><li> Préparer le diluant d&#39;anticorps en ajoutant 0,05% polysorbate 20, 1% de BSA, 0,1% poisson froid gélatine de peau à 0,05 M Tris-Buffered hypertonique (300 mM) Saline et ajuster le pH à 7,4 à 4 o C. Remarque: le pH du tampon Tris est dépendant de la température. Autrement dit, un changement de température va changer le pH de la solution. Par souci de cohérence, ces tampons doivent toujours être pH ajusté à la température à laquelle ils seront utilisés. </li></ol> 2. Culture cellulaire Remarque: les protocoles de culture de cellules appropriées seront varier en fonction du type de cellule (s) utilisé. Ces procédures doivent être optimisés séparément. Détaillées des méthodes de culture cellulaire sont disponibles, y compris 16. Une procédure similaire a été utilisée pour obtenir les résultats représentatifs, avec des différences notables: <ol><li> Culture dorsales neurones des ganglions de la racine à partir d&#39;animaux adultes comme décrit 12. Utilisation du milieu de croissance des neurones adultes pour cultiver les cellules. Réduire la densité des cellules gliales par prédépôt, au lieu de glutamate. Il en résulte une culture de neurones-glie mixte cultivées sur des lamelles de verre rondes de 12 à au moins 30 à 60 par plaque neurones et les cellules gliales qui accompagnent passé à approximatEly 40% de confluence. Il convient de noter que les neurones dans une culture primaire ne reproduire et seront poussés hors de la plaque de cellules gliales par co-cultivées si la glie sont autorisés à croître de façon excessive. Afin d&#39;éviter d&#39;affecter les neurones, la réduction physique de nombres gliales est préférable de méthodes pharmacologiques chimiques /. Remarque: Pour les fins de ce protocole, nous supposons que les cellules d&#39;intérêt sont cultivées à leur expérimentalement état souhaité et monocouche plaqué. Nous constatons que le placage sur des lamelles de verre de 12 rondes dans 24 plaques à puits pour être plus pratique. Tous les volumes et les procédures décrites sont appropriées pour une lamelle dans un puits d&#39;une plaque à 24 puits. </li></ol> 3. traitement de la toxicomanie de cellules cultivées Note: séquentielle multiple, ou se chevauchent, les traitements médicamenteux sont possibles. Les médicaments, les doses / concentrations et des durées d&#39;exposition utilisée dépendra de l&#39;expérience spécifique. <ol><li> Supprimer le milieu de croissance d&#39;origine 16 </sup&gt; et de le remplacer par un milieu contenant le médicament (s) d&#39;intérêt à la concentration choisie (s). Dans ce cas, utilisez 10 uM de morphine en solution dans une solution saline ou utiliser une solution saline comme témoin. Remarque: Il est important que chaque répétition indépendante (généralement un seul de culture de plaque de 24 puits) contient les mêmes conditions de contrôle commun. Cela permettra à la normalisation des données à travers les répétitions, qui corrige la variabilité inter-procès. </li><li> Incuber les cellules dans des conditions de croissance d&#39;origine 16 pendant 48 heures. </li><li> Pour les traitements médicamenteux ultérieurs, répétez les étapes 3.1 et 3.2 avec deltorphine 1 uM, SNC80 1 uM, ou d&#39;un véhicule et incuber pendant 60 min 12. Deltorphine II solubiliser dans l&#39;eau et solubiliser SNC80 à 10 mM dans du HCl à 40 uM et de traitement par ultrasons, on le dilue à 1 mM dans de l&#39;eau. Remarque: Ce protocole prend le médicament (s) ont été solubilisés de telle sorte qu&#39;ils peuvent être dissous à la concentration (s) souhaitée dans le milieu de culture choisi. Des procédures appropriées pourtel solubilisation varie en fonction de la drogue en question et doit être optimisé séparément. </li><li> Laver les cellules doucement, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage. Effectuez chaque lavage en aspirant doucement le liquide du puits, puis rapidement, et doucement, le remplissage du puits avec une solution fraîche, comme vous le souhaitez (dans ce cas avec un tampon de lavage). </li></ol> 4. Fixation et Immunocytochemistry Remarque: Les objectifs en matière d&#39;étiquetage spécifiques varieront par l&#39;expérience. Dans notre utilisation, nous avons appelé les récepteurs opioïdes delta (DOR) et Rab5, Rab 11, et LAMP1, comme nous le verrons. Les anticorps spécifiques utilisés dépendront de l&#39;expérience spécifique. Conditions d&#39;étiquetage optimales dépendent de l&#39;anticorps spécifique (s) utilisés. Une discussion beaucoup plus complète de ce thème est ci-dessous. <ol><li> Fixer les cellules par immersion dans 300 ul ~ 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de solution saline tamponnée au phosphate pendant 10 min à 37 ° C. Remarque: il est important que le para 4%formaldéhyde être préparée en raison de l&#39;auto-fluorescence résultant de l&#39;utilisation de paraformaldéhyde préalablement congelé. </li><li> Laver les cellules avec douceur, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage, comme décrit dans 3.3. </li><li> Incuber les cellules dans 300 ul de tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps primaires dans 300 ul de diluant d&#39;anticorps pour 48 heures à 4 ºC. Dans notre utilisation, les anticorps primaires contre DOR (lapin anti-DOR) et l&#39;un des: Rab5 (souris anti-Rab5), Rab 11 (souris anti-Rab11), et LAMP1 (chèvre anti-LAMP1). </li><li> Laver les cellules avec douceur, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage, comme décrit dans 3.3. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps secondaires conjugués à des fluorophores différents (voir la discussion ci-dessous) dans 300 ul de diluant d&#39;anticorps pendant 1 heure à température ambiante. En cela, et toutes les étapes ultérieures, protéger les cellules de la lumière. Pour obtenir les résultats représentatifs, utiliser émettant dans le vert fluorophore conjugué anti-lapin et either un fluorophore conjugué anti-souris émettant dans le rouge ou anti-chèvre conjugué à un fluorophore émettant dans le rouge. </li><li> Laver les cellules avec douceur, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage, comme décrit dans 3.3. </li><li> Retirez les lamelles de 12 rondes de plaques à 24 puits en laissant ~ 1 ml de tampon de lavage dans chaque puits, maintenant la plaque à ~ 45 °, et le levier de la lamelle hors du sol et à l&#39;aide de pinces fines. La lamelle viendra en appui contre la paroi du puits, d&#39;où il peut être facilement éliminé en utilisant la pince. </li><li> Montez le lamelles, cellulaire à l&#39;envers, sur des lames de microscope avec anti-décoloration milieu de montage. </li></ol> 5. Paramètres de microscope <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un objectif à fort grossissement (100X), d&#39;abord localiser une cellule représentant à imager utilisant épifluorescence. </li><li> Configurez les paramètres de capture d&#39;image pour enregistrer 8 bits non compressés images TIFF de chaque canal marqué (pour la détection de chaque fluorophore utilisé par exemple, 488 nm et 594 nm), à l&#39;image de chaque séquence de canal (soit par ligne ou cadre), et de 4 à 6 scans moyenne pour l&#39;image finale. Résolution d&#39;image optimale sera spécifique au microscope, mais 1024 x 1024 donne généralement de bons résultats. </li><li> Basculer sur la voie d&#39;imagerie confocale et de se concentrer à un plan z à travers le centre de la cellule. </li><li> Optimiser sténopé (typiquement 1 unité Airy), la puissance du laser, et la tension de tube photomultiplicateur (gain) et le décalage pour chaque canal. Enregistrer / enregistrer ces paramètres. Utilisez les mêmes réglages du microscope pour l&#39;imagerie de toutes les cellules marquées pour toute paire de cible donnée dans le même répliquée. Remarque: Ce processus se traduira généralement en photoblanchiment suffisante que cette cellule ne doit pas être reproduite pour analyse. </li></ol> 6. Imaging <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un objectif à fort grossissement (par exemple, 100X), localiser une première cellule à imager à l&#39;aide épifluorescence. </li><li> Basculer sur la voie d&#39;imagerie confocale et de se concentrer à un plan z à travers le centre de la cellule. JEf disponibles, zoom utiliser des logiciels / culture de restreindre la zone de numérisation de la cellule d&#39;intérêt. </li><li> Capture d&#39;images pour chaque canal marqué en utilisant les paramètres précédemment établis. Répétez les étapes 6.1 à 6.3 à l&#39;image 15 ou plusieurs cellules par condition par répétition pour assurer un échantillon suffisant. </li></ol> 7. La colocalisation Analyse <ol><li> Ouvrez la paire d&#39;images (par exemple, «vert» et «rouge») d&#39;une cellule dans ImageJ. Utiliser les images&gt; Couleur&gt; Fusionner les couches ... commande pour générer une image RVB. </li><li> Tracez une sélection autour de la cellule d&#39;intérêt. Utilisez le ImageJ plugin &quot;CFP colocalisation&quot; (11; disponible à partir https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) pour quantifier colocalisation des cibles dans la cellule sélectionnée. </li><li> Notez la mesure de colocalisation souhaitée (typiquement r de Pearson 17). Répétez les étapes 7.1 à 7.3 pour chaque cellule imagé. </li></ol&gt; 8. Normalisation des données <ol><li> Calculer la moyenne des valeurs de colocalisation enregistrées des conditions de contrôle communs de chaque répétition de chaque condition d&#39;étiquetage. Remarque: Par exemple, la moyenne des valeurs de colocalisation des neurones dans le &quot;véhicule de 48 h, 60 min véhicule&quot; condition de médicament dans chacune des trois répétitions indépendants dans chacune des trois conditions d&#39;étiquetage (récepteur et chacun des trois compartiments). </li><li> Multiplier les moyens par (-1) pour donner le décalage pour chaque répétition dans chaque état de l&#39;étiquetage. Ajoutez le décalage pour chaque répétition dans chaque état de l&#39;étiquetage à chaque valeur de colocalisation dans cette répétition. Note: Ceci normaliser les données telles que la mesure de colocalisation moyen pour la condition de contrôle commun est 0 dans chaque répétition de chaque condition d&#39;étiquetage. </li><li> Mutualiser les données de toutes les répétitions de chaque condition d&#39;étiquetage. Remarque: Les changements dans colocalisation peuvent maintenant être analysées à travers les répétitions. Anal statistiqueana- dépendra conception expérimentale, mais implique généralement une analyse de variance (Anova) suivie par des tests appropriés post-hoc (par exemple, Tukey). Pour les ressources statistiques, voir, par exemple, 18. </li></ol>

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	<li>Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+G+protein-coupled+receptors.">Trafficking of G protein-coupled receptors.</a> Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).</li><li>Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+GPCRs+by+endocytic+membrane+trafficking+and+its+potential+implications.">Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).</li><li>Hislop, J. N., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+endocytic+trafficking+of+G-protein-coupled+receptors.">Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors.</a> Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).</li><li>Nagi, K., Pi&#241;eyro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptor+signalling:+implications+for+the+development+of+analgesic+tolerance.">Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance.</a> Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).</li><li>Whistler, J. L., Enquist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+postendocytic+sorting+of+G+protein-coupled+receptors.">Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors.</a> Science. 297 (5581), 615-620 (2002).</li><li>Von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptors+by+endocytic+membrane+traffic:+mechanisms+and+translational+implications.">Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications.</a> Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).</li><li>Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromerization+of+the+&#181;-+and+&#948;-opioid+receptors+produces+ligand-biased+antagonism+and+alters+&#181;-receptor+trafficking.">Heteromerization of the &#181;- and &#948;-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters &#181;-receptor trafficking.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).</li><li>Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+distribution+of+delta-opioid+receptor+fused+with+various+tags+in+PC12+cells.">Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells.</a> Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).</li><li>Scherrer, G., Tryoen-T&#243;th, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockin+mice+expressing+fluorescent+delta-opioid+receptors+uncover+G+protein-coupled+receptor+dynamics+in+vivo.">Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).</li><li>He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+&#181;-opioid+receptor+activity+by+preventing+&#948;-opioid+receptor-mediated+codegradation.">Facilitation of &#181;-opioid receptor activity by preventing &#948;-opioid receptor-mediated codegradation.</a> Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).</li><li>French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+fluorescent+markers+in+confocal+microscope+images+of+plant+cells.">Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).</li><li>Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+morphine+treatment+alters+&#948;+opioid+receptor+post-internalization+trafficking.">Prolonged morphine treatment alters &#948; opioid receptor post-internalization trafficking.</a> Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+targeting+of+mu-delta+opioid+receptor+heterodimers+by+RTP4.">Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).</li><li>Gupta, A., Mulder, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+abundance+of+opioid+receptor+heteromers+after+chronic+morphine+administration.">Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration.</a> Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Field, A., Miles, J., Field, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2012).</li><li>Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-low+dose+naltrexone+attenuates+chronic+morphine-induced+gliosis+in+rats.">Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats.</a> Mol. Pain. 6, 22 (2010).</li><li>Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+among+various+proteins+as+blocking+agents+for+ELISA+microtiter+plates.">Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates.</a> J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook. , (2010).</li><li>Morris, T. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+immunocytochemical+staining+with+multiple+rabbit+polyclonal+antibodies.">A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies.</a> J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners&#8217;+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners&#8217; guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nous avons optimisé ce protocole pour l&#39;analyse des cultures primaires de neurones de ganglions de la racine dorsale adultes (neurones sensoriels primaires). Il peut également être utilisé, avec peu ou pas de modification, par des cellules en culture monocouche plaqué au sens large. L&#39;analyse colocalizational est également possible dans des tranches de tissu et d&#39;autres telles préparations 11, mais les composants de traitement de la toxicomanie et de la fixation des tissus / préparation ne...

Les récepteurs, en particulier des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), sont couramment un trafic intracellulaire, et à partir de la surface de la cellule 1. Ces processus de façon complexe orchestrées et étroitement contrôlées dictent disponibles compléments de récepteurs de cellules et régulent l&#39;activité du récepteur temporelle, la désensibilisation, et resensibilisation 2-4. Fait important, ces processus sont sensibles à des environnements cellulaires, y compris l&#39;activité ou de l&#39;inactivité récepteur induite par le médicament. Autrement dit, l&#39;action des ligands au niveau des récepteurs peuvent modifier trafic intracellulaire de ces récepteurs, en modifiant ainsi la sensibilité des cellules. De cette manière, les ligands externes exercent encore plus d&#39;effets sur la fonction de la cellule, au-delà même messager à effecteur cascades classiques 5,6. Examen de tels changements dans le trafic des récepteurs induite est difficile. Toutes les techniques disponibles comportent des limitations. des essais de protection de la biotine ont été utilisés pour moniTor récepteurs de surface populations. Ces récepteurs sont biotinylés et un timecourse des immunoprécipitations sont effectuées afin de quantifier la réduction des récepteurs biotinylés au fil du temps. Cette technique surveille essentiellement la dégradation progressive d&#39;une première, étiqueté, population de récepteurs 7, et est très utile dans la construction des cours à temps de ce processus. Malheureusement, cet essai est incapable de surveiller tout autre procédé que la dégradation de la piscine d&#39;origine de récepteurs, tels que l&#39;internalisation, le recyclage ou de nouveaux récepteurs. En outre, l&#39;addition d&#39;un anticorps dans la plage de 150 kDa à un récepteur dans la plage de 50 kDa peut modifier le trafic du récepteur 8,9, et cette technique peut être difficile à utiliser avec des récepteurs de faible niveau de l&#39;expression. D&#39;autres procédures utilisent diverses méthodes pour identifier les compartiments de trafic intracellulaire (par exemple, les endosomes, etc.) et d&#39;évaluer leur colocalisation avec les récepteurs d&#39;intérêt. Cela inclut la nouse des systèmes hétérologues exprimant la protéine fluorescente-étiqueté constructions chimériques des récepteurs et des marqueurs du compartiment (GTPases par exemple, Rab-famille). Cela permet potentiellement l&#39;utilisation de l&#39;imagerie des cellules vivantes, en supprimant les questions relatives à la fixation et perméabilisation. Bien que puissant, une telle stratégie souffre des mêmes limitations des systèmes hétérologues en général: tag et le niveau d&#39;expression des effets sur la traite des comportements et incompatibilité avec les types de cellules physiologiquement plus représentatifs. Plus populairement, les colorants sont utilisés pour étiqueter facilement compartiments intracellulaires (par exemple, les lysosomes, ostensiblement) 10. Colorants, cependant, peuvent manquer de spécificité (tous les organites acides dans le cas de colorants pour les lysosomes) et ne pas évaluer le trafic par d&#39;autres compartiments. Pourtant, ces techniques permettent un contrôle considérable sur le système et les conditions expérimentales et peuvent bénéficier des méthodes d&#39;analyse de colocalisation présentés ici, ci-dessous. Procédé we présente ici affine le suivi du trafic des récepteurs par colocalisation. Utilisation immunocytochimie (ICC) pour étiqueter les marqueurs appropriés, il est possible d&#39;identifier plusieurs compartiments intracellulaires distinctes. Ceci permet également l&#39;utilisation de cultures de cellules primaires physiologiquement pertinentes en place des systèmes hétérologues. Ce protocole de la CPI consiste à fixer les cellules d&#39;intérêt avant l&#39;étiquetage; ce qui permet à un étiquetage spécifique timepoint après le traitement (s) de drogue. Cela produit un «instantané» des associations mondiales récepteur compartiments à ce point de temps. Avec de multiples points dans le temps, un timecourse des changements de trafic peut également être construit. Brièvement, les cellules sont traités avec le médicament, pour le récepteur marqué et le compartiment intracellulaire d&#39;intérêt, confocale imagé, et les microphotographies sont analysés pour quantifier mathématiquement colocalisation du récepteur 11 et le compartiment. Dans notre utilisation, nous avons examiné la colocalisation d&#39;un récepteur avec Rab5, Rab11 et lysosomales-associated membrane protein 1 (LAMP1). Ces marqueurs identifient les endosomes précoces, les endosomes de recyclage, et les lysosomes, respectivement. Ces mesures de colocalisation agissent comme des procurations pour les processus généraux de l&#39;internalisation, le recyclage, et la dégradation 12. Comme avec toutes les techniques, certaines limites doivent être considérées. En raison de la nécessité d&#39;image à chaque neurone individuel analysé, cette technique peut devenir assez de main-d&#39;œuvre en fonction du nombre de conditions et de timepoints impliqués. Tous immunomarquage doit aussi composer avec les effets sur ultrastructure cellulaire, la localisation des protéines, et épitope accessibilité causés par la fixation et perméabilisation 13. Bien que l&#39;origine optimisé pour une utilisation avec des cultures primaires de neurones sensoriels primaires, cette méthode est largement compatible avec d&#39;autres modèles de culture monocouche plaqué. L&#39;utilisation d&#39;un mesur mathématiquement quantifiése de la colocalisation est, notamment, beaucoup plus rigoureuse au plan méthodologique que les techniques utilisées précédemment pour évaluer les changements de trafic de récepteurs, qui ont souvent compté sur des mesures subjectives vagues tels que visuellement inspectés superpositions multi-canal 14. Cette technique est particulièrement utile pour sa large compatibilité avec les interventions in vivo (avant la génération de la culture primaire), interventions in vitro (pendant la croissance de la culture), et divers systèmes de marquage cible les 15. En tant que tel, il peut être adapté à de nombreux sujets de recherche différents.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

En utilisant cette technique, il est possible de quantifier les changements dans le récepteur post-internalisation trafic suivantes deux traitements médicamenteux chroniques / prolongée et aiguës. Après les traitements médicamenteux, la fixation et l&#39;étiquetage, à haute résolution photomicrographies deux canaux sont capturés de chaque cellule d&#39;intérêt. Des images représentatives peuvent être combinés avec fausse couleur colocalisation pour générer des chiffres d&#39;illustration (Figure...

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Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

le trafic de signalisation et module récepteur cellulaire réactivité aux ligands et est, elle-même, répondant à des conditions cellulaires, y compris la signalisation induite par le ligand. Ici, nous décrivons une technique puissante et flexible pour évaluer quantitativement le trafic des récepteurs induite par le médicament en utilisant immunomarquage et analyse colocalizational.

Suivi des modifications induites par la drogue dans des récepteurs post-internalisation traite par Analyse Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.7K vues.  University of California Irvine.  le trafic de signalisation et module récepteur cellulaire réactivité aux ligands et est, elle-même, répondant à des conditions cellulaires, y compris la signalisation induite par le ligand. Ici, nous décrivons une technique puissante et flexible pour évaluer quantitativement le trafic des récepteurs induite par le médicament en utilisant immunomarquage et analyse colocalizational. 

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Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Suivi dynamique de prise de greffe musculaire chez les petits animaux par des In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Recherche

Biologie

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Induites par l&#39;environnement changements héréditaires dans lin

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Les changements d&#39;équilibre dans la structure de l&#39;ARN de surveillance par «peroxydation» et «oxydatif» Hydroxyl Footprinting Radical

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Analyse des SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Et la traite des cellules humaines

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

En direct d&#39;imagerie cellulaire et l&#39;analyse 3D des antagonistes des récepteurs de type 1a traite des transfectées embryonnaires humaines cellules rénales Utilisation Microscopie confocale

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

La détection de G Protein-Coupled Receptor Internalisation activé de ligand par microscopie confocale

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

Real Time In Vivo suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...