Cette recherche a été financée en partie par le Programme de recherche intra-muros de l&#39;Institut national du cancer des Instituts nationaux de la santé, et par le NCI accorder UA5CA152907.

1 Collection de milieux conditionnés pour tester angiogénique potentiel <ol><li> Cultiver les cellules primaires ou immortalisées à être testé pour le potentiel angiogénique ou anti-angiogénique dans les médias sériques natives ou faibles et de recueillir le milieu conditionné. <ol><li> En variante, l&#39;utilisation immédiatement milieu conditionné, ou de portions aliquotes et stocké à -80 ° C pendant plusieurs mois. Utiliser les médias de sérum natif ou faible nonconditioned comme contrôle négatif, et utiliser les médias non-conditionné complète la croissance (10% de FBS, ou concentration appropriée) comme contrôle positif. Sinon, pour tester stimulateurs potentiels de l&#39;angiogenèse, le charbon de supplément médias dépouillé manque de facteurs de croissance avec des concentrations connues de protéines spécifiques d&#39;intérêt et de comparer à facteur de croissance seuls médias libres. </li></ol></li></ol> 2 Préparation des cellules endothéliales avant l&#39;essai <ol><li> Deux jours avant l&#39;essai, le passage 3B-11 des cellules dans un nouveau flacon T-75. nombre de passage de cellules est important. Cet essai est plus efficace lorsque les cellules se trouvent entre les deuxième et sixième passages. Le test ne fonctionne pas bien si les cellules endothéliales sont utilisés avant la deuxième ou après le dixième passage. </li><li> Cultiver les cellules pendant 24 heures dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. </li><li> Un jour avant l&#39;essai, le sérum de faim 3B-11 des cellules comme suit: <ol><li> Aspirer le milieu des cellules 3B-11. </li><li> Ajouter un média de sérum réduit de DMEM supplémenté avec 0,2% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. </li><li> Cultiver les cellules pour un 24 heures supplémentaires. </li></ol></li></ol> 3 Préparation des réactifs avant l&#39;essai REMARQUE: Les concentrations sont très variables BME dépend beaucoup. BME ne fonctionne pas bien si la concentration est inférieure à 10 mg / ml, par conséquent, le fabricant BME doit être mis en contact avant l&#39;achat pour s&#39;assureracquisition d&#39;un lot concentré de manière adéquate. <ol><li> Dégivrage réduit le facteur de croissance BME dans le réfrigérateur. BME se solidifie à chaud, donc il doit être conservé au froid avant de l&#39;utiliser. BME peut être stocké au réfrigérateur pendant quelques semaines, ou aliquote et congelé à -80 ° C. </li><li> Un facteur de croissance réduit BME est préféré au BME traditionnel. L&#39;absence de facteurs angiogéniques dans le BME, il sera plus facile d&#39;observer l&#39;effet que les facteurs des milieux conditionnés ont sur la formation du tube. </li><li> Médias dégel à tester. </li></ol> 4 Préparation des cellules endothéliales Immédiatement avant l&#39;essai <ol><li> Laver 3B-11 cellules dans du DPBS. <ol><li> Si la visualisation de la fluorescence ou microscopie confocale est désirée, avant de laver les cellules 11-3B, la calcéine AM ajouter aux cellules endothéliales dans un milieu à une concentration finale de 2 ug / ml. Placer les cellules marquées calcéine dans l&#39;obscurité à 37 ° C et 5% de CO 2 avant le début de l&#39;essai. Dissoudre actions calcéineAM dans du DMSO et une fois la calcéine est diluée dans des milieux concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 0,1%. Après 30-45 min lavage calcéine AM à partir des cellules (étape 4.1 ci-dessus) et poursuivre l&#39;expérience suivante. </li></ol></li><li> Trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine-EDTA pour flacon T-75. </li><li> Après traitement à la trypsine est terminée, neutraliser la trypsine en remettant en suspension les cellules dans un volume final de 10 ml dans du DMEM, 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. </li><li> cellules de filtre à travers 100 um cellule passoire pour éliminer les grumeaux. </li><li> Compter les cellules et remettre les cellules à une concentration finale de 7,5 x 10 6 cellules / ml dans du DMEM, 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. </li></ol> 5 Tube Formation Assay <ol><li> Placez plaque à 24 puits et 1 ml conseils au réfrigérateur ou sur de la glace pendant 20-30 minutes avant de charger la plaque afin que le BME ne Prem pasaturely solidifier. </li><li> Pipeter 250 ul de facteur de croissance réduit BME dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits. Éviter de créer des bulles par pas appuyer sur la pipette pour son dernier arrêt lors de la distribution. Veillez à ce que suffisamment de BME reste au centre du puits lorsque les formes de ménisque; si la matrice est trop mince, les cellules ne forment une monocouche. </li><li> Incuber la plaque à 24 puits à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 minutes pour solidifier BME. </li><li> Une fois BME a mis, mélanger environ 300 pi de milieu conditionné avec 10 pi de remises en suspension 3B-11 cellules (environ 75 000 cellules). <ol><li> Ajuster le volume de milieu conditionné et le nombre de cellules ensemencées en fonction du type de cellule endothéliale utilisé, et tester les dilutions en série du milieu conditionné pour démontrer l&#39;activité. Si on compare les cellules cultivées dans des conditions différentes, normaliser conditionné volume de support pour le nombre de cellules qui ont été utilisées pour conditionner le support. </li></ol></li><li> Tubes will commencent à se former dans les 2-4 heures. En fonction de la concentration en facteur angiogénique dans le milieu conditionné, la formation de tubes de crête peut se produire entre 3 et 12 heures et le temps de l&#39;essai devra être optimisé. Si vous travaillez avec des cellules endothéliales primaires au lieu de cellules immortalisées, la formation du tube initial peut être retardée de plusieurs heures. <ol><li> Tubes commencent souvent à se détériorer dans les 18 cellules endothéliales h et fera l&#39;objet d&#39;apoptose. </li></ol></li><li> Au moment de la formation du tube de pointe, les médias soigneusement aspirer du puits pour éviter de perturber le réseau de métro sur le BME. <ol><li> Laver chaque puits avec 1 ml DPBS, puis aspirer. <ol><li> Pour une visualisation immédiate, ajouter 1 ml de DPBS frais à chaque réseau de tubes et ainsi l&#39;image en utilisant un microscope inversé fixé à un appareil photo numérique, ou fluorescence / microscope confocal si les cellules ont été colorées avec la calcéine AM comme au point 4.1.1. </li><li> Pour fixer le réseau de métro pour la visualisation plus tard, et ajouter 4% de paraformaldéhyde à chaqueainsi aspiré et incuber pendant 15 min à température ambiante. <ol><li> Retirer paraformaldéhyde, laver deux fois avec DPBS, puis ajouter 1 ml DPBS frais à chaque puits. </li><li> Microscope l&#39;image avant la fixation de quelques tubes peuvent se briser au cours de cette procédure. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6 Quantification de réseau de métro <ol><li> Quantifier le réseau de tubes de différentes manières en fonction des préférences de l&#39;enquêteur, et plusieurs programmes informatiques ont la capacité de mesurer les paramètres suivants: nombre de tubes; nombre de boucles / mailles; nombre de sites de succursale / nœuds; longueur de tubes. </li><li> Utilisez programme informatique représentant tels que Image J avec le plugin Analyzer angiogenèse 16 pour la quantification des réseaux de tubes. </li></ol>

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	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438, 932-936 (1038).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146, 873-887 (2011).</li><li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development.">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438, 937-945 (2005).</li><li>Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+pro-+and+anti-angiogenic+factors+as+targets+of+clinical+intervention.">A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention.</a> Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).</li><li>Ausprunk, D. H., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+proliferation+of+endothelial+cells+in+preformed+and+newly+formed+blood+vessels+during+tumor+angiogenesis.">Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis.</a> Microvascular research. 14, 53-65 (1977).</li><li>Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumour+vasculature:+insights+from+physiological+angiogenesis.">Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).</li><li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+pathological+angiogenesis.">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+state+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature protocols. 5, 628-635 (2010).</li><li>Walter-Yohrling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+endothelial+cell+lines+as+models+of+tumor+endothelial+cells.">Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).</li><li>Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , 144-521 (1950).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+contribution:+Angiogenesis+Analyzer.">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

L&#39;angiogenèse est impliquée dans les processus physiologiques et pathologiques. Les mécanismes impliqués dans l&#39;angiogenèse étude nécessite l&#39;utilisation de dosages qui récapitulent les principales étapes de l&#39;angiogenèse. L&#39;essai de formation de tubes de cellules endotheliales offre plusieurs avantages par rapport à d&#39;autres essais. Il est facile à mettre en place, est relativement peu coûteux, produit tubules en quelques heures, et est quantifiable. En outre, il peut être complét...

L&#39;angiogenèse, le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, est vital pour une variété de procédés, y compris la croissance des organes, le développement embryonnaire et la cicatrisation 1-3. Nouvellement développé des vaisseaux sanguins, bordées de cellules endothéliales, de l&#39;oxygène de l&#39;offre et de nutriments aux tissus, de promouvoir la surveillance immunitaire par des cellules hématopoïétiques et éliminer les déchets 2,4. L&#39;angiogenèse est d&#39;une importance capitale au cours du développement embryonnaire et fœtal. Cependant, ce procédé reste en sommeil chez l&#39;adulte, sauf pendant les périodes de cicatrisation des plaies, la croissance du squelette, la grossesse ou au cours du cycle menstruel 1-3. Au cours des deux dernières décennies, les mécanismes moléculaires clés qui régulent l&#39;angiogenèse ont commencé à émerger. L&#39;angiogenèse est un événement strictement réglementé, pondérées par les signaux pro et anti-angiogéniques dont les intégrines, chimiokines, angiopoïétines, des agents de détection de l&#39;oxygène, des molécules de jonction et les inhibiteurs endogènes 5. Une fois proangsignaux IOGenic tels que facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), dérivé des plaquettes facteur de croissance (PDGF) et le facteur de croissance épidermique (EGF), activent des cellules endothéliales des récepteurs des cellules endotheliales libèrent des proteases à dégrader la membrane basale. Les cellules endothéliales prolifèrent et migrent ensuite, former les germes à une vitesse de quelques millimètres par jour 6,7. L&#39;angiogenèse est associée à divers états pathologiques y compris le cancer, le psoriasis, la rétinopathie diabétique, l&#39;arthrite, l&#39;asthme, les maladies auto-immunes, les maladies infectieuses, l&#39;athérosclérose et 10.8. En raison de l&#39;importance de l&#39;angiogenèse dans diverses maladies, comprenant les gènes et les voies qui régulent ce processus est essentiel pour la conception de meilleurs traitements. L&#39;essai de formation de tubes est une méthode rapide et quantitative pour la détermination des gènes ou des voies impliquées dans l&#39;angiogenèse. D&#39;abord décrit en 1988,les principes sous-jacents de ce test sont des cellules endothéliales qui conservent la capacité de se diviser et de migrer rapidement en réponse à des signaux angiogéniques 11-13. En outre, les cellules endothéliales sont induites à se différencier et à former des structures en forme de tube quand elle est cultivée sur un extrait de la matrice de la membrane basale (BME). Ces tubes contiennent une lumière entourée par les cellules endothéliales reliées entre elles par des complexes de jonction. Tube de formation se produit rapidement avec la plupart des tubes de formage dans cet essai à l&#39;intérieur de 2 à 6 heures selon la quantité et le type de stimuli angiogéniques. Plusieurs types de cellules endotheliales peuvent être utilisés pour ce dosage comprenant à la fois des cellules primaires et des lignées cellulaires immortalisées 14,15. La lignée cellulaire utilisée pour cet article était souris 3B-11, mais la même méthode peut être appliquée à d&#39;autres lignées de cellules endothéliales, tels que SVEC4-10 (souris) ou des cellules endotheliales primaires, telles que des cellules HUVEC (humaines). En fonction de la lignée cellulaire est utilisée et si le CE endothélialells sont transformés ou non transformés, l&#39;optimisation devra être menée afin d&#39;identifier le moment idéal nécessaire à la formation correcte de la sonde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:339px;">Item</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Manufacturer</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">Catalog #</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="114" rowspan="2" style="height:114px;width:339px;">Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">3524</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="190" rowspan="2" style="height:190px;width:339px;">BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">BD Biosciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">354230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="76" rowspan="2" style="height:76px;width:339px;">Gibco 0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="95" rowspan="2" style="height:95px;width:339px;">Gibco L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25030-081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco Pen Strep</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DMEM (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DPBS (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Atlas Biologicals</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">F-0500-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">C3100MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMSO</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">4-X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis

L&#39;angiogenèse est un processus essentiel pour le développement normal des tissus et la cicatrisation, mais est également associée à une variété de conditions pathologiques. En utilisant ce protocole, l&#39;angiogenèse peut être mesurée in vitro d&#39;une façon quantifiable rapide. Cellules endothéliales primaires ou immortalisées sont mélangés avec des milieux conditionnés et étalées sur la matrice de la membrane basale. Les cellules endotheliales capillaires forment des structures similaires en réponse à des signaux angiogéniques présents dans des milieux conditionnés. La formation du tube se produit rapidement avec les cellules endothéliales commencent à s&#39;aligner dans 1 heure et tubules contenant lumen-commencent à apparaître dans les 2 heures. Les tubes peuvent être visualisées en utilisant un microscope à contraste de phase inversée, ou les cellules peuvent être traitées avec de la calcéine AM avant l&#39;essai et des tubes visualisé à travers la fluorescence ou microscopie confocale. Le nombre de sites de succursale / nœuds, boucles / mailles, ou le nombre et la durée des tubes formés peuvent être facilement quantifiés comme une mesure de dans vitro angiogenèse. En résumé, ce test peut être utilisé pour identifier les gènes et les voies qui sont impliqués dans la promotion ou l&#39;inhibition de l&#39;angiogenèse d&#39;une manière rapide, reproductible et quantitative.

3B-11 de souris les cellules endothéliales sont ensemencées sur solidifié facteur de croissance réduit BME - dans cet essai, le produit de Matrigel a été utilisé - et suivie au cours du temps. Comme le montre la Figure 1, des facteurs angiogéniques sécrétés par soit des kératinocytes ou des fibroblastes de souris sont capables d&#39;induire la formation de tubes dans le temps. Les cellules endothéliales migrent et commencent à former de petites branches dans 1-2 heures de placage. La forma...

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Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

L&#39;essai de formation de tubes est une méthode rapide pour la mesure quantifiable de l&#39;angiogenèse in vitro. Les cellules endothéliales sont combinés avec des milieux conditionnés et étalées sur un extrait de la membrane basale. formation de métro se produit dans les heures et les tubules nouvellement formés facilement quantifiable.

Des cellules endothéliales Tube Formation test pour la<em&gt; In Vitro</em&gt; Etude de l&#39;angiogenèse

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

59.0K vues.  American University.  L'essai de formation de tubes est une méthode rapide pour la mesure quantifiable de l'angiogenèse in vitro. Les cellules endothéliales sont combinés avec des milieux conditionnés et étalées sur un extrait de la membrane basale. formation de métro se produit dans les heures et les tubules nouvellement formés facilement quantifiable. 

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test sensibilité visuelle à la vitesse et la direction du mouvement chez les lézards

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Recherche

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Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Optimisé fibrine billes de gel d&#39;analyse pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

Un test basé sur Matrigel Tube Formation d&#39;évaluer l&#39;activité Vasculogenic de cellules tumorales

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself dispositif de récupération d&#39;échantillons cryoconservés tombé accidentellement dans les réservoirs de stockage cryogéniques

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Extériorisation Mésentère Rat: Un modèle pour étudier la dynamique cellulaires impliqués dans l&#39;angiogenèse

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Un bioessai simple pour l&#39;évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.