HuVEC Tube-formation D'essai pour évaluer l'impact des produits naturels sur l'angiogenèse

Tube-formation Assay est un test in vitro pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à plusieurs étapes qui conduisent à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Cet essai permet d’identifier les composés et les cascades de signalisation associés à l’angiogenèse. Avec un seul test, nous sommes en mesure de montrer qu’un composé naturel comme RGWE réduit la capacité des cellules endothéliales à former une structure tube-like, n’affectent pas la viabilité cellulaire, et que cet effet dépend de l’activation de la voie MEK / ERK. Il est important d’effectuer le test avec le bon nombre de cellules. En fait, trop peu ou trop de cellules ne pouvaient pas permettre la bonne formation de tubes. Pour cette raison, il est conseillé d’effectuer un test préliminaire pour savoir le bon nombre de cellules. Luca Olga Pastorino, doctorant dans mon laboratoire, montrera les procédures. Tout d’abord, recueillir les feuilles de Ruta graveolens pendant les mois de printemps et d’été. Mettre 250 grammes de feuilles hachées dans un flacon conique, et ajouter un litre d’eau distillée, faire bouillir et filtrer, tel que décrit dans le manuscrit. Le lendemain, utilisez un lyophilisateur pour lyophiliser l’extrait de feuille. Après avoir obtenu la poudre, pesez-la et divisez-la en aliquots. Culture des HUVECs dans le milieu de croissance des cellules endothéliales, selon le protocole de texte. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, passer les cellules à un rapport de un à trois. Utilisez les cellules obtenues entre le passage deux et le passage cinq. Une fois que les HUVECs passages atteignent 70% confluency, les transvectent avec un microgramme du vecteur contenant le gène d’intérêt.Combinez un microgramme d’ADN avec trois microlitres de Lipofectamine diluée 2000.Then, retirez le milieu des HUVECs, et remplacez-le par un millilitre de milieu complet frais. Ajoutez la solution transvecting aux cellules, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius, et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Trois heures après la transvection, ajouter sept millilitres de milieu complet frais et incuber les cellules pendant 24 à 48 heures supplémentaires. Immédiatement avant la préparation du sous-sol, mettre une plaque pré-réfrigérée de 96 puits sur la glace et ajouter 50 microlitres de matrice froide à chaque puits. Pendant que la plaque couve, lavez les HUVECs avec un millilitre de solution PBS/EDTA. Ensuite, ajouter un millilitre de trypsine-EDTA solution aux cellules, et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Recueillir le milieu contenant les cellules suspendues, et récolter les cellules par centrifugation. Ensuite, resuspendez les cellules en un millilitre de PBS. Transférer 0,2 millilitres de la suspension cellulaire à 0,5 millilitres de PBS avec la solution bleu trypan. Après avoir tenu la suspension à température ambiante pendant cinq minutes, comptez les cellules dans un