Nous remercions FortéBio pour fournir graphiques utilisés dans la figure 1. Ce travail a été soutenu par NIH GM083088 de TMD

<html> Une. Programmation de l&#39;instrument de BLI Assay Allumez l&#39;instrument au moins une heure à l&#39;avance pour permettre à la lampe de se réchauffer, ce qui est nécessaire pour réduire le bruit et la dérive du signal optique pendant l&#39;expérience. Réglez la température souhaitée via l&#39;onglet instrument Préchauffez le support de plaque échantillon. Ensuite, mettre en place le plan expérimental dans le logiciel d&#39;acquisition de données. Sélectionnez &quot;Nouvelle Expérience Kinetics&quot; dans l&#39;onglet de l&#39;assistant de l&#39;expérience. Cela présente un menu à onglets avec toutes les mesures qui doivent être définis. 1.1. Plaque Définition Définir les colonnes à utiliser sur la plaque d&#39;échantillons à 96 puits. Assigner les colonnes pour contenir tampon, protéine immobilisée ou partenaire de liaison. Pour chaque association ainsi, entrer la concentration de partenaire de liaison à utiliser. Remarque: la définition de la plaque représentée sur la figure 2 a des options pour des dosages distincts. 1.2. Essai Définition ontenu &quot;&gt; Définir toutes les mesures nécessaires pour le dosage. s&#39;agit notamment (i) de base (plusieurs), (ii) en cours de chargement, (iii) Association et (iv) La dissociation de partenaire de liaison. Ensuite, comme décrit ci-dessous, un lien étapes de test avec colonnes de puits sur la plaque de l&#39;échantillon en sélectionnant l&#39;étape de test, puis double-cliquant sur la colonne correspondante. Cette programmes les capteurs à être déplacés d&#39;une colonne de puits à l&#39;autre pendant le test. <ol><li> Baseline Commencer avec un pas de ligne de base courte (≥ 60 sec), avec des capteurs dans le tampon d&#39;essai (figure 2, colonne 1), pour établir des signaux de BLI initiales dans la plaque à 96 puits. </li><li> Chargement (immobilisation de la protéine biotinylée sur les capteurs) Assigner des détecteurs à puits qui contiennent la protéine biotinylé (Figure 2, colonne 2). Utilisez la fonction de seuil pour atteindre un niveau prédéterminé de liaison (voir Introduction). Réglez l&#39;option de seuil de sorte que tous les capteurs seront mouvementd à l&#39;autre colonne de puits lorsque l&#39;un quelconque des capteurs atteigne le seuil. </li><li> Baseline Inclure une autre étape de base dans un tampon (figure 2, colonne 3; généralement&gt; 5 min) pour laver protéines biotinylées non immobilisés par les capteurs et établir de nouveaux signaux de référence, stable. Pour de base des essais de liaison / de dissociation que (comme dans la figure 3), inclure une étape supplémentaire de base (60 sec) avec des capteurs dans de nouveaux puits de tampon (figure 2, colonne 4) avant l&#39;étape d&#39;association. </li><li> Association (du partenaire de liaison à la protéine immobilisée) Pour une analyse de base de liaison / de dissociation (comme dans la figure 3), sélectionnez une plage de concentrations de partenaire de liaison à utiliser pour différents capteurs / puits (figure 2, colonne 5). Ajuster le temps de l&#39;étape de telle sorte qu&#39;au moins une concentration saturante du partenaire de liaison devrait approcher le signal liaison à l&#39;équilibre. Pour unessai pour tester les effets allostériques de petits ligands sur la dissociation du complexe protéine-protéine (comme dans la Figure 5), sélectionnez une seule concentration élevée de partenaire de liaison (~ 10 fois supérieure à la estimée K D) pour une utilisation dans tous les puits de l&#39;association. </li><li> Dissociation (du partenaire de liaison) Pour un dosage de liaison de dissociation de base / seulement (comme sur la figure 3), désigner les capteurs pour revenir à la colonne 4 (Figure 2), les mêmes puits de tampon que celui utilisé pour la ligne de base supplémentaire avant d&#39;association. Pour un essai pour tester les effets allostériques de petits ligands, au lieu de désigner des capteurs de passer à la colonne 6 (figure 2), où chaque puits peut contenir un tampon en plus différents ligands allostériques. </li></ol> 1.3. Capteur Affectation Indiquer les endroits dans le plateau de capteur qui va contenir les capteurs préalablement mouillée pour le dosage. Identifier toutes les positions vides puisque l&#39;expérience sera fail si aucun capteur sont pris en charge. 1.4. Expérience avis Visualisez toutes les mesures prévues à vérifier pour les erreurs et aller de nouveau à les corriger. 1.5. Exécutez l&#39;expérience Entrez les détails nécessaires, y compris l&#39;emplacement des fichiers de données. Entrez la température désirée pour l&#39;expérience. Si les capteurs nécessitent encore prémouillage, sélectionnez l&#39;option de retarder le démarrage de l&#39;expérience. Enfin, une fois toute la préparation de l&#39;échantillon est terminée (étape 2) et à la fois la plaque de l&#39;échantillon et le plateau de capteur sont chargés dans l&#39;instrument, cliquez sur le bouton OK pour lancer l&#39;analyse. 2. Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Préparer un tampon de dosage approprié. Tampon utilisé pour les expériences représentées sur les figures 3 et 5: 20 mM de MOPS (3 - (N-morpholino) propanesulfonique), le Tris (Tris (hydroxyméthyl) amino-méthane) (ajouté pour ajuster le pH à 8,0), 50 mM de KCl. Inclure BSA (albumine de sérum bovin, acides gras libres, de 0,5mg / ml final) dans le tampon pour toutes les étapes de l&#39;analyse et pour toutes les dilutions de la protéine partenaire de liaison biotinylé ou de réduire au minimum la liaison non spécifique de protéines à des capteurs. </li><li> Diluer la protéine biotinylée (ε) dans du tampon analytique à une concentration appropriée (voir l&#39;introduction). </li><li> Préparer des dilutions du partenaire de liaison (F 1 (-ε)) dans un tampon de dosage (voir discussion pour la gamme de concentrations à utiliser). </li><li> Pré-imbibé les capteurs revêtues de streptavidine pendant au moins 10 minutes pour éliminer de leur revêtement protecteur de saccharose. Retirer le porte-capteur contenant le capteur et le plateau à insérer une plaque à 96 puits dans le fond du plateau, en glissant l&#39;un des coins de la plaque dans l&#39;encoche d&#39;orientation sur le plateau. Pour la colonne de capteurs à utiliser, ajouter 200 ul de tampon d&#39;essai par puits dans la colonne de la plaque de 96 puits. Remettre le panier de capteurs sur le plateau dans le bon sens (avec onglets dans les fentes). </li><li> Comme attribué lors de la programmation à l&#39;étape 1, remplir les puits of la plaque d&#39;échantillons avec un tampon de dosage ou des dilutions appropriées de la protéine, comme dans la figure 2. Éviter d&#39;introduire des bulles, car ils peuvent provoquer du bruit dans le signal optique. Inclure un ou plusieurs puits de référence qui omettent soit (i) la protéine biotinylé ou (ii) un partenaire de liaison. </li><li> Ouvrez la porte de l&#39;appareil et insérez le plateau de capteur sur la scène (à gauche), avec les onglets du plateau insérés dans les fentes de la scène. Insérez la plaque de l&#39;échantillon dans le support de plaque (à droite), assurez-vous que la plaque est assis à plat et dans le bon sens, comme indiqué sur le support de plaque. Fermez la porte et commencer le test du programme d&#39;acquisition de données (étape 1.5). </li></ol> 3. Traitement des données <ol><li> Après le test a été exécuté, ouvrez le logiciel d&#39;analyse de données et de charger le dossier contenant les données. Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Traitement&quot; pour voir un menu étape par étape de traitement (à gauche) et les données cinétiques premières, à chaque capteur (AH) attribué une couleur différente (voirLa figure 3). </li><li> Sous la rubrique «Sélection de données&quot;, cliquez sur le bouton &quot;Sélection capteur&quot;. Sur la &quot;plaque d&#39;échantillons de carte&quot;, désigner les puits pour 1 ou 2 capteurs de contrôle (G, H dans le test de la figure 3) que les puits de référence. Dans le menu de traitement, cochez la case «Soustraction» et sélectionnez «Référence Wells&quot; pour soustraire le signal de référence (simple ou moyenne) à partir du signal de chaque autre capteur. </li><li> Aligner toutes les traces de Y = 0 en utilisant l&#39;étape &quot;Aligner l&#39;axe Y&quot;. Sélectionnez &quot;de base&quot; comme l&#39;étape d&#39;alignement (ce qui est la dernière base avant l&#39;étape d&#39;association). Pour &quot;Plage de temps&quot;, entrez les 10 dernières secondes de cette ligne de base (c.-à 50-60 secondes pour une base de référence de 60 sec, comme dans la figure 3). </li><li> Cochez la case &quot;Inter-étape de correction» pour minimiser les changements de signaux entre les étapes d&#39;association et de dissociation. Sélectionnez aligner à base ou de dissociation. </li><li> Sélectionner la fonction de filtrage Savitzky-Golay dans la plupart des cas et cliquez sur &quot;Process Data!&quot; de procéder. Inspecter visuellementles données finales transformés (panneau en bas à droite). Avec des essais destinés à l&#39;analyse globale des données (comme dans la figure 4), si des traces de signaux montrent un changement important entre l&#39;Association et les étapes de dissociation, changer la sélection de dissociation ou de référence pour le &quot;Correction Inter-étape» et retraiter les données avant de procéder à des données Analyse. </li></ol> 4. Analyse des données Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Analyse&quot; dans l&#39;analyse des données pour commencer. Remarque: l&#39;exemple ci-dessous sont les étapes de l&#39;analyse globale de plusieurs courbes de liaison / dissociation (comme sur la figure 3). <ol><li> Pour &quot;l&#39;étape pour l&#39;analyse&quot;, choisissez Association et dissociation. Pour &quot;modèle&quot;, sélectionnez 1:1. Remarque: d&#39;autres options disponibles sont limitées. </li><li> Pour &quot;assemblage&quot;, choisissez mondial (complet). Pour &quot;Groupe par&quot; sélectionnez Couleur (comme sur le graphique). Sélectionnez «R max UNLINKED par capteur&quot; d&#39;autoriser le montage indépendant de R max (réponse maximale du signal sur la liaison de la saturation parTENAIRE à la protéine immobilisée). Note: nous le faisons pour la plupart des tests, comme des capteurs varient légèrement dans la quantité de protéine immobilisée (voir la figure 3, Chargement). </li><li> Sur le tableau ci, assurez-vous que toutes les traces de capteurs à analyser ont la même couleur, afin qu&#39;ils soient analysés comme un ensemble global. Si nécessaire, sélectionnez un ou plusieurs capteur traces d&#39;omettre de montage mondiale: dans la colonne &quot;Inclure&quot;, cliquez-droit sur la position du capteur souhaité et sélectionnez &quot;Exclure Wells&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;ajustement des courbes!&quot; commencer l&#39;analyse de régression non linéaire. Examiner les résultats de montage, qui comprennent (i) superposition des courbes de régression avec des traces de données de capteurs (comme sur la figure 4), (ii) des graphiques de résidus de montage, et (iii) un tableau avec des valeurs de paramètre déterminées (constantes de taux, R max, K D) et statistiques (erreurs types de paramètres, Chi-squared, R 2). </li><li> Sous &quot;Exporter des données&quot;, enregistrer les résultats de montage en cliquant sur &quot;Exporter le tableau. Fichier csv&quot;. Pour graphing ou une analyse plus approfondie des données / courbes ajustées avec un autre logiciel, cliquez sur &quot;Exporter les résultats de montage&quot; pour enregistrer les données de chaque capteur et courbe ajustée dans un fichier texte. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas de conflits d&#39;intérêts.

Instruments actuellement disponibles pour BLI permettent un débit important et la flexibilité dans des essais pour les interactions biomoléculaires. Différents échantillons de solution sont distribués dans des puits d&#39;une plaque de microtitration noire, et un ensemble de capteurs BLI parallèles sont programmés pour se déplacer d&#39;avant en arrière entre les colonnes de puits de la plaque. Les échantillons sont agités par agitation orbitale tout au long de l&#39;essai. Le système utilisé ici a huit ca...

Interactions protéine-protéine sont importantes pour de nombreux processus biologiques, et les méthodes optiques sans étiquette comme résonance plasmonique de surface (SPR) ont été utilisés in vitro pour étudier la cinétique de liaison et de dissociation 1. La plupart des méthodes sans étiquette immobiliser une biomolécule sur une surface du capteur et d&#39;utiliser un signal optique pour détecter un partenaire de liaison à partir de la solution telle qu&#39;elle s&#39;associe à la biomolécule immobilisée 1. Bien que SPR est une méthode très sensible, elle est sujette à des interférences dues à des changements dans l&#39;indice de réfraction de la solution s&#39;écoulant sur ​​le capteur 2. Bien que pas aussi sensible que SPR, Bio-couche interférométrie (BLI) est moins affectée par des changements dans la composition de l&#39;échantillon 1,3. BLI utilise des biocapteurs à fibres optiques qui ont un revêtement biocompatible propriétaire à la pointe. Le système utilisé ici (Octet-RED96) contient huit spectrophotomètres. La lumière blanche est canalisée vers une rangée de sondes qui se déplacent sur un bras robotisé. Capteurs à fibre optique are captés par les sondes et déplacé à une plaque de 96 puits contenant des échantillons. L&#39;une des molécules cibles est immobilisé sur la surface du biocapteur. Puis capteurs sont déplacés aux puits contenant le partenaire de liaison en solution. BLI surveille association du partenaire de liaison avec la molécule immobilisée, puis surveille dissociation après le déplacement des capteurs de solution sans le partenaire de liaison. La liaison de molécules à la surface du biocapteur conduit à des changements de l&#39;interférence optique entre les ondes lumineuses qui reflètent vers les spectrophotomètres à partir d&#39;une surface interne et externe à partir de l&#39;interface entre le capteur et la solution. Ces changements dans les interférences peuvent être quantifiés et utilisés pour déterminer les taux cinétiques de liaison et de dissociation, résumées dans l&#39;animation de la figure 1. Nous avons appliqué BLI pour mesurer les interactions entre le complexe catalytique de l&#39;ATP synthase bactérienne et sa sous-unité ε, qui peut auto-inhiber l&#39;enzyme. ATP synthase est un nanomoteur rotatif enrobé dans une membrane qui catalyse la synthèse et l&#39;hydrolyse de l&#39;ATP 4. Le complexe catalytique (F 1) peut être isolé sous une forme soluble qui fonctionne comme une ATPase. Sous-unité ε a deux domaines: le domaine N-terminal (NTD) est nécessaire pour un montage correct et couplage fonctionnel de l&#39;enzyme mais n&#39;interagit pas directement avec les sous-unités catalytiques; du domaine C-terminal (CTD) peut inhiber l&#39;enzyme en interagissant avec de multiples sous-unités catalytiques 5,6. Ce règlement de ε-médiation est spécifique à ATP synthases bactériennes et n&#39;est pas observée dans l&#39;homologue mitochondrial. ATP synthase a apparu comme une cible pour les médicaments antibactériens, comme le montre la récente approbation de la FDA de bedaquiline pour traiter la tuberculose résistante aux médicaments 7. Ainsi, le ciblage rôle inhibiteur de ε pour la découverte de médicaments pourrait donner antibactériens qui ne inhibent l&#39;ATP synthase mitochondriale. Avec le complexe catalytique isolé (F 1), εdevient une sous-unité indissociable. Cependant, avec ε lié à F 1, la εCTD peut subir un changement de conformation dramatique, insertion partielle dans la cavité centrale de l&#39;enzyme et la formation d&#39;un état ​​d&#39;inhibition qui est peu probable de dissocier directement 6,8. Nous utilisons BLI pour mesurer la cinétique de F 1 / ε liaison et de dissociation, et indirectement, pour examiner les effets allostériques du site catalytique ligands sur la conformation de ε. Dans notre système, ε a été choisie pour l&#39;immobilisation sur la surface du capteur étant donné que le signal BLI (comme SPR) est sensible à la masse des molécules de liaison à la surface. La sous-unité ε est petit (~ 15 kDa) par rapport à la principale F 1 complexe (~ 347 kDa). Ainsi, un signal de plus grande BLI va résulter de la liaison de F 1 à ε immobilisé. Afin de surveiller F 1 dissociation, qui peut être très lent, ε doit être fermement immobilisée. Ainsi nous avons choisi de biotinylerEt l&#39;immobiliser sur biocapteurs revêtues de streptavidine. Les protéines peuvent être biotinylés par (i) la modification aléatoire des lysines de surface 9, (ii) réaction d&#39;une cystéine natif ou composite unique avec un réactif de biotine-maléimide 10 ou (iii) l&#39;addition génétiquement un peptide biotine-accepteur spécifique qui est enzymatiquement biotinylé pendant l&#39;expression in vivo de la protéine marquée 11. Dans notre système, ε est biotinylé en utilisant la méthode (iii) 8. Une fois ε-biotine marqué est immobilisé sur des capteurs de streptavidine, BLI peut mesurer la liaison et la dissociation de F 1 qui a été épuisée de la sous-unité ε (F 1 (-ε)). Pour les expériences décrites ici, des essais préliminaires ont été faites pour déterminer des quantités raisonnables de la protéine biotinylé à immobiliser sur les capteurs. Cela peut varier, en fonction du poids moléculaire de la protéine et son partenaire de liaison, mais le but est de déterminer une quantité minimale de protéine immobilisée tchapeau fournit (i) acceptable signal sur bruit pour la cinétique de liaison avec une faible concentration du partenaire de liaison (K D ci-dessous) et (ii) un minimum de distorsion de la cinétique de liaison de concentration quasi-saturation du partenaire de liaison. En outre, la stoechiométrie de biotinylation peut varier (mais évitez&gt; 1 mole de biotine / protéine mol), de sorte que certains dosage initial peut être nécessaire pour chaque nouveau lot de protéines biotinylé pour confirmer qu&#39;un signal BLI convergentes peut être réalisé au cours de l&#39;immobilisation sur la streptavidine capteurs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

Nous décrivons l&#39;utilisation de Bio-couche interférométrie pour étudier les interactions inhibitrices de la sous-unité ε avec le complexe catalytique d&#39;Escherichia coli ATP synthase. Bactérienne de type F ATP synthase est la cible d&#39;une nouvelle antibiotique approuvé par la FDA pour combattre la tuberculose résistante aux médicaments. Comprendre spécifiques-bactéries auto-inhibition de l&#39;ATP synthase par le domaine C-terminal de la sous-unité ε pourrait fournir un nouveau moyen de cibler l&#39;enzyme pour la découverte de médicaments antibactériens. Le domaine C-terminal de ε subit un changement conformationnel dramatique lorsque les transitions de l&#39;enzyme entre les états actifs et inactifs, et des ligands au site catalytique, qui peuvent influencer des conformations de ε est prédominante. Les mesures d&#39;analyse cinétique de liaison / dissociation avec le complexe catalytique, et indirectement de mea εSures le décalage ε de l&#39;enzyme lié à et à partir de la conformation d&#39;inhibition apparemment nondissociable. Le signal d&#39;interférométrie Bio-couche n&#39;est pas excessivement sensible à la composition de la solution, de sorte qu&#39;il peut également être utilisé pour surveiller les effets allostériques de ligands au site catalytique sur les changements conformationnels de ε.

Liaison en temps réel et la cinétique de dissociation de BLI sont le montre la figure 3. Cette expérience a été effectuée avec un tampon de dosage en association et de dissociation. Cette expérience a été commencé avec un pas de ligne de base de 10 min depuis les capteurs ont été brièvement pré-imbibé. Ensuite, ε biotinylé a été chargé sur les capteurs. Pas de dissociation détectable de ε s&#39;est produite dans toutes les étapes restantes comme on le voit à partir de la courbe d...

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Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Les protocoles décrivent ici les essais cinétiques des interactions protéine-protéine avec Bio-couche interférométrie. Type F ATP synthase, qui est impliquée dans le métabolisme énergétique cellulaire, peut être inhibée par sa sous-unité ε dans des bactéries. Nous avons adapté Bio-couche interférométrie pour étudier les interactions du complexe catalytique avec le domaine C-terminal inhibiteur de ε.

Bio-couche interférométrie pour Cinétique des interactions protéine-protéine et allostériques Effets ligand mesure

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

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Chemistry

28.7K vues.  SUNY Upstate Medical University.  Les protocoles décrivent ici les essais cinétiques des interactions protéine-protéine avec Bio-couche interférométrie. Type F ATP synthase, qui est impliquée dans le métabolisme énergétique cellulaire, peut être inhibée par sa sous-unité ε dans des bactéries. Nous avons adapté Bio-couche interférométrie pour étudier les interactions du complexe catalytique avec le domaine C-terminal inhibiteur de...

Vidéo: Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Une simple et rapide Protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Recherche

Chimie

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Examen quantitative et qualitative des interactions entre particules à l&#39;aide de la sonde colloïdale nanoscopie

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

Un ELISA à base de liaison et la méthode de la concurrence de déterminer rapidement interactions ligand-récepteur

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature solvents. These coordinating ligands help solubilize and stabilize the nanoparticles while in solution, and can influence the resulting size and reactivity of the nanoparticles during their formation. Despite the ubiquity of using ligands during synthesis, the presence of aliphatic ligands on the nanoparticle surface can result in a number of problems during the end use of the nanoparticles, necessitating further ligand stripping or ligand exchange procedures. We have developed a way to synthesize cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using a unique sulfur copolymer. This sulfur copolymer is primarily composed of elemental sulfur, which is a cheap and abundant material. The sulfur copolymer has the advantages of operating both as a high temperature solvent and as a sulfur source, which can react with a cadmium precursor during nanoparticle synthesis, resulting in the generation of ligand free CdS. During the reaction, only some of the copolymer is consumed to produce CdS, while the rest remains in the polymeric state, thereby producing a nanocomposite material. Once the reaction is finished, the copolymer stabilizes the nanoparticles within a solid polymeric matrix. The copolymer can then be removed before the nanoparticles are used, which produces nanoparticles that do not have organic coordinating ligands. This nascent synthesis technique presents a method to produce metal-sulfide nanoparticles for a wide variety of applications where the presence of organic ligands is not desired.

Herein we present a method to synthesize ligand-free cadmium sulfide (CdS) nanoparticles based on a unique sulfur copolymer. The sulfur copolymer operates as a high temperature solvent and a sulfur source during the nanoparticle synthesis and stabilizes the nanoparticles after the reaction.

Synthèse du ligand libre-CdS Nanoparticules dans une matrice de soufre Copolymer

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Site Réalisé Étiquetage Spin et EPR spectroscopiques études de pentamères Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, 1,4-benzene-bis(iminoguanidinium) (BBIG), is demonstrated. The ligand is synthesized as the chloride salt (BBIG-Cl) by in situ imine condensation of terephthalaldehyde with aminoguanidinium chloride in water, followed by crystallization as the sulfate salt (BBIG-SO4). Alternatively, BBIG-Cl is synthesized ex situ in larger scale from ethanol. The sulfate separation ability of the BBIG ligand is demonstrated by selective and quantitative crystallization of sulfate from seawater. The ligand can be recycled by neutralization of BBIG-SO4 with aqueous NaOH and crystallization of the neutral bis-iminoguanidine, which can be converted back into BBIG-Cl with aqueous HCl and reused in another separation cycle. Finally, 35S-labeled sulfate and &#946; liquid scintillation counting are employed for monitoring the sulfate concentration in solution. Overall, this protocol will instruct the user in the necessary skills to synthesize a ligand, employ it in the selective crystallization of sulfate from aqueous solutions, and quantify the separation efficiency.

A protocol for in situ aqueous synthesis of a bis(iminoguanidinium) ligand and its utilization in selective separation of sulfate is presented.

Séparation Sulfate par Selective Cristallisation avec un Ligand Bis-iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Regards sur les interactions des acides aminés et Peptides avec matériaux inorganiques à l&#39;aide d&#39;une seule molécule de travail Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

Accès précieux Ligand Supports pour métaux de transition: Une modification, Intermediate échelle Préparation de 1,2,3,4,5-pentaméthylcyclopentadiène

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Induite par le ligand de nucléation et croissance de nanoparticules métalliques de Palladium

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.