Les auteurs tiennent à remercier le Conseil de recherches en sciences naturelles et de fournir un soutien financier à ce projet.

1. Isolation de sec biomasse algale à servir de normes pour fluorescence Lectures <ol><li> Supprimer un volume d&#39;échantillon de la culture d&#39;algues croissante qui fournira au moins 200 mg de biomasse sèche, 400-600 mg est préférable. </li><li> Extrait Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 10 000 x g. Jeter le surnageant et laver le culot avec un volume égal de tampon phosphate formulé pour le même pH que le milieu de croissance. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.2 pour un total de 3 étapes de lavage. </li><li> Re-suspendre le culot dans de l&#39;eau déminéralisée et transférer dans un plat préalablement pesé peser. Laissez sécher à 50 ° C pendant 48 heures. NOTE: Le séchage sous vide diminue le temps de séchage et le séchage de la culture à des températures supérieures à 50 ° C peut, par remise en suspension difficile. </li><li> Séché magasins algues cultures à la température ambiante pour une utilisation future. </li></ol> 2. Quantification gravimétrique des lipides neutres par hexane Extraction (Adapté de Bligh et Dyer 4) <ol><li> Mesurer environ 50 mg de biomasse d&#39;algues sèches dans un plat peser. REMARQUE: messes allant de 40 à 80 mg peuvent être utilisés sans perte de reproductibilité. </li><li> Transférer la biomasse à un mortier pré-lavé avec de l&#39;hexane. Le cas échéant, laver le plat peser avec une petite quantité (1 ml) d&#39;hexane à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur afin de transférer totalement la biomasse au mortier. NOTE: L&#39;hexane est une substance hautement volatile et toxique. Il doit être manipulé dans la hotte avec des vêtements de protection appropriés. </li><li> Broyer la biomasse algale pendant 5 minutes à l&#39;aide d&#39;un pilon. Commencez par broyage doux et augmenter progressivement l&#39;intensité. Broyer la biomasse dans une pâte fine et lisse dans la période de 5 min. Si un excès d&#39;hexane est utilisé lors du transfert de la biomasse dans le mortier, il est préférable d&#39;attendre que l&#39;hexane s&#39;évaporer avant le broyage. </li><li> Ajouter quelques ml d&#39;hexane pour le mortier et mélanger la suspension résultante avec le pilon jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit homogénéisée. Assurez-vous que tous les débris cellulaires adhère aux parois de la mortar sont frappé libre et en suspension dans le liquide. </li><li> Transférer le mélange de la masse de l&#39;hexane-cellules dans un tube de centrifugeuse. NOTE: Le tube de centrifugation doit être en verre ou en un polymère approprié compatible avec de l&#39;hexane tel que le Teflon. </li><li> Répéter les étapes 2.4 et 2.5 jusqu&#39;à ce que toute la biomasse a été transféré dans le tube de centrifugation (3-5x). </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 4 ° C pendant 20 min à 10 000 x g. </li><li> Pipette avec précaution le surnageant dans un métal pré-pesée peser plat. Stocker dans la hotte. </li><li> Effectuer une extraction par l&#39;hexane 2 ème ajout de 3 ml d&#39;hexane à la pastille et vigoureusement au vortex pendant 1 minute. </li><li> Répétez les étapes 2.7 et 2.8. Si nécessaire, exécutez les échantillons pendant 30 min dans la centrifugeuse pendant la seconde extraction pour s&#39;assurer que tous les débris cellulaires s&#39;installe entièrement. Déterminer la masse d&#39;huile extraite par gravimétrie après hexane s&#39;évapore. </li></ol> 3. Fluorometric quantification des lipides neutres Utilisation Nil Rouge (comme Rapported par de la Hoz Siegler et al. 11) NOTE: Seuls 10 pi d&#39;une suspension d&#39;algues à 5 g / L est nécessaire pour la lecture de fluorescence. En général, l&#39;isolement de la biomasse d&#39;algues sèches de 1,5 ml de bouillon de culture est plus que suffisante. Par ailleurs, l&#39;intensité lumineuse de la lampe dans le spectrophotomètre peut se dégrader au fil du temps. Il est recommandé d&#39;inclure des normes dans chaque expérience pour assurer que les variations de l&#39;instrument n&#39;ajoutent pas d&#39;erreur inutile aux mesures. <ol><li> Préparer une solution rouge Nil à une concentration de 10 pg / ml dissous dans de l&#39;éthanol de qualité réactif à l&#39;alcool. Conserver cette solution dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Préparer une solution à 30% (v / v) d&#39;éthanol dans de l&#39;eau déminéralisée et stocker à 4 ° C. </li><li> Préparer tous les échantillons d&#39;algues à la même concentration de la biomasse (il est recommandé de 5 g / L) et de la même manière que les critères utilisés dans l&#39;évaluation. Pour ce faire, soit par des échantillons de suspension pré-séchés dans la quantité appropriéede tampon phosphate (0,6 g / L de phosphate de potassium dibasique, 1,4 g / L de phosphate de potassium monobasique), ou en ajustant la concentration d&#39;une culture d&#39;algues en croissance à 5 g / L de tampon phosphate après la mesure de la turbidité. REMARQUE: Les mesures effectuées sur des cultures d&#39;algues vivantes auront souvent plus grande erreur qui leur est associé en fonction de la précision de la courbe d&#39;étalonnage de la turbidité. La remise en suspension des échantillons secs peut nécessiter l&#39;utilisation d&#39;un homogénéisateur pour disperser complètement la biomasse. </li><li> Pour chaque échantillon, mélanger 80 ul de la solution d&#39;éthanol à 30%, 10 ul de la solution rouge Nil, et 10 ul de suspension d&#39;algues dans un seul puits d&#39;une plaque à 96 puits. Afin de bien rendre compte de la variabilité de la mesure de fluorescence, effectuer 5 répétitions de chaque échantillon. </li><li> Exécutez une courbe d&#39;étalonnage en deux points aux normes préalablement préparés afin de tenir compte des variations au jour le jour de l&#39;instrument et de la préparation. Préparer les étalons pour la mesure de la fluorescence à l&#39;aide de la sProcédure ame que les échantillons. REMARQUE: En général, deux points est suffisant pour un recalibrage de l&#39;instrument, trois points peuvent être exécutés pour vérifier la linéarité. </li><li> Effectuer les mesures de fluorescence dans un multi-puits lecteur de plaque spectrophotomètre. Les conditions suivantes ont été trouvées pour obtenir les résultats les plus cohérents 11: <ol><li> Agiter à 1200 rpm, orbite 3 mm, pour 30 sec. </li><li> Incuber à 40 ° C pendant 10 min. </li><li> Agiter à 1200 rpm, orbite 3 mm, pour 30 sec. </li><li> fluorescence d&#39;enregistrement, l&#39;excitation à 530 nm, émission à 604 nm. </li></ol></li><li> Convertir les mesures de fluorescence à la teneur en huile en utilisant les résultats des étalons internes. </li></ol> 4. Technique microscopie de fluorescence REMARQUE: Le protocole de coloration décrit dans l&#39;article 3 est conçu pour l&#39;analyse quantitative, mais il peut aussi être utile de fournir des représentations visuelles des techniques basées taches pour unité centrale d&#39;éducation et d&#39;illustrationrposes. Pour produire des images de l&#39;échantillon fluorescence nécessite un microscope optique avec des sources de transmission et d&#39;éclairage à épifluorescence plus traditionnels. Excitation et d&#39;émission filtres de lumière dans le 530 nm (vert) et 604 nm (rouge) gamme, respectivement, sont nécessaires pour la tache rouge du Nil ainsi que d&#39;une caméra montée au microscope avec un logiciel associé. Les images présentées dans cette étude (figure 1) ont été acquises à l&#39;aide d&#39;un microscope en champ clair équipé d&#39;une caméra et monochrome à l&#39;unité de convertisseur RGB. Le procédé de production du Nil Red images de fluorescence à l&#39;aide de ces outils est décrit ci-dessous: <ol><li> Préparer un échantillon de la culture avec la tache rouge Nil conformément à l&#39;article 3 du protocole. REMARQUE: un échantillon de 5 g / L gamme de concentration produit des lames de densité adéquate des cellules sans surpopulation. </li><li> Après avoir terminé l&#39;étape 3.6 du protocole de coloration, préparer une lame de microscope de l&#39;échantillon traité selon les procédures standard de laboratoire. </li><li> En commençant par le microscope en transmission, charger la lame préparée dans le microscope, et de localiser les cellules à l&#39;agrandissement souhaité (images présentées dans cet article ont été acquis avec l&#39;objectif 100X). </li><li> Une fois la mise, passer le microscope de transmission en mode d&#39;éclairage à épifluorescence. La source lumineuse doit maintenant être vient directement de la lentille d&#39;objectif (ce qui peut être confirmé par l&#39;observation visuelle de l&#39;espace entre la lame et la lentille d&#39;objectif). </li><li> Insérer un filtre d&#39;excitation verte dans la source de lumière et un filtre d&#39;émission de rouge dans le trajet de lumière d&#39;observation; la fluorescence des cellules colorées devrait maintenant être directement visible à travers l&#39;oculaire. </li><li> Changez le mode de l&#39;observation au microscope de l&#39;oculaire de l&#39;appareil photo monté et utiliser un logiciel de visualisation pour capturer une image des cellules fluorescentes. Selon la sensibilité de la caméra, l&#39;échantillon peut ne pas apparaître d&#39;abord dans la fenêtre d&#39;aperçu (c&#39;est à dire l&#39;écranêtre noir); pour remédier à cela, ajuster le temps et le gain de l&#39;appareil d&#39;exposition à un niveau où les cellules sont visibles. Paramètres spécifiques varient selon les instruments, du matériel et des types de cellules. </li></ol>

<ol>
	<li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiesel+from+microalgae.">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Algal+Biofuels+Technology+Roadmap.+Energy+Efficiency+&amp;+Renewable+Energy.">National Algal Biofuels Technology Roadmap. 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Meth. 55, 411-418 (2003).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Nile+red+method+for+quantitative+measurement+of+neutral+lipids+in+microalgae.">A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.</a> J. Microbiol. 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Phycol. 15, 433-438 (2003).</li><li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids.">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li><li>Feng, G. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination.">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence.">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii.">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li><li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting.">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li><li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus.">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li><li>Bertozzini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+standard+addition+method+for+the+absolute+quantification+of+neutral+lipids+in+microalgae+using+Nile+red.">Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red.</a> J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).</li><li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii.">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les algues utilisées dans la courbe standard doit être les mêmes espèces cultivées dans les mêmes conditions expérimentales que celles qui sont mesurées. Des changements significatifs dans la composition du milieu, la technique de la culture, et le protocole de coloration peuvent influer sur l&#39;intensité de la lecture de fluorescence. extraction à l&#39;hexane (décrit dans les sections 1 et 2) a été utilisé pour déterminer la teneur en lipide neutre d&#39;échantillons utilisés dans la courbe standard...

En raison de leur capacité à stocker corps lipidiques sous certaines conditions de stress, les algues ont reçu beaucoup d&#39;attention ces dernières années comme une source de carburant renouvelable potentiel de 1,2. Lipides neutres peuvent représenter plus de 60% ​​du poids sec de la cellule dans des conditions de croissance appropriées 3. Pourtant, l&#39;industrie n&#39;a pas de protocole simple, propre, rapide, fiable et standardisée pour quantifier la teneur en lipides des cellules d&#39;algues afin de surveiller correctement le rendement des bioprocédés, analyser les cultures, et l&#39;écran de nouvelles souches. La méthode gravimétrique Bligh-Dyer développé il ya 50 ans reste parmi les techniques les plus couramment utilisés aujourd&#39;hui 4,5. Bien que cette procédure est simple, fiable et facile à mettre en oeuvre, il prend du temps, nécessite de grands volumes d&#39;échantillons, et rend l&#39;utilisation de solvants toxiques. Il n&#39;est pas pratique pour l&#39;analyse de nombreux échantillons à partir d&#39;un essai de fermentation ou de criblage de nouvelles souches riches en huile. D&#39;autres méthodes ont been développé, mais le plus souvent besoin d&#39;équipement de pointe et n&#39;ont pas été normalisés 6. Une alternative qui a suscité beaucoup d&#39;intérêt est la tache rouge Nil. Nile Red, un colorant qui émet une fluorescence de manière préférentielle dans des milieux non polaires, a été utilisée pour identifier ou quantifier les corps lipidiques dans différents organismes, y compris des nématodes 7, 8 levures, les bactéries et les algues 9, 10-19. Techniques initiales impliquant Nil Rouge étaient essentiellement qualitative ou semi-quantitative, combinant la tache avec une seule cuvette spectrophotométrie ou la cytométrie de flux. En outre, certaines classes d&#39;algues telles que les algues vertes ont des puits de cellules d&#39;épaisseur qui sont essentiellement imperméable au colorant, ce qui limite la portée de la technique 10. Récentes améliorations apportées à la méthode de coloration rouge Nil ont été signalés qui contournent les lacunes initiales du protocole 10,11. La coloration des cellules en présence d&#39;un carrier solvant tel que le DMSO 10 ou éthanol 10,11 linéarise la relation entre la teneur en huile et l&#39;absorbance, ce qui permet des mesures quantitatives fiables. Le solvant permet de perméabiliser la membrane cellulaire de façon que les molécules Nile Red peuvent passer à travers. En outre, l&#39;incorporation d&#39;un spectrophotomètre avec des capacités de lecture de micro-plaque permet protocoles à haut débit appropriés pour l&#39;analyse quantitative. En ce détail article de nous une méthode simple pour mesurer la teneur en huile des cellules algales par coloration cultures avec Nil Rouge en présence d&#39;éthanol, un solvant doux. Afin d&#39;expliquer plus précisément pour le bruit de fond dans les mesures, d&#39;une courbe standard corréler l&#39;intensité de fluorescence à la teneur en huile est développée à l&#39;aide de cellules d&#39;algues composition d&#39;huile connue. La méthode est une adaptation de protocoles précédemment publiés 10,11. En utilisant un spectrophotomètre à 96 puits, on est capable d&#39;analyser la même quantité d&#39;échantillons dans un tha heuresl faudrait jours pour surveiller par des méthodes gravimétriques. En outre, par une calibration en utilisant des échantillons représentatifs de l&#39;espèce algale désiré ce procédé produit des mesures relativement précises qui sont directement interprétables. Il existe de nombreux protocoles décrivant les méthodes de coloration des algues avec Red Nil optimisé pour différentes souches et des applications; le protocole présenté ici a été développé à l&#39;origine par de la Hoz Siegler et al. 11 pour protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, et Scenedesmus obliquus, mais il est probable approprié pour de nombreuses autres espèces et les classes. Il a été conçu à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance et il fonctionne aussi bien pour les échantillons préalablement séchés et des échantillons humides à partir d&#39;une culture de plus en plus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dry Weight</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">25 ml disposable pipettes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipette Bulb</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-681-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-562-16A</td>
			<td>Teflon needed for hexane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Weigh Dishes (polypropylene)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">2-202B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1.5 ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Sorvall</td>
			<td style="width:152px;">RC6plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Drying Oven (Fisher 625D)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-254-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Storage vials</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">0337-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-40-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gravimetric Quantification</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Porcelain Mortar (Coorstek)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-961A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Porcelain Pestle (Coorstek)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-961-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">40 ml Centrifugation tubes (FEP)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-562-16A</td>
			<td>Could also use glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">08-732-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Hexanes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">H292-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:347px;">Fluorometric quantification of oil content</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Lab Systems</td>
			<td style="width:152px;">Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fluorescence reader software</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Lab Systems</td>
			<td style="width:152px;">Ascent Software 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">COSTAR 96 well plate with round bottom</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">06-443-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Nile Red&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">N3013-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol (Alcohol reagent grade)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">AC65109-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Imaging Fluorescent cells</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">DMRXA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microscope cover slips</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Camera</td>
			<td style="width:152px;">Qimaging</td>
			<td style="width:152px;">Retiga Ex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Imaging software</td>
			<td style="width:152px;">Qimaging</td>
			<td style="width:152px;">QCapture v.1.1.8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and rapid protocol for measuring neutral lipids in algal cells using fluorescence

Les algues sont considérés comme d&#39;excellents candidats pour les sources de carburants renouvelables en raison de leurs capacités de stockage des lipides naturels. Un suivi rigoureux des processus de fermentation des algues et le dépistage de nouvelles souches riches en pétrole nécessite un protocole rapide et fiable pour la détermination de la teneur en lipides intracellulaires. Les pratiques actuelles reposent en grande partie sur les méthodes gravimétriques pour déterminer la teneur en huile, techniques développées il ya des décennies qui sont de temps et nécessitent de grands volumes d&#39;échantillons. Dans le présent document, le rouge Nil, un colorant fluorescent qui a été utilisé pour identifier la présence de corps lipidiques dans de nombreux types d&#39;organismes, est incorporé dans un protocole simple, rapide et fiable pour la mesure de la teneur en lipides neutres de protothecoides Auxenochlorella, un vert algue. Le procédé utilise de l&#39;éthanol, un solvant relativement doux, pour perméabiliser la membrane cellulaire avant coloration et un puits de micro-plaques 96 pour augmenter la capacité de l&#39;échantillon pendant les mesures d&#39;intensité de fluorescence. Il a été la conceptioned à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance. Échantillons préalablement séchés ou des échantillons vivants à partir d&#39;une culture en croissance peuvent être utilisées dans le dosage.

Cellules d&#39;algues représentatives colorées avec le colorant rouge Nil sont illustrés dans la Figure 1. Parties A et B de la figure 1 images d&#39;affichage de A. protothecoides cultivées dans un excès d&#39;azote, conduisant à très faible accumulation de lipides intracellulaires. Dans les parties C et D, des échantillons de A. protothecoides cultivées sous limitation d&#39;azote sont prés...

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Un protocole simple de déterminer la teneur en lipide neutre de cellules d&#39;algues en utilisant une procédure de coloration rouge Nil est décrite. Cette technique de gagner du temps offre une alternative aux protocoles de quantification des lipides traditionnels à base gravimétriques. Il a été conçu pour une application spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance.

Une simple et rapide Protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

35.3K vues.  University of Alberta.  Un protocole simple de déterminer la teneur en lipide neutre de cellules d'algues en utilisant une procédure de coloration rouge Nil est décrite. Cette technique de gagner du temps offre une alternative aux protocoles de quantification des lipides traditionnels à base gravimétriques. Il a été conçu pour une application spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance. 

Vidéo: A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Recherche

Chimie

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Préparation cellules adhérentes pour fluorescence X-ray Imaging par fixation chimique

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Rapid à haut débit Identification des espèces de matériel botanique Utilisation de l&#39;analyse directe en temps réel Résolution Spectrométrie de Masse Haute

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

A Simple and Efficient Protocol for the Catalytic Insertion Polymerization of Functional Norbornenes

Norbornene can be polymerized by a variety of mechanisms, including insertion polymerization whereby the double bond is polymerized and the bicyclic nature of the monomer is conserved. The resulting polymer, polynorbornene, has a very high glass transition temperature, Tg, and interesting optical and electrical properties. However, the polymerization of functional norbornenes by this mechanism is complicated by the fact that the endo substituted norbornene monomer has, in general, a very low reactivity. Furthermore, the separation of the endo substituted monomer from the exo monomer is a tedious task. Here, we present a simple protocol for the polymerization of substituted norbornenes (endo:exo ca. 80:20) bearing either a carboxylic acid or a pendant double bond. The process does not require that both isomers be separated, and proceeds with low catalyst loadings (0.01 to 0.02 mol%). The polymer bearing pendant double bonds can be further transformed in high yield, to afford a polymer bearing pendant epoxy groups. These simple procedures can be applied to prepare polynorbornenes with a variety of functional groups, such as esters, alcohols, imides, double bonds, carboxylic acids, bromo-alkyls, aldehydes and anhydrides.

We describe the catalytic insertion polymerization of 5-norbornene-2-carboxylic acid and 5-vinyl-2-norbornene to form functional polymers with a very high glass transition temperature.

Un protocole simple et efficace pour l&#39;insertion catalytique Polymérisation de norbornènes fonctionnels

Norbornene can be polymerized by a variety of mechanisms, including insertion polymerization whereby the double bond is polymerized and the bicyclic ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

Un protocole pour la salubrité de lithiation Réactions Utilisation organolithium Réactifs

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Mesure simultanée de HDAC1 et de HDAC6 activité en HeLa cellules utilisant UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

Quantifier les données de Fluorescence de rayons x à l’aide de cartes

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Fabrication and Testing of Catalytic Aerogels Prepared Via Rapid Supercritical Extraction

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three preparation methods are described: (a) the incorporation of metal salts into silica or alumina wet gels using an impregnation method; (b) the incorporation of metal salts into alumina wet gels using a co-precursor method; and (c) the addition of metal nanoparticles directly into a silica aerogel precursor mixture. The methods utilize a hydraulic hot press, which allows for rapid (&#60;6 h) supercritical extraction and results in aerogels of low density (0.10 g/mL) and high surface area (200-800 m2/g). While the work presented here focuses on the use of copper salts and copper nanoparticles, the approach can be implemented using other metal salts and nanoparticles. A protocol for testing the three-way catalytic ability of these aerogels for automotive pollution mitigation is also presented. This technique uses custom-built equipment, the Union Catalytic Testbed (UCAT), in which a simulated exhaust mixture is passed over an aerogel sample at a controlled temperature and flow rate. The system is capable of measuring the ability of the catalytic aerogels, under both oxidizing and reducing conditions, to convert CO, NO and unburned hydrocarbons (HCs) to less harmful species (CO2, H2O and N2). Example catalytic results are presented for the aerogels described.

Here we present protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms. Methods for preparing materials using copper salts and copper-containing nanoparticles are featured. Catalytic testing protocols demonstrate the effectiveness of these aerogels for three-way catalysis applications.

Fabrication et essai d’aérogels catalytiques préparés par Extraction supercritique rapide

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity and convenient colorimetric readout. However, high densities of nanoparticles are typically needed for detection. The available synthesis-based enhancement protocols are either limited to gold and silver nanoparticles or rely on precise enzymatic control and optimization. Here, we present a protocol to enhance the colorimetric readout of gold, silver, silica, and iron oxide nanoprobes. It was observed that the colorimetric signal can be improved by up to a 10000-fold factor. The basis for such signal enhancement strategies is the chemical reduction of Au3+ to Au0. There are several chemical reactions that enable the reduction of Au3+ to Au0. In the protocol, Good&#39;s buffers and H2O2 are used and it is possible to favor the deposition of Au0 onto the surface of existing nanoprobes, in detriment of the formation of new gold nanoparticles. The protocol consists of the incubation of the microarray with a solution consisting of chloroauric acid and H2O2 in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid pH 6 buffer following the nanoprobe-based detection assay. The enhancement solution can be applied to paper and glass-based sensors. Moreover, it can be used in commercially available immunoassays as demonstrated by the application of the method to a commercial allergen microarray. The signal development requires less than 5 min of incubation with the enhancement solution and the readout can be assessed by naked eye or low-end image acquisition devices such as a table-top scanner or a digital camera.

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In this work, a protocol for signal enhancement of nanoprobe-based biosensing is presented. The protocol is based on the reduction of chloroauric acid onto the surface of existing nanoprobes that consist of gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles.

Signal Nanoprobe rapide amélioration de la synthèse de nanoparticules or In Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer by generating a charged structure provides an opportunity to use extraction as a simple purification technique. By combining the use of a miscible organic solvent with saturated sodium bisulfite, aldehydes and reactive ketones can be successfully transformed into charged bisulfite adducts that can then be separated from other organic components of a mixture by the introduction of an immiscible organic layer. Here, we describe a simple protocol for the removal of aldehydes, including sterically-hindered neopentyl aldehydes and some ketones, from chemical mixtures. Ketones can be separated if they are sterically unhindered cyclic or methyl ketones. For aliphatic aldehydes and ketones, dimethylformamide is used as the miscible solvent to improve removal rates. The bisulfite addition reaction can be reversed by basification of the aqueous layer, allowing for the re-isolation of the reactive carbonyl component of a mixture.

Here, we present a protocol to remove aldehydes and reactive ketones from mixtures by a liquid-liquid extraction protocol directly with saturated sodium bisulfite in a miscible solvent. This combined protocol is rapid and facile to perform. The aldehyde or ketone can be re-isolated by the basification of the aqueous layer.

Séparation des aldéhydes et des cétones réactives des mélanges à l’aide d’un protocole d’Extraction de Bisulfite

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...