Les auteurs tiennent à remercier Mme Meike Schaffrinski pour elle toujours une excellente assistance technique au cours des dernières années. Ce travail a été financé par le Conseil de recherches en allemand (DFG) dans le groupe de recherche conjoint 942 (FOR942) et par le Programme de recherche de la Faculté de médecine, Georg-Août-Université de Göttingen.

1 Préparation de stérile de sérum humain AB <ol><li> Recueillir 4-5 poches de plasma frais congelé (PFC). sacs à conserver à -20 ° C jusqu&#39;à ce que suffisamment de sacs ont été collectés. </li><li> Décongeler sacs et incuber pendant 30 min à 56 ° C dans un bain d&#39;eau pour inactiver le complément et enlever la fibrine. </li><li> Bien désinfecter l&#39;extérieur du sac et transférer le plasma de tubes de 50 ml. </li><li> Centrifugeuse à 3000 g pendant 15 min à température ambiante pour se débarrasser de précipités et les plaquettes résiduelles. </li><li> Commun de toutes les surnageants et jeter les boulettes. </li><li> des échantillons de sérum de l&#39;aliquote en tubes de 15 ml et conserver à -20 ° C. NOTE: En variante, disponible dans le commerce du sérum AB humain normal inactivé par la chaleur peut être utilisé. </li></ol> Isolement des monocytes 2 Afin de faciliter l&#39;équilibrage de la centrifugeuse, il est recommandé de traiter les deux couches leucocytaires en parallèle. Cependant, prendre care d&#39;utiliser des matériaux différents pour chaque bailleur de fonds et de ne pas mélanger les cellules. Dans le cas de couches leucocytaires ne peuvent pas être obtenus facilement, 400 ml de sang périphérique héparine peuvent être utilisés à la place. <ol><li> Désinfecter soigneusement les sacs en plastique contenant les couches leuco-plaquettaires et transférer le contenu de chaque couche leuco-plaquettaire à deux tubes de 50 ml. </li><li> Pour chaque couche leuco-plaquettaire remplir trois tubes de 50 ml avec 15 ml de solution de Ficoll (1,077 g / ml). Le Ficoll doit être à température ambiante pendant la préparation. </li><li> La couche de 30 à 35 ml de sang de la couche leucocytaire au-dessus de la solution de Ficoll pour le premier gradient de densité. Soyez prudent de le faire lentement et avec précaution afin d&#39;éviter de mélanger les deux couches. </li><li> Centrifuger à 400 xg sans frein pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Pour chaque gradient de recueillir l&#39;anneau blanc de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) qui est situé entre les deux phases avec une pipette Pasteur en plastique et transférer dans un tube de 50 ml. </li><li> Remplir chaque tube avec du PBS-EDTA (1 mM) à 40 ml au total. </li><li> Centrifuger à 300 g pendant 10 min sans frein à la température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant et laver de nouveau culot avec 40 ml de PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Pour chaque bassin de donneurs pastilles dans 20 ml de RPMI-1640 sans rouge de phénol + 10% de FCS. </li><li> Préparer la solution de Percoll iso-osmotique pour la deuxième gradient de densité: Pour les deux donneurs mélange 23,13 ml d&#39;une solution de Percoll (densité: 1,131 g / ml) dans un tube de 50 ml avec 1,87 ml de PBS 10 fois. Ensuite, transférer 23 ml de cette solution dans un nouveau tube de 50 ml et ajouter 27 ml de RPMI-1640 avec du rouge de phénol + 10% de FCS pour obtenir une solution à 46% d&#39;iso-osmotique Percoll. Le Percoll doit être à température ambiante pendant la préparation. </li><li> Pour chaque donneur par transfert de 25 ml de la solution Percoll disposé à un tube de 50 ml et la solution de couche de PBMC préparé en 2.9) au-dessus de la solution de Percoll. Soyez prudent de le faire très lentement uneD attentivement, les deux couches ont tendance à se mélanger facilement. Si fait correctement les deux phases peuvent être distinguées en raison de leur différence de couleur. </li><li> Centrifuger à 550 xg sans frein pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Pour chaque gradient de recueillir l&#39;anneau blanc de monocytes, qui est situé entre les deux phases avec une pipette Pasteur en plastique et transférer dans un tube de 50 ml. </li><li> Remplir chaque tube avec du PBS-EDTA (1 mM) à 50 ml au total. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 10 min sans frein à la température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les culots dans 20 ml de RPMI-1640 avec du rouge de phénol + 10% de FCS. </li></ol> 3. différenciation des monocytes en macrophages <ol><li> Déterminer le nombre de monocytes isolés dans une dilution de 1:10 en bleu trypan. Compter que les grandes cellules, forme irrégulière, souvent, qui sont les monocytes. Ne pas compter les cellules plus petites, de forme ronde, qui sont des lymphocytes. NOTE: nombre de monocytes n&#39;ont pas à être déterminée avec précision en raison trop ils ne donnent une indication sur le nombre et les FEP Téflon enduit sacs (petites ou grandes) doivent être utilisés pour la différenciation des cellules. </li><li> Pour 1,0-1,5 x 10 8 monocytes d&#39;un donateur, ensemencer les cellules dans un grand sac de culture de cellules FEP Téflon. Pour chaque sac préparer le milieu de culture constitué de 174 ml du milieu RPMI-1640, 2% de sérum AB humain (tel que préparé dans la section 1), 1% de pénicilline / streptomycine, et 2,5 ng / ml de M-CSF (volume total: 180 ml). <ol><li> Pour 3,0-5,0 x 10 7 monocytes d&#39;un donateur, ensemencer les cellules dans un petit sac de culture cellulaire revêtu de téflon. Pour chaque sac de préparer le milieu de culture constitué de 28,5 ml de RPMI-1640, 2% de sérum AB humain (tel que préparé dans la section 1), 1% de pénicilline / streptomycine, et 2,5 ng / ml de M-CSF (volume total: 30 ml). REMARQUE: Si, par exemple, on obtient 8,0 x 10 7 monocytes, nous vous recommandons de les semer dans two petits sacs de volume avec 4,0 x 10 7 cellules chacune. Au lieu de M-CSF, les monocytes peuvent également être différenciées des granulocytes et des macrophages colony-stimulating factor (GM-CSF) à la même concentration (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Ajouter la suspension de cellules (20 ml) au milieu préparé et mélanger soigneusement. Si deux sacs sont préparés à partir d&#39;un donneur, ajouter 20 ml de RPMI-1640 à la suspension de cellules, puis ajouter la moitié de la suspension de chaque préparation milieu. </li><li> Facultatif: Pour déterminer si la préparation de monocytes est restée stérile, déchirer une goutte de la suspension cellulaire sur une plaque de gélose au sang et incuber pendant la nuit à 37 ° C. </li><li> Serrer la gaine d&#39;un perfuseur 50 ml seringue sur la fiche du sac de culture de cellules FEP revêtue de téflon et le remplir avec la suspension cellulaire préparée. </li><li> Débranchez la seringue et pousser l&#39;air restant dans le sac. Fermez le sac avec un cône de fermeture. </li><li> Incuber les sacs pour 6-7 jours à 3776; C avec 5% de CO 2. </li></ol> 4. macrophages récolte <ol><li> Placez le Téflon FEP revêtues les sacs de culture cellulaire avec les macrophages différenciés sur la glace pendant au moins 1 heure pour faciliter le détachement des cellules (une incubation pouvant aller jusqu&#39;à 3 est possible h). Assurez-vous que la totalité de la surface du sac est recouvert de glace. </li><li> Tirez le sac avec une pression minimale 10x sur le bord d&#39;un bureau / conseil. </li><li> Désinfecter soigneusement l&#39;extérieur du sac et retirez le cône de fermeture. </li><li> Serrer une seringue de 50 ml sur la fiche du sac, lever la suspension cellulaire, et de le transférer à tubes de 50 ml. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 10 min à température ambiante pour centrifuger les cellules. </li><li> Aspirer le surnageant et mettre en commun les pastilles d&#39;un sac dans 10 ml de RPMI-1640 + 10% FCS au total. </li><li> Déterminer le nombre de cellules dans un hémocytomètre (1: 4 à 1: 10 dilution dans du bleu trypan). Compter que les grandes cellules rondes. REMARQUE: Après la différenciation des macrophages dans des sacs en téflon FEP revêtues, il peut y avoir, par exemple les cellules résiduelles, des lymphocytes, selon le donneur et sur ​​la qualité de l&#39;isolement des monocytes. </li><li> Pour réutiliser les sacs FEP revêtus de Teflon, les laver deux fois avec 70% d&#39;éthanol pour éliminer les cellules résiduelles. Remplissez-les avec 50 ml de 70% d&#39;éthanol et incuber pendant la nuit. Lavez les sacs 3x avec du PBS stérile, les envelopper dans du papier de stérilisation, et stériliser dans un autoclave en utilisant des procédures standard. REMARQUE: Les sacs de culture cellulaire peuvent être réutilisés plusieurs fois sans perte de rendement des macrophages. Cependant, nous avons décidé de jeter les sacs après 10 utilise avant qu&#39;ils ne commencent à fuir. </li><li> Pour la suite des macrophages de la culture des expériences dans RPMI-1640 + 10% de FCS. Si les concentrations sériques plus faibles sont nécessaires, la culture dans un milieu RPMI-1640 avec 1% de FCS est également possible. Semences et les cellules incuber pendant 3-4 heures. Après cette période, noter que les macrophages se fixent à la surface de la culture cellulaire tout en platdes cellules contaminantes (par exemple les erythrocytes, les lymphocytes et les cellules dendritiques) restent en suspension. Laver les cellules deux fois au moins avec du PBS pour éliminer les cellules non-adhérentes. </li><li> Pour détacher les macrophages en culture de la boîte de culture cellulaire pour d&#39;autres expériences, grattez soigneusement les retirer de la surface. En variante, plats incuber pendant 20 minutes sur de la glace, aspirer le milieu de culture, et ajouter un tampon de dissociation cellulaire sans enzyme 1 ml. Après 5 min d&#39;incubation à 37 ° C, ajouter 4 ml de PBS et les cellules par pipetage de haut en bas pour détacher au moins 3 min. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer comme aucun conflit d&#39;intérêt existe.

Les macrophages sont des cellules effectrices importantes du système immunitaire inné et afficher des fonctions importantes dans l&#39;immunomodulation, présentation de l&#39;antigène et de l&#39;homéostasie tissulaire. En raison de leur plasticité remarquable, ils sont capables de répondre à différents stimuli et les variations de leur phénotype. Cependant, à ce jour un grand nombre de données concernant la polarisation des macrophages sont obtenus dans le système murin, bien qu&#39;il existe des rapports indiquant que seulement environ 50% des marqueurs de macrophages de polarisation peut être directement traduite de souris à 16 humain. Par conséquent, nous présentons ici une méthode pour obtenir des macrophages humains primaires en nombre et en pureté suffisante sans avoir besoin de matériel coûteux, par exemple, des billes magnétiques MACS ou un dispositif d&#39;élutriation centrifuge à contre-courant. Notre procédé est basé sur l&#39;isolement des monocytes à partir de cellules PBMC et leur différenciation en macrophages à la suite revêtu de téflon FEP sacs de culture de cellules en présence d&#39;une faible concentrations de M-CSF 11-13. Bien que les monocytes constituent moins de 5 à 10% de leucocytes du sang périphérique chez l&#39;homme, lors d&#39;une stimulation de leur recrutement à des sites périphériques, où ils se différencient en macrophages tissulaires ou les cellules dendritiques résidentes 17. La cytokine M-CSF est importante pour la survie des monocytes et entraîne leur différenciation en macrophages 18,19. Jusqu&#39;à présent, les concentrations de M-CSF qui ont été choisis pour la différenciation des monocytes allaient jusqu&#39;à 100 ng / ml, cependant, dans notre protocole, nous sommes en mesure d&#39;obtenir un nombre suffisant de macrophages matures avec une concentration de M-CSF de seulement 2,5 ng / ml 12 , 20. En outre, les cellules sont cultivées en Téflon FEP revêtues sacs de culture de cellules qui facilitent le décollement des macrophages et leur ensemencement subséquent du nombre de cellules définies. Etant donné que les sacs peuvent être réutilisés plusieurs fois, ce qui diminue encore les coûts pour le procédé d&#39;isolement. Les macrophages obtenus par cette procéduresont très positives pour CD45, CD14, CD11b, CD11c et montrer l&#39;expression du CD206 récepteur mannose qui plaide pour une population de macrophages matures, purs 21,22. En particulier, l&#39;expression élevée de CD14 est typique pour les macrophages différenciés en présence de M-CSF 23. Après l&#39;ensemencement des cellules, ils présentent une adhérence rapide à des surfaces en plastique avec des cellules présentant une morphologie en forme de fuseau typique, alors que d&#39;autres présentent un phénotype d&#39;oeuf frit. Ceci est en accord avec les observations d&#39;autres auteurs 18,22,24. Il a été rapporté que la différenciation des monocytes en présence de M-CSF conduit à des macrophages M2 polarisés 16,25. Toutefois, les macrophages isolés par notre protocole sont encore en mesure de répondre à un large éventail de stimuli, y compris l&#39;exposition à des microvésicules dérivées des cellules tumorales et la co-culture avec des cellules tumorales 26,27 exposition au LPS ou à laquelle elles réagissent avec l&#39;induction de pro gènes inflammatoires telles que IL-1 et# 946 ;, TNFa, Wnt5a ou plusieurs métalloprotéinases matricielles qui sont considérés comme caractéristiques des macrophages M1 polarisés 3,5,28. En conclusion, l&#39;isolement des monocytes en double centrifugation à gradient de densité et la différenciation subséquente vers les macrophages en Téflon FEP revêtues culture cellulaire sacs résultats dans un grand nombre de macrophages sans la nécessité de procédures techniquement difficiles ou coûteux. Les macrophages obtenus peuvent être utilisés pour une analyse ultérieure allant d&#39;activation classique à travers le LPS à la co-culture avec des cellules tumorales.

Les cellules de la lignée monocytaire et leurs dérivés différenciées - les macrophages - présentent une plasticité remarquable en ce qui concerne leur fonction biologique, conduisant à leur implication dans ces processus aussi divers que le développement, la réparation des tissus, et l&#39;immunité 1. Ce dernier est en raison de leur capacité phagocytaire et présentatrice d&#39;antigène qui place les macrophages au carrefour entre la réponse immunitaire innée et adaptative 2. Cependant, leur capacité à sécréter des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance et d&#39;autres molécules de signalisation 1, non seulement augmente leur fonction immunitaire modulateur mais également sert de base pour les fonctions supplémentaires. Les tentatives visant à refléter ces étapes d&#39;activation divers dans le cadre de la non-microbiennes conditions médiation ont abouti à des catégories M1 et M2 3. Bien que cette classification n&#39;est pas complète, elle permet une compréhension de base de la biologie des macrophages. En raison de ces capacités multiples, il n&#39;est pas surprenant que les macrophages sont associés à de nombreuses conditions qui impliquent une certaine façon le remodelage tissulaire ou une inflammation. A côté de leur rôle fondamental dans la reconnaissance et le dédouanement des agents pathogènes envahisseurs 4-6, les macrophages ont de plus en plus se préciser dans l&#39;athérosclérose, la fibrose, l&#39;obésité, le cancer et 7-10. Procédé pour la production reproductible de macrophages humains est donc essentiel à la compréhension de ces pathologies. Ici, nous présentons une méthode basée sur l&#39;isolement des monocytes humains du sang périphérique de donneurs sains par une technique de double gradient de densité de centrifugation comme décrit précédemment 11. Afin de faciliter la différenciation vers les macrophages, les cellules monocytaires isolées sont incubées en présence de faibles concentrations de M-CSF et du sérum humain normal 12. Pour faciliter davantage la manipulation et la récolte des cellules, la différenciation est réalisée en gaz FEP perméableSacs de culture de cellules téflon avec une surface hydrophobe de 12 à 15. Les macrophages au repos qui en résultent peuvent être soumises à une large gamme de dosages telles qu&#39;elles sont encore capables de répondre à un ou l&#39;autre mode M1 ou M2 analogue. D&#39;autres méthodes d&#39;isolement et de différenciation des monocytes ultérieure tels que le tri cellulaire activé magnétique (MACS) ou contre-courant élutriation centrifuge (CCE) ont des limites en ce qui concerne le rendement, le coût et le temps requis. Le protocole décrit ici offre l&#39;avantage de pouvoir être réalisée avec du matériel de laboratoire standard sans la nécessité pour les réactifs spécifiques (par exemple, les Mac billes magnétiques) ou périphériques (par exemple, appareils de CCE) et permet le traitement de grandes quantités de cellules.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

Macrophages humains sont impliqués dans une multitude de processus pathologiques allant des maladies infectieuses au cancer. Ainsi, ils constituent un outil précieux pour comprendre les mécanismes sous-jacents de ces maladies. Nous présentons donc un protocole simple pour l&#39;isolement des monocytes humains provenant de couches leucocytaires, suivie d&#39;une procédure de différenciation qui se traduit par des rendements élevés de macrophages. La technique repose essentiellement sur l&#39;équipement de laboratoire couramment disponibles et fournit ainsi un moyen économique et efficace de temps pour obtenir de grandes quantités de macrophages humains. En bref, couche leuco-plaquettaire de donneurs de sang en bonne santé sont soumis à une double centrifugation en gradient de densité de récolter des monocytes du sang périphérique. Ces monocytes sont ensuite cultivées en éthylène-propylène fluoré (FEP), les sacs de culture de cellules téflon, en présence de macrophages facteur de stimulation des colonies (M-CSF). Les macrophages différenciés peuvent être facilement recueillis et utilisés pour des études ultérieures et fonctionnelledit. Méthodes importantes pour le contrôle de la qualité et de la validation des étapes d&#39;isolement et de différenciation seront mis en évidence dans le protocole. En résumé, le protocole décrit ici permet aux scientifiques d&#39;isoler systématiquement et de façon reproductible des macrophages humains sans le besoin d&#39;outils de coûts intensive. En outre, les modèles de la maladie peuvent être étudiés dans un système humain syngénique contourner l&#39;utilisation de macrophages murins.

La première centrifugation à gradient de densité en utilisant du Ficoll donne une interphase contenant les PBMC blanc (figure 1A) c&#39;est à dire les lymphocytes et les monocytes. Ceci peut être confirmé par une coloration au May-Grünwald (figures 1B et C) des cellules recueillies, qui présente à la fois un noyau / cytoplasme de rapport élevé (typiquement des lymphocytes) et de haricot ou de noyaux en forme de bague (typique des monocytes). Lorsque ces cellules sont ensuite chargés sur un second gradient de densité à l&#39;aide de Percoll, les monocytes peuvent encore être séparée des lymphocytes et apparaître à nouveau comme une interphase blanc (figures 1D-F). Pour chaque couche leuco-plaquettaire la centrifugation en gradient de densité double décrit donne régulièrement 150 ± 40 x 10 6 monocytes qui peuvent être différenciés à 70 ± 30 x 10 6 macrophages (figure 2) par couche leuco-plaquettaire. Le rendement moyen de macrophages20 préparations indépendants était de 47 ± 14% du total des monocytes isolés. Après la centrifugation à gradient de Percoll il peut toujours y avoir des cellules monocytaires non résiduels présents dans la préparation, qui dépend de la collecte de sang, ainsi que sur la précision du procédé d&#39;isolement. Toutefois, après la phase de différenciation de 6-7 jours, la préparation se compose principalement de macrophages matures (figure 3) qui peut être en outre enrichis en raison de leur adhérence à des surfaces en plastique, une caractéristique qui n&#39;est pas partagée par les cellules contaminantes aléatoires (figures 4A et B). Une fois plaqué, la majorité des macrophages montrent un &quot;oeuf sur le plat&quot; morphologie classique bien qu&#39;il existe également des cellules avec un phénotype broche étiré en forme (figures 4C et D). Cela se reflète par leur répartition F-actine dans le cytoplasme et adhérence grappes. Les cellules différenciéessont caractérisés par l&#39;expression de CD45, CD14, CD16, CD206 (récepteur du mannose), CD11b et CD11c, qui sont des marqueurs typiques pour les macrophages matures (figure 5). La présence de CD11b plaide contre une différenciation dendritique qui est principalement supporté par le fait que les cellules sont négatives pour le marqueur CD209 dendritique des cellules (DC-SIGN). Après le processus de différenciation des cellules restent fonctionnellement et métaboliquement active pendant environ 5-7 jours (figure 6), car il peut être visualisé par calcéine AM coloration et leur capacité à prendre des vésicules extracellulaires hangar de cellules tumorales. En outre, les cellules peuvent encore être activées, par exemple, comme illustré, pour la stimulation avec le lipopolysaccharide (LPS), ce qui conduit à l&#39;expression de plusieurs gènes pro-inflammatoires (figure 7). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figure 1: Aspect de la composition et PBMC- et monocytes-après couche double gradient de densité centrifugation. Photographie illustrant (A) de la bande de PBMC après le gradient de Ficoll et (D) la phase de monocytes après la centrifugation Percoll iso-osmotique. Colorations peut-Grünwald de préparations de cytospine de la (B, C) ​​fraction de PBMC et le reste (E, F) monocytes. Barre d&#39;échelle = 200 um en B et E, = 50 um dans C et F. <img alt="Figure 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figure 2: Rendement des monocytes et des macrophages. Comptages cellulaires représentatifs de monocytes et les macrophages isolés de 20 couche leucocytaire preparations. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3: Micrographies et des mesures de la taille des cellules de monocytes et de macrophages. D&#39;un microscope à contraste de phase de la suspension cellulaire monocytaire avant (A) et après (B) la différenciation des macrophages. Correspondants des histogrammes de la taille des cellules de monocytes (C) et (D) des macrophages. Barre d&#39;échelle = 100 um. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4 La morphologie et l&#39;organisation du cytosquelette de macrophages adhérents. Microscopie à contraste de phase de macrophages adhérents avant (A) et après (B) l&#39;élimination des non-adherent cellules. (C, D) phalloïdine-TRITC coloration de l&#39;actine filamenteuse dans adhérentes, des macrophages non stimulés. Barre d&#39;échelle = 100 um dans AC, 20 pm D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5 immunophénotype de macrophages différenciés. Analyse par cytométrie en flux de macrophages au bout de 6 jours de différenciation en Téflon FEP revêtues sacs de culture de cellules (en rouge). Les contrôles isotypiques correspondants sont affichés en gris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 6 Absorption de microvésicules de cellules tumorales par les macrophages. Micrographies des macrophages adhérents après une exposition à des microvésicules dérivées de cellules à fluorescence (rouge) PKH26 tumorales marquées. Les images sont superposées à l&#39;(A) fond clair correspondant ou (B) la coloration cytosolique avec la viabilité colorant calcéine AM. Les barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figure 7 La régulation positive de l&#39;IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, la MMP-2, MMP-7, MMP-MT1 et après stimument des macrophages avec du LPS (100 ng / ml) pour l&#39;expression de gènes 24 h. est mesurée par RT-PCR quantitative à partir des échantillons d&#39;ARN total (A) et normalisée sur HPRT1 et GNB2L1 expression. Les valeurs indiquées sont des modifications fois par rapport au témoin non traité (moyenne ± SD, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa et IL-6 induction sous stimulation par le LPS ont été en outre confirmée par ELISA (B) (moyenne ± SD, * p &lt;0,05).

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Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

69.3K vues.  University Medical Center Göttingen.  Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures. 

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Recherche

Immunologie et infection

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

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In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

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Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila membrane externe Vésicules: Isolement et analyse de leur potentiel pro-inflammatoire sur Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Imagerie en direct de l&#39;activité par Human Antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

Différenciation induite des cellules m Cell-like dans les monocouches entéroïdes ileal dérivées de cellules souches humaines

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

Isolement, transfection et culture des monocytes humains primaires

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...