This protocol follows any and all animal care and use guidelines and regulations set by IACUC at the University of Cincinnati. This work is funded by NIH/NINDS NS07722 and the Gardner Family Center for Parkinson&#8217;s Disease and Movement Disorders.

Toutes les étapes du protocole suivent le soin des animaux et utilisent des lignes directrices et des règlements établis par le IACUC de l&#39;Université de Cincinnati. 1. Considérations générales <ol><li> Si possible, l&#39;essai des souris au cours de leur phase active dans le cycle d&#39;obscurité. En règle générale, effectuer des tests sous un faible éclairage et au moins 1 heure dans le cycle d&#39;obscurité. Cependant, si les tests dans le cycle d&#39;obscurité n&#39;est pas possible, effectuer les trois tests pendant le cycle de lumière. Gardez à l&#39;esprit que les temps renifler peut diminuer lorsque les souris sont testés au cours de leur cycle de sommeil. NOTE: Bien que les tests peuvent être effectués pendant le cycle de sommeil des souris peuvent présenter moins d&#39;intérêt dans le culot enterré, blocs, ou cartouche parfumée. </li><li> Afin de réduire l&#39;effet de l&#39;extérieur signaux olfactifs, porter une paire de gants de base à tout moment de chaque essai, puis placez une paire de gants propres au cours de la paire de base pour chaque souris et chaque essai. En règle générale, en cas de doute, mis sur un ensemble de gants propres. Avoir une boîte de gants lireily disponibles, car ils seront changés fréquemment. NOTE: Nous utilisons des gants en nitrile pour toute manipulation des animaux. </li><li> Matériel de nettoyage et cages entre les sujets avec un désinfectant essais / agent de stérilisation est également une étape importante dans cette batterie de tests afin de réduire le risque de propagation de la maladie ainsi que de retirer les signaux olfactifs indésirables. </li></ol> 2. Pellet test Buried <ol><li> Au moins deux jours avant le test, enregistrer le poids de chaque souris et ensuite l&#39;alimentation de limiter à 90% du poids du corps. Avant les essais et pendant la restriction alimentaire, donner à chaque souris 1-2 morceaux de pastilles à utiliser lors de l&#39;essai (par exemple, un morceau de céréales sucrées). Ne sautez pas cette étape parce que les souris sont néophobique avec de la nourriture et peuvent ne pas rechercher le culot pendant le test si ils n&#39;ont pas mangé les boulettes auparavant. </li><li> Tous les jours de test, habituer les souris pendant 1 heure avant le test en plaçant leur cage dans la salle d&#39;examen sans bouteille d&#39;eau ou d&#39;alimentation ben. abritera dans leur cage avec juste un couvercle supérieur du filtre. </li><li> Au cours de l&#39;accoutumance, remplir une cage de la souris propre ~ 3 cm de haut avec des draps propres en s&#39;assurant que la literie est répartie uniformément dans la cage. Réglez une minuterie pour 5 min. </li><li> Après 1 heure d&#39;accoutumance, enterrer 1 sucrées céréales culot de 0,5 cm en dessous de la literie de sorte qu&#39;il n&#39;est pas visible. </li><li> Débranchez la souris de test de sa cage, le placer dans le centre de la cage de test, placez le couvercle supérieur du filtre sur la cage et lancer le chronomètre. </li><li> Arrêter le chronomètre lorsque la souris découvre le culot et commence à manger il. Noter le temps de découvrir le culot enterré. </li><li> Si la souris ne trouve pas le culot dans 5 minutes, mettre fin à l&#39;essai et noter un score de 300 secondes pour que la souris. Déplacez le culot vers le haut de la literie si la souris a accès à elle, et laissez la souris pour manger le culot. </li><li> Après le procès, retourner la souris pour sa cage. </li><li> Vider la literie de la cage de test et nettoyer la câge avec une solution de nettoyage de la chambre de l&#39;animal. </li><li> Répéter les étapes 2.4 à 2.9 pour chaque souris, et changer des gants avant et après chaque souris. </li><li> Après toutes les souris sont testés, leur donner juste assez de nourriture pour les maintenir à 90% du poids corporel. </li><li> Effectuer des tests sur 2-5 jours de la même manière que le jour de l&#39;épreuve 1 avec une exception; enterrer le culot dans un endroit différent dans la cage pour chaque essai. </li><li> Le jour de l&#39;essai 6, effectuer l&#39;essai de granules de surface. </li><li> Pour l&#39;essai de granules de surface, suivez la même procédure pour le jour de l&#39;essai 1, mais au lieu d&#39;enterrer le culot sous la literie placer sur le dessus de la literie. Noter l&#39;heure de la souris pour trouver et commencer à manger le culot. </li></ol> 3 Block Test <ol><li> Maison individuelle souris dans des cages propres et placer 5 blocs dans la cage (marqué AE), changer de gants avant la mise en place dans chaque cage. </li><li> Effectuer le test 24 heures plus tard. Déplacez la souris de test de la zone de test, retirez la bouteille d&#39;eau et d&#39;alimentation bin et placez all 5 pâtés de maisons de la cage avec une poignée de literie dans un sac en plastique marqué avec l&#39;identification de l&#39;animal. Placez le sac en plastique scellé sur le dessus de la maison de la cage de la souris. </li><li> Habituer les animaux dans leur cage sans la bouteille d&#39;eau, alimentation bin et les blocs pendant 1 heure avant le test. </li><li> Changer de gants entre chaque cage afin que les parfums ne sont pas échangées entre les animaux / blocs. </li><li> Aligner les cages à souris à côté de l&#39;autre sur une table avec au moins 10 cm entre chaque cage. Placer une caméra vidéo afin que le devant de la cage (pas le côté long de la cage) est bien en vue. </li><li> Réglez la minuterie pour 30 secondes et étiqueter une carte avec les détails importants d&#39;expérimentation (date, identification de la souris, essai, etc). Videotape l&#39;étiquette de 2-3 sec. </li><li> Supprimer les blocs AD dans le sac en plastique avec l&#39;identification de cette souris et les placer dans le milieu de la cage de sorte qu&#39;ils sont clairement visibles sur la caméra vidéo. Assurez-vous qu&#39;il est ~ 1 cm of espace entre chacun des blocs. Placez le haut du filtre de retour sur la cage. Lancez le retardateur et vidéo pendant 30 secondes. </li><li> Après 30 secondes, arrêtez l&#39;enregistrement et retirer les blocs de la cage et de les placer dans le sac en plastique. </li><li> Changer de gants et de passer ensuite à la prochaine souris, répétant la même procédure que pour le premier essai. Pour ce faire, pour un total de 6 essais pour chaque souris s&#39;assurer qu&#39;il ya un intervalle entre les essais de ~ 5 min. </li><li> Le 7 ème essai, suivez la même procédure pour les essais 1-6, sauf au lieu de placer le bloc D de la propre cage de la souris ajouter bloc E de la cage de l&#39;autre la souris pour que la souris est exposé à des blocs A, B, et C à partir de son propre cage de la maison et le bloc E de la cage de l&#39;autre la souris. Remarque dans le cahier de laboratoire dont le bloc E chaque souris est exposé et où alternent bloc E est placé dans la cage de chaque souris (par exemple, ABCE ou AEBC). Prenez bloc E d&#39;une souris du même sexe, mais pas à partir d&#39;un compagnon de cage d&#39;origine. Videotape pendant 30 sec. </li><li> Après les 7 essais, le retour des animaux à une nouvelle cage propre avec leurs compagnons de cage d&#39;origine. Blocs propres utilisés dans le test avec un détergent doux et de l&#39;eau et sécher à l&#39;air pour une utilisation dans des tests ultérieurs. </li></ol> 4. accoutumance / déshabituation <ol><li> Effectuer le test habituation / déshabituation d&#39;une manière similaire à l&#39;épreuve de bloc, mais au lieu d&#39;utiliser des blocs qui ont l&#39;odeur d&#39;une souris, utiliser des cartouches de tissus de maintien coton parfumé avec différentes paires d&#39;extraits. </li><li> Suivez les étapes 3.1 à 3.4 en utilisant une seule cartouche, des tissus non parfumé à la place des blocs. </li><li> Habituer souris dans la chambre d&#39;essai. </li><li> Préparez les cartouches de tissus parfumés dans une pièce séparée. Placer une petite boule de coton dans une cartouche propre, puis ajouter 5 ul d&#39;extrait (par exemple, l&#39;extrait d&#39;amande) dans le coton. Enclenchez le haut de la cartouche sur le coton et le placer dans une boîte dédiée ou le sac étiqueté avec ce parfum. </li><li> Faites la même procédure fou un deuxième parfum (par exemple, extrait d&#39;anis). Changer de gants entre la manipulation des parfums différents. Assurez-vous que la boule de coton est complètement enfermé dans la cartouche de tissu. NOTE: Exposé des fibres de la boule de coton peuvent provoquer l&#39;animal ont un intérêt dans la boule de coton à des fins de nidification plutôt que le parfum lui-même. </li><li> Ensuite, suivez les étapes 3.6 à 3.10 en utilisant une cartouche de tissu parfumé pour les six premiers essais, et la seconde cartouche de tissu parfumé pour le septième essai. </li></ol> 5 Analyse des cassettes vidéo <ol><li> Pour le bloc et les tests habituation / de déshabituation, ont un aveugle de l&#39;évaluateur de la condition expérimentale mesurer le temps passé en reniflant chaque bloc, avec le sniffing défini comme contact nasal à ce bloc. Si l&#39;on désire mesurer d&#39;autres comportements tels que le temps pour rapprocher le bloc selon l&#39;invention (E) pendant l&#39;essai 7 et de l&#39;activité totale (nombre de mouvements effectués le long de la longueur et de la largeur de la cage d&#39;accueil) au cours de chaque essai. Note le temps passé en reniflant unetemps d approcher de la vidéo à l&#39;aide d&#39;un chronomètre. </li><li> De même, pour le test habituation / déshabituation, ont un aveugle de l&#39;évaluateur de la condition expérimentale mesurer le temps passé en reniflant la cartouche, le temps d&#39;aborder la cartouche, et l&#39;activité locomotrice. </li></ol> 6. Statistiques <ol><li> Analyser le test de granulés enterrée en utilisant des statistiques non paramétriques parce que le temps de latence pour trouver le culot scores ont tendance à montrer l&#39;hétérogénéité de la variance. La moyenne du temps de latence pour localiser le culot au fil des jours 3-5, puis de comparer entre les groupes de souris en utilisant un test U de Mann-Whitney. De même, pour la partie de pastille de surface de l&#39;essai, l&#39;analyse de latence pour trouver la pastille en utilisant un test U de Mann-Whitney pour comparer les génotypes. </li><li> Pour le test de bloc, d&#39;analyser les données de première instance 7 (introduction du bloc de roman parfumé). En règle générale, employer des analyses non paramétriques pour tenir compte de l&#39;hétérogénéité de la variance. Pour analyser les différences de temps passé renifler ee roman bloc ainsi que le temps d&#39;aborder les blocs pour différents groupes expérimentaux, utilisez le test U de Mann-Whitney. Utilisez le test des rangs signés de Wilcoxon pour comparer le temps passé renifler le roman bloc au temps passé en reniflant les blocs familiers. </li><li> Pour le test habituation / déshabituation, conduite analyses paramétriques sur les essais 1, 6 et 7, similaire à des études antérieures 20. Si les souris présentent peu ou pas de renifler, utiliser des analyses non paramétriques. </li></ol>

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We have no conflicts of interest.

Chacun des essais décrits dans cette étude de mesurer différents aspects de la fonction olfactive chez la souris. Le test de granulés enterrée mesure l&#39;aspect de la motivation de la nourriture de l&#39;olfaction, de tester la capacité de faim (restriction alimentaire, pas privés de nourriture) souris pour détecter un morceau savoureux de céréales sucrées enterré sous des matelas. Le test de bloc mesure plus de l&#39;aspect social de la fonction olfactive, tester la capacité des souris à la distinction entre leur propre parfum et celle d&#39;un congénère. Le test habituation / déshabituation évalue la capacité de la souris pour discriminer entre senteurs inoffensifs connues et nouvelles,. Utilisation de plusieurs essais est important lors de la caractérisation d&#39;un nouveau modèle, car des anomalies dans la motivation ou la peur alimentaire pourraient contribuer aux différences observées chez les souris mutantes par rapport aux témoins. Par exemple, si seul le test de bloc est effectuée et a diminué renifler du bloc qui a l&#39;odeur d&#39;une autre souris est observé, il est difficile de savoir si il ya une Olfactdéficit oire ou une réaction de peur accrue de la même espèce qui peuvent conduire à l&#39;évitement de ce bloc. Lorsque plusieurs tests sont effectués et les déficits sont observés dans tous les essais, il soutient fermement une interprétation de déficience olfactive. Cependant, si des différences sont observées dans un seul test, mais pas les autres, alors il peut y avoir une déficience olfactive plus subtile, mais il sera essentiel pour écarter d&#39;autres explications (c&#39;est à dire, la peur accrue ou réduite motivation alimentaire). D&#39;autres facteurs importants à garder à l&#39;esprit lors de l&#39;essai des souris de la fonction olfactive comprennent la souche de fond et le sexe des souris. Différentes souches de fond génétique (c&#39;est-à-C57BL / 6, DBA, etc) peuvent avoir des effets profonds sur le comportement de la souris par conséquent, il est recommandé d&#39;adapter chaque protocole chez la souris de type sauvage de la même origine avant d&#39;effectuer l&#39;ensemble de l&#39;expérience. Il est également recommandé que les souris mâles et femelles être testés séparément les uns des autres parce que le système olfactif masculin est élevément sensible aux femelles en oestrus et la détection olfactive d&#39;une femelle en oestrus pourrait interférer avec les performances dans les trois tests. Certaines mesures sont absolument essentielles à suivre pour tester l&#39;olfaction chez la souris. Il est important d&#39;être conscient des odeurs de l&#39;expérimentateur est l&#39;introduction des animaux. Le port de gants pour les procédures est essentielle et changement fréquent de gants entre les animaux est nécessaire. Il est toujours une bonne pratique pour l&#39;expérimentateur ne pas porter de Cologne ou de parfum sur jours d&#39;essais de l&#39;olfaction. Alors que certaines parties de la procédure sont rigides, il ya d&#39;autres parties qui peuvent être modifiés et adaptés sans réduire la validité ou de la sensibilité du test. Par exemple, le nombre d&#39;essais d&#39;habituation peut être augmentée ou diminuée en fonction de la souche de souris à l&#39;essai et à quelle vitesse ils s&#39;habituent aux stimuli. La principale limite de ces tests est qu&#39;ils sont tous animés par une certaine forme de motivation, que ce soit alimentaire ou sociale, ce quiil est difficile d&#39;éliminer complètement les anomalies dans la motivation comme une explication quand une altération de la réponse observée. Ceci peut être minimisé par l&#39;analyse de paramètres supplémentaires, comme l&#39;activité au cours de l&#39;essai et le temps d&#39;approcher stimuli. Une fois maîtrisé, les tests peuvent être facilement utilisés en examinant le phénotype de modèles de souris de nouveaux des maladies neurodégénératives. En outre, les essais qui ont la plus forte puissance peuvent être inclus dans les études précliniques essais thérapeutiques potentiels (pour un exemple, voir réf. 25).

Dysfonction olfactive est lié à un certain nombre de maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (PD), la maladie d&#39;Alzheimer et la maladie de Huntington 1. En PD, troubles olfactifs incluent des déficits d&#39;identification des odeurs, de la détection et de la discrimination et se retrouvent dans un maximum de 70-95% des patients 2-5. Ces déficits peuvent précéder les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson cardinal jusqu&#39;à 4 ans, ce qui indique que la dysfonction olfactive peut signaler les premiers stades de la MP 6-10. L&#39;apparition précoce des déficits olfactifs dans la MP a conduit à un vif intérêt pour la dysfonction olfactive et les mécanismes sous-jacents impliqués. Dans les études précliniques chez les rongeurs, la dysfonction olfactive pourrait être une mesure de résultat sensible pour prédire le potentiel thérapeutique de nouvelles stratégies thérapeutiques. De nombreux tests ont été conçus et largement utilisée pour caractériser les déficiences sensori-motrices dans des modèles rongeurs de PD et de test le potentiel thérapeutique de nouveaux traitements de 11 à 15. Même si les déficits olfactifs sont bien documentées dans la MP, la fonction olfactive n&#39;a pas été systématiquement mesurée dans de nombreux modèles. Ce point de vue est en train de changer mais avec la découverte de formes génétiques de la maladie de Parkinson et la notion plus acceptée que PD est une maladie systémique qui touche plus que juste la fonction sensori-motrice. Actuellement, il existe de nombreuses études sur des modèles génétiques de souris de PD et d&#39;autres maladies neurodégénératives qui incluent maintenant l&#39;analyse de l&#39;olfaction dans la caractérisation 16-24. Compte tenu de l&#39;intérêt croissant de la dysfonction olfactive dans les maladies neurodégénératives, nous avons cherché à réunir une batterie de tests olfactifs qui peuvent être utilisés pour caractériser de nouveaux modèles de neurodégénérescence ainsi que tests potentiels traitements modificateurs de la maladie dans les études précliniques. Les essais décrits dans la présente étude ont été utilisés à la fois dans la caractérisation et études précliniques 18,25. Les essais highlighted dans cette étude se sont avérés être sensibles à la détection de dysfonctionnement olfactif dans un modèle de souris surexprimant fréquemment utilisé alpha-synucléine de la maladie de Parkinson 18. Ils comprennent le test enterré à granulés 26,27, une version adaptée du test de bloc 23,24,28,29, et le test habituation / déshabituation 30. Il est important de noter qu&#39;il existe plusieurs adaptations des essais décrits dans cette étude qui sont des mesures sensibles de la fonction olfactive chez la souris, ceux mis en évidence dans cette étude sont les tests de notre laboratoire a le plus d&#39;expérience et utilise régulièrement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Cap&#39;n Crunch</td>
			<td style="width:88px;">Quaker Oats</td>
			<td align="right" style="width:88px;">3E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Wooden Blocks</td>
			<td style="width:88px;">Lara&#8217;s Crafts</td>
			<td align="right" style="width:88px;">10144</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="379" rowspan="6" style="height:379px;width:88px;">Flavor Extracts</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;">Kroger</td>
			<td style="width:88px;">Almond: 011110664716</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Anise: 011110615619</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Banana: 011110669919</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Coconut: 011110669889</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Lemon: 011110669957</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:88px;">Orange: 0011110669964</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="59" rowspan="2" style="height:59px;width:88px;">Tissue Cartridges</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Z672122-500EA</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Manufactured by Simport no: M490-2</td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Cotton Balls</td>
			<td style="width:88px;">Kroger</td>
			<td align="right" style="width:88px;">1.1111E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Mouse Cages</td>
			<td style="width:88px;">Ancare</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">19 x 29 x 12.7 cm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Camcorder</td>
			<td style="width:88px;">Sony</td>
			<td style="width:88px;">&#160;HDR-HC9</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">MiniDV Tapes</td>
			<td style="width:88px;">Sony DVC premium</td>
			<td align="right" style="width:88px;">2.7243E+10</td>
			<td style="width:88px;">60 minute long play&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Les granulés, bloc, et des tests habituation / de déshabituation enterrés sont tous des évaluations très avantageuses de l&#39;olfaction chez la souris. Grâce à ces tests, nous avons constaté des changements importants dans l&#39;olfaction dans les modèles de souris génétique multiples de la maladie de Parkinson, y compris l&#39;alpha-synucléine surexprimant (Thy1-ASYN) 18 et souris knock-out Atp13a2. Les deux souris knock-out THY1-ASYN et Atp13a2 prennent plus de temps pour trouver le culot enterré que les témoins 18. Figures 1-3 montrent les données recueillies à partir de souris de type sauvage et Atp13a2 finale. Dans l&#39;essai de culot enterré, des souris knock-out Atp13a2 montrent une augmentation de la latence pour trouver la pastille enterré par rapport à des souris témoins de type sauvage (figure 1). Dans le test de bloc à la fois de type sauvage et des souris knockout Atp13a2 renifler le bloc de roman de la cage de l&#39;autre la souris par rapport à des blocs de leur propre cage (figure 2). Chez les souris de type sauvage de test habituation / déshabituation de montrer l&#39;accoutumance à un odeur et<html> puis a augmenté renifler quand un roman odeur est introduit (Figure 3). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: Buried pastille test. Latence pour trouver le culot dans de type sauvage (n = 10) et Atp13a2 KO (n = 14) à 20-27 m de l&#39;âge. * P &lt;0,05, Mann-Whitney U. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: test de bloc Temps renifler le bloc de roman (E) dans le test de bloc de type sauvage (n = 10) et Atp13a2 KO (n = 12) des souris femelles à 20 -. 27m de l&#39;âge. ΔΔ représente p &lt;0,01 par rapport à des blocs A, B et C du même génotype. Mann-Whitney U. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51804 / 51804fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure de test 3 habituation / de désaccoutumance. Temps renifler une cartouche parfumée chez les souris de type sauvage moyenne (9 m de l&#39;âge, n = 7) sur 6 essais et la mise en place d&#39;une cartouche avec un nouveau parfum à l&#39;essai 7.

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Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Les tests olfactifs pour les modèles murins de maladies neurodégénératives

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

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21.8K vues.  University of Cincinnati. Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Vidéo: Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

Les modèles murins de la leucomalacie périventriculaire

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Recherche

Neurosciences

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptic Modulation de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Évaluation de la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique par perfusion intraveineuse d’albumine marquée FITC dans un modèle murin de la maladie neurodégénérative

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

In Vivo Électrophysiologique mesure du potentiel d’Action musculaire composé de membres antérieurs dans des modèles murins de la dégénérescence des motoneurones

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...