Nous remercions Leo Pallanck pour les stocks de mouche, Christine Sommers pour l&#39;assistance technique et Gerasimos P. Sykiotis pour des discussions utiles. Ce travail a été financé par le NIH formation subvention T32CA009363 de MCB

1. Sursaut induite Assay géotaxie négative <ol><li> Sélectionnez mouches du génotype désiré, séparez-les par genre, au hasard de les regrouper dans des cohortes de 20-30 animaux et retournez-les dans de nouveaux flacons de nourriture tous les 2-3 jours; essai, chaque groupe de mouches (c. cohortes d&#39;âge comparable, une cohorte / génotype) au moins une fois par semaine. </li><li> Trente minutes avant le test de géotaxie négatif, anesthésier les mouches avec du CO 2 et de les placer dans des tubes en plastique transparent pré-étiquetés faites avec deux flacons vides de nourriture (voir le tableau des matériaux) réunis à leurs ouvertures avec du ruban adhésif transparent (dimensions de la chambre: 19 cm x 2,85 cm). Dans nos tests, nous utilisons habituellement 25 mouches / tube. Remarque. Le temps de récupération de l&#39;anesthésie peut varier de quelques minutes à plusieurs heures (par exemple O / N) et doit être optimisé pour les génotypes spécifiques testés. </li><li> Marquer différentes hauteurs (de 1 à 20 cm) sur un morceau de papier buvard et la bande du papier sur une surfac verticale, perpendiculaire à la table. </li><li> Placer les tubes devant le papier: les tubes doivent être tous alignés et aussi près que possible du papier pour permettre une mesure précise de la hauteur. </li><li> Placez l&#39;appareil photo numérique (voir l &#39;«équipement spécial» Table) en face des tubes, à une distance de 20-30 cm du papier, sur un support (par exemple, une boîte d&#39;embouts de pipettes), sélectionnez l&#39;option &quot;film&quot; et commencer enregistrement, à ce moment vous devriez également commencer une minuterie pour garder une trace du temps entre essais consécutifs. </li><li> Laisser les mouches pour recueillir au bas du tube en appuyant sur ​​le tube de quelques secondes (par exemple 10 s). Cette étape doit être effectuée régulièrement (c. même durée, même force, même opérateur) pendant toute l&#39;expérience. </li><li> Les mouvements du disque vole avec l&#39;appareil photo numérique pendant 10 secondes. </li><li> Répétez les étapes 1.5-1.7 quatorze fois à intervalles d&#39;une minute. </li><li> Analyser les données: <ol type="a"><li> Comptez le nombre de mouches qui sont au-dessus de la2 cm marque après 10 secondes par inspection visuelle des vidéos enregistrées. Remarque: Dans nos conditions de test de comportement géotaxie négatif des mouches n&#39;a pas duré au-delà des 10 premières secondes après la surprenante (c.-à-mouches commencé à se déplacer dans toutes les directions 10 sec après les effrayer). La distance minimale a augmenté de mouches de contrôle (c. âgé de 1 semaine mouches exprimant le conducteur THGal4, voir la légende de la figure 1) dans ce laps de temps était de 2 cm. Ainsi, nous avons utilisé la marque de 2 cm comme référence pour analyser les activités d&#39;escalade de mouches de différents âges et les génotypes 10 sec après le début du comportement. Ces paramètres peuvent être adaptés de tenir compte des différences dans le comportement des mouches testés (en raison par exemple de différentes origines génétiques ou des conditions de laboratoire). Notez que dans nos conditions de test, tous les génotypes testés effectué pire ou même les mouches du génotype de la commande. </li><li> Prendre la moyenne des résultats de la quinzaineessais. </li><li> Moyenne express en tant que pourcentage du nombre total de mouches dans le tube (= activité escalade%), le nombre de répétitions (N) est donnée par le nombre de cohortes indépendantes testées pour chaque génotype </li><li> Évaluer la signification statistique entre les différents génotypes au fil du temps. Ceci peut être accompli avec le test t de Student (lorsque l&#39;on compare deux génotypes) ou une analyse ANOVA 2-way suivie par Bonferroni test post-hoc (lorsque vous effectuez des comparaisons multiples) en utilisant des logiciels commerciaux tels que GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA). </li></ol></li></ol> Remarque Nous réalisons tous nos tests en même temps de la journée, à la température ambiante et dans les mêmes conditions d&#39;éclairage. Garder les mouches dans un environnement de cycle lumière / obscurité de 12 heures est conseillé de contrôler l&#39;effet des rythmes circadiens sur le comportement locomoteur des mouches. 2. Immunofluorescence de la tyrosine hydroxylaseDosage des Monts du cerveau entier Solutions et tampons Solution de fixation: 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS) Tampon de lavage: 0,1% de Triton X-100 dans du PBS Le tampon de blocage: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 et de 0,5% de BSA Milieu de montage: Mowiol-Dabco (voir protocole décrit dans Harlow E, D. Lane, Antibodies-A manuel de laboratoire, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988)) Procédure <ol><li> Mettez mouches dans un plat de dissection rempli avec 70% EtOH pendant environ 1 min pour éliminer la cire cuticule. </li><li> Transfert vole vers un autre plat de dissection rempli de PBS glacé. </li><li> Disséquer le cerveau: <ol type="a"><li> Placez la volée avec le haut de la face ventrale (en option: ailes et les pattes supprimer). </li><li> Tirez la tête loin du corps: utiliser un ensemble de forceps àtenir sur le corps et un autre pour s&#39;accrocher à la cuticule sous l&#39;oeil pour éviter d&#39;endommager le cerveau </li><li> Retirez la trompe. </li><li> Tenir à la cuticule de la tête sur des côtés opposés de la fente reste ouvert après avoir enlevé la trompe et tirer dans des directions opposées jusqu&#39;à ce que le cerveau est prélevé à partir de la capsule de la tête. </li><li> Retirez tous les cuticule du cerveau. </li><li> Retirez tout le tissu trachéal rempli d&#39;air, ce qui permettra d&#39;éviter le cerveau de flotter pendant les étapes d&#39;incubation suivantes. </li></ol></li><li> Couper quelques millimètres de la pointe d&#39;une pointe de pipette P-200 et s&#39;équilibrer avec une solution à 0,1% de Triton X-100/PBS </li><li> Avec la pointe P-200 pipette préparé, transférer le cerveau à un tube Eppendorf 0,5 ml remplie avec 0,5 ml de PFA 4% / PBS et garder sur la glace jusqu&#39;à ce que la dissection est terminée. </li><li> Fixer les cerveaux à température ambiante pendant 20 min: appliquer une légère rotation en mettant les tubes Eppendorf sur une grille et placer la grille sur un nutator. </li><li> Retirez le fixateurl&#39;aide d&#39;une micro pipette P-1000, ajoutez 0,5 ml de 0,1% X-100/PBS Triton, mélanger par inversion et laisser incuber pendant 1 min; répéter cette étape de lavage une fois. </li><li> Retirez le tampon de la deuxième lavage, ajouter 0,5 ml de 0,1% X-100/PBS Triton et laisser incuber à température ambiante pendant 20 min; répéter cette étape deux fois. </li><li> Retirez le tampon de lavage et de laisser les cerveaux incuber dans un tampon de blocage (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 et de 0,5% de BSA) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Incuber les cerveaux avec une dilution 1:100 d&#39;anticorps anti-TH (voir le &quot;Tableau des réactifs spécifiques») dans une solution de blocage, pendant deux jours, à 4 ° C, avec une légère rotation (voir l&#39;étape 2.6.). </li><li> Répétez les étapes de lavage 2.7. et 2.8 .. </li><li> Equilibrer les cerveaux avec une dilution de 1:200 d&#39;une solution de blocage antibodyin secondaire, pendant deux jours, à 4 ° C, avec une légère rotation. </li><li> Répétez les étapes de lavage 2.7. et 2.8 .. </li><li> Préparer les lames de fixation comme illustré à la figure 2A: <ol type="a"><li> Add 2 x 25 gouttes ul de milieu de montage à un couvercle en verre (24 x 60 mm, no. 1.5). </li><li> Placez deux verres de couverture (taille 18 x 18 mm, no. 2) sur le support de montage en laissant un espace au milieu de la diapositive et laisser sécher. </li></ol> Remarque. Vérifiez le porte-échantillon sur la scène de votre microscope confocal. Vous pouvez faire le couvercle en verre de la même taille d&#39;un x 75 mm diapositive 25 en attachant un x 1,5 mm couvercle en verre 22 22 à l&#39;une des extrémités (utiliser le vernis à ongles et bande). </li><li> Retirer le tampon de lavage, ajouter 50 ul de milieu de montage et permettent le cerveau de s&#39;équilibrer avec elle par aspiration et refoulement. </li><li> En utilisant une coupe P-200 pointe de pipette (voir l&#39;étape 2.4) transférer le cerveau à la diapositive dans l&#39;espace entre les deux lamelles et les couvrir avec une lamelle pas. 1.5 (voir Figure 2A; d&#39;orienter le cerveau sur la diapositive voir 7). Remarque: les échantillons sont montés entre deux verres de couverture pour permettre la visualisation à la fois la partie antérieure et la posterieur latéral du cerveau. </li><li> Remplir tout l&#39;espace entre les lamelles avec les médias de montage; pipette d&#39;un coin à enlever tout l&#39;air; laisser sécher et le joint avec le vernis à ongles. </li><li> Pour évaluer le nombre de neurones dopaminergiques dans une grappe spécifique acquérir une série de sections optiques le long de l&#39;axe z avec un 1,0 um étape de taille à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal (pour l&#39;identification anatomique des grappes dopaminergique dans le cerveau adulte drosophile voir 7). </li></ol>

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

Nous déclarons que nous n&#39;avons pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Les tests décrits ici de fournir une approche utile pour étudier le rôle des gènes spécifiques, les voies de signalisation ou de petits composés dans l&#39;entretien des neurones dopaminergiques dans le vieillissement ainsi que dans différents fonds génétiques de maladies liées (revue en 5). Le comportement de géotaxie négatif sursaut induite de la drosophile a été largement utilisé comme fonctionnel lecture de toutes les fonctionnalités de neurones dopami...

La spécificité des essais décrits ici repose sur l&#39;utilisation d&#39;une ligne à mouche Gal4 qui exploite les séquences régulatrices du gène de la tyrosine hydroxylase pour obtenir une expression spécifique dans les neurones dopaminergiques 3. Tyrosine hydroxylase catalyse la première et étape limitante dans la synthèse de la dopamine. immunoréactivité de TH dans les recouvrements du cerveau des mouches adultes avec celle de la dopamine, rendant TH un bon candidat pour identifier les neurones dopaminergiques in vivo (voir par exemple 6). En outre, le profil d&#39;expression de THGal4 est plus spécifique que celle des autres Gal4 lignes telles que DdcGal4, qui contient des séquences régulatrices du gène de la dopa décarboxylase et conduit l&#39;expression transgénique non seulement dans les neurones dopaminergiques, mais aussi dans les neurones sérotoninergiques et sous-ensembles de cellules gliales 3 . Feany et Bender (2000) ont observé que la première expression pan-neuronal du gène α-synucléine humaine PD-lié accélère la perte progressive de la stacomportement de géotaxie négatif rtle induite chez la drosophile. Nous avons observé des résultats similaires en utilisant spécifique de la ligne DA-neurone THGal4 à conduire le ExpressionOf une α-synucléine transgène 10 et utilisé cette fonction de lecture d&#39;étudier le rôle neuroprotecteur de la voie Nrf2 dans ce Drosophila modèle de PD 14. Le dosage spécifique décrit ici est adapté de 2 et 3. Le cerveau Drosophila contient plus de 100 neurones dopaminergiques, disposés dans au moins 5 groupes différents (PPL1, pPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) qui peuvent être visualisées dans les montagnes entières du cerveau par microscopie confocale (voir par exemple 11 et 7). Il est encore controversée si oui ou non le nombre de neurones dopaminergiques dans le cerveau diminue avec la drosophile âge de 9 ans, 11; toutefois, la neurodégénérescence liée à l&#39;âge est observée chez les mouches où les gènes PD-linked ont été mutés / surexprimé pour modéliser les maladies humaines5. L&#39;expression de l&#39;α-synucléine humaine dans les neurones DA a un tel effet et, par conséquent, a été utilisé comme un modèle pour la maladie de Parkinson. Nous décrivons ici un essai de neurones dopaminergiques dans le cerveau entier comptent monte utilisant TH comme un marqueur de cellule. Ce test a été adapté à partir de 13 et 10 ans.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

Drosophila melanogaster est un organisme modèle précieux pour étudier le vieillissement et les processus pathologiques dégénératives du système nerveux. Les avantages de la mouche comme un système expérimental comprennent sa puissance de sa génétique, courte durée de vie et la possibilité d&#39;observer et d&#39;analyser quantitativement des comportements complexes. L&#39;expression des gènes liés à la maladie dans les populations neuronales spécifiques du cerveau chez la drosophile, peut être utilisé pour modéliser les maladies neurodégénératives humaines telles que la maladie de Parkinson et la maladie d&#39;Alzheimer 5. Neurones dopaminergiques (DA) sont parmi les populations les plus vulnérables de neurones dans le cerveau humain vieillissement. Dans la maladie de Parkinson (PD), le trouble le plus fréquent neurodégénératif du mouvement, la perte accélérée des neurones DA entraîne une diminution progressive et irréversible de la fonction locomotrice. Outre l&#39;âge et l&#39;exposition à des toxines environnementales, la perte de neurones DA est exacerbée par des mutations spécifiques dans le codageou régions promotrices de plusieurs gènes. L&#39;identification de ces allèles PD-associés fournit la base expérimentale pour l&#39;utilisation de la drosophile comme modèle pour étudier la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques in vivo. Par exemple, l&#39;expression du gène α-synucléine humaine PD-lié chez la drosophile neurones DA reprend certaines caractéristiques de la maladie chez l&#39;homme, par exemple la perte progressive des neurones dopaminergiques et déclin de la fonction locomotrice 2. En conséquence, ce modèle a été utilisé avec succès pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans PD 8. Nous décrivons ici deux essais qui ont été couramment utilisées pour étudier la neurodégénérescence liée à l&#39;âge des neurones dopaminergiques chez la drosophile: un essai d&#39;escalade basée sur la réponse de géotaxie négatif sursaut induite et immunomarquage de la tyrosine hydroxylase de tout le cerveau adulte monte sur surveiller le nombre de DA neurones à des âges différents. Dans les deux cas, l&#39;expression in vivo du SAMU transgenes spécifiquement dans les neurones dopaminergiques peuvent être obtenus en utilisant une tyrosine hydroxylase (TH) promoteur Gal4 ligne de conducteur 3, 10.

Nous avons utilisé les tests décrits ici d&#39;étudier le rôle de la voie Nrf2 protection des contraintes dans un modèle drosophile de PD 14. Ce modèle repose sur l&#39;expression du gène α-synucléine humaine dans les neurones DA l&#39;aide d&#39;un TH Gal4 conducteur 2, 10. La figure 1 montre un résultat représentatif d&#39;un sursaut géotaxie négatifs induits (escalade) analyse dans les mouches mâles exprimant différents transg...

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Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Nous décrivons ici deux essais qui ont été mis en place pour étudier la neurodégénérescence liée à l&#39;âge des neurones dopaminergiques (DA) dans<em&gt; Drosophila</em&gt;: L&#39;escalade / test de géotaxie négatif sursaut induite qui permet d&#39;étudier les effets fonctionnels de neurones DA dégénérescence et l&#39;immunomarquage de la tyrosine hydroxylase qui est utilisé pour identifier et compter les neurones dopaminergiques dans les montagnes entières du cerveau.

Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

19.0K vues.  University of Rochester Medical Center. Nous décrivons ici deux essais qui ont été mis en place pour étudier la neurodégénérescence liée à l'âge des neurones dopaminergiques (DA) dans Drosophila: L'escalade / test de géotaxie négatif sursaut induite qui permet d'étudier les effets fonctionnels de neurones DA dégénérescence et l'immunomarquage de la tyrosine hydroxylase qui est utilisé pour identifier et compter les neurones dopaminergiques dans les montagnes enti?...

Vidéo: Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection et de la culture de la souris dopaminergique et des explants striataux en trois dimensions dosages matrice de collagène

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Recherche

Neurosciences

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Détection de la palmitoylation des protéines dans les neurones de l&#39;hippocampe en culture par immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Les tests olfactifs pour les modèles murins de maladies neurodégénératives

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Analyse quantitative des défauts d&#39;escalade dans un modèle drosophile de maladies neurodégénératives

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Évaluation de la neurogenèse primaire en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons Utilisation de immunocoloration

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptic Modulation de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.