L’objectif global de cette procédure est d’observer l’impact du gène SOX5 sur la complexité des neurones d’arborisation dendritiques pendant le développement neuronal à Drosophila. Cette méthode peut aider à étudier la morphogenèse des neuro-dendrites, et la fonction génétique dans le développement du système nerveux, pour mieux comprendre les gènes des maladies neurodégénératives. En fin de compte, cette technique fournit une analyse quantitative de la complexité des dendrites, qui peut être utilisé dans de nombreux types différents de neuro-dendrites.
Les implications de cette technique s’étendent au mécanisme génétique de la maladie neurodégénérative, parce que la mutation détient la clé pour comprendre la fonction de gène. Croix de mise en place de UAS-GFP;ppk-GAL4 avec les mouches de souche UAS-Sox102F-RNAi ou contrôles W118. Culture des mouches dans des conditions standard à 25 degrés Celsius.
En cinq à six jours environ, utilisez des forceps pour recueillir soigneusement les larves du troisième stade pour la dissection. Placez une larve dans un plat de dissection fait de base d’élastomer de silicium, et une boîte de Pétri de culture tissulaire. Ensuite, placez le plat sous le microscope de dissection.
Maintenant épingler la queue de la larve pour exposer la ligne médiane. Puis épinglez les crochets de bouche de larve ainsi le côté dorsal de la larve est vers le haut. Maintenant, ajoutez 200 microlitres de PBS au plat pour immerger la larve dans la solution.
Ensuite, coupez la queue et la bouche de larve avec de petites incisions. Puis couper la larve ouverte le long de la ligne médiane dorsale et entre les deux trachées, allant de caudal à rostral. Ensuite, placez une épingle à chacun des quatre coins du corps de sorte que le corps se trouve à plat.
Maintenant fixer la paroi du corps de larve en quatre pour cent PFA pendant 25 minutes à température ambiante. Lavez ensuite la larve avec du PBS trois fois pendant cinq minutes par lavage. Après les lavages, retirer les broches et transférer le tissu sur une lame de verre.
Puis immerger le tissu dans un milieu de montage antifade, et le monter avec un glissement de couverture. Laisser sécher le tissu monté pendant une heure avant de sceller sur le bordereau de couverture avec du vernis à ongles. Stockez ces diapositives dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.
Capturez des images de la série Z à l’aide d’un microscope confocal à l’aide d’un objectif 20X. Tout d’abord, réglez la portée des z-steps pour inclure tous les neurones DA dans la paroi du corps de larve, et réglez la taille de l’étape à un demi-micromètre. Ensuite, stockez les images sous forme de fichiers TIF ou ND2 pour le traitement.
Ensuite, évaluez le nombre et la morphologie des dendrites sur les neurones DA. Commencez par évaluer leurs longueurs. Tout d’abord, dans Fiji ImageJ, diviser les images en canaux distincts si nécessaire.
Seul le canal GFP doit être évalué. Ensuite, faites une projection z. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez l’intensité maximale pour le type de projection, et choisissez les tranches de démarrage et d’arrêt.
Cliquez ensuite sur OK pour produire une image de projection z avec des projections claires de dendrite. Maintenant, tracez les neurites à l’aide de l’outil plug-in. Tout d’abord, aller au soma du neurone d’intérêt et cliquez là où un dendrite émerge du corps cellulaire.
Cliquez ensuite à la pointe de ce dendrite. Si la ligne bleue qui relie les deux points s’étend sur toute la longueur du neurite, appuyez sur Y pour oui. Ensuite, si cette ligne s’adapte à la trajectoire complète du neurite, cliquez sur le chemin complet.
Si la ligne ne correspond pas au chemin, cliquez sur les points plus loin le long de ce neurite pour plier le chemin en plusieurs segments de ligne qui s’adapteront à la longueur du neurite. Ensuite, cliquez sur le chemin complet et procéder à marquer le chemin pour le prochain neurite. Après avoir complété tous les chemins de traçage, sélectionnez l’option Analyse, Chemins de mesure pour exporter les chemins vers un fichier CSV.
Utilisez ces données pour calculer et la valeur moyenne des longueurs de chemin pour l’analyse. Ensuite, calculez la surface du neurone. Tout d’abord, sélectionnez l’outil de dessin à main libre de la fenêtre Fiji ImageJ.
Ensuite, connectez les points finaux du neurone d’intérêt. Ensuite, sélectionnez l’option Mesure à partir de la fenêtre Analyser. Le résultat apparaît dans une nouvelle boîte avec la valeur de la zone sélectionnée.
Copiez cette valeur au logiciel d’analyse de données. Enfin, calculez le nombre total de branches à l’aide du plugin Analyze Skeletonized Paths. Les dendrites des neurones DA ont été étiquetés par GFP co-surexprimant dans leurs tonnelles de soma et dendrite pour l’analyse d’imagerie de florescence de GFP.
La morphologie des dendrites a été photographiée à l’aide d’un microscope confocal inversé. Les dendrites des neurones de DA ont été tracés comme décrit. Le fichier a été utilisé pour estimer la longueur du dendrite.
Le silence de Sox102F dans les neurones DA dans la troisième larve instar a conduit à une réduction significative du nombre total de dendrites avec environ la moitié de la longueur de la branche et avec une structure plus simple, montrant seulement la moitié du nombre de branches. Logiquement, cela a conduit à une réduction de la surface des tonnelles. Ce protocole fournit une méthode rapide pour évaluer le développement des neurones sensoriels DA.
Tout en essayant cette procédure, assurez-vous de prendre un grand nombre d’images de chaque groupe de neurones DA pour obtenir une bonne couverture. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’analyse de dendrite peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions sur le développement de dendrite. Depuis son développement, cette technique a aidé des chercheurs dans le domaine des neurosciences à faire des inférences sur les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer à l’aide de systèmes modèles.
