L’imagerie calcique est une technique extrêmement utile pour étudier la variété de rôles que les ions calcium jouent dans les neurones en fonctionnement. Les ions calcium créent une multitude de signaux intracellulaires qui contrôlent les fonctions clés, comme la libération de neurotransmetteurs par les vésicules synaptiques. Les méthodes d’imagerie calcique permettent des mesures directes du flux dynamique de calcium à l’intérieur des neurones et des tissus neuronaux. Cette vidéo fournit une vue d’ensemble sur la maniere dont les colorants indicateurs de calcium fonctionnent, comment une expérience d’imagerie calcique est réalisée et présente enfin quelques utilisations de cette technique.
Tout d’abord, passons en revue les principes biochimiques des colorants indicateurs de calcium.
Les colorants indicateurs de calcium sont des molécules chélateur modifiées, comme le Fura-2, qui sont composées de deux composants principaux. Le premier est le site chélateur (le ligand) qui lie le calcium de manière sélective. Le second est un site fluorescent qui émet une lumière de longueur d’onde spécifique lorsqu’il est illuminé par une longueur d’onde excitante d’un ultraviolet. La liaison du calcium au colorant altère ses propriétés fluorescentes, ce qui fournit un moyen de quantifier les changements de concentration en calcium, qui est représenté ici par la différence en intensité fluorescente émise par ce neurone à deux longueurs d’onde d’excitation différentes.
La plupart des colorants indicateurs de calcium sont modifiés en aval pour leur permettre de traverser rapidement la membrane cellulaire et sont soit introduits dans le bain de solution avec les neurones, soit injectés dans les tissus du cerveau pour les études de l’animal entier.
Certains colorants ont des propriétés d’excitation doubles ou d’émission doubles selon que le calcium est lié ou non. Prenez, par exemple, le colorant Fura-2, qui a une longueur d’onde d’excitation différente si le calcium est lié ou non. En prenant le rapport de l’intensité de l’émission aux deux longueurs d’onde d’excitation, une estimation bien plus précise de la concentration en calcium peut être faite.
Les colorants à émission ou excitation double, comme le Fura-2, sont appelés indicateurs ratiométriques de calcium. Les colorants non-ratiométriques qui ont des longueurs d’onde uniques d’excitation et d’émission existent egalement. Cependant, ils sont plus susceptibles au photo-blanchiment, qui est la diminution ou perte de fluorescence suite à une exposition prolongée à la lumière.
Une des étapes clés avant d’utiliser un colorant dans une expérience est de calibrer les mesures de fluorescence prises sur des colorants en solution dont la concentration en calcium est connue. Ceci permettra aux scientifiques d’estimer précisément des concentrations intracellulaires en calcium basées sur les intensités d’émission mesurées pendant les expériences.
Maintenant que nous savons comment les indicateurs de calcium fonctionnent, explorons comment imager le flux de calcium dans des neurones sur plaque.
Commencez par préparer le colorant de votre choix, comme le Gura-2, et mélangez le avec une solution physiologique. Tourbillonnez la solution pour assurer un mélange correct. Une fois suffisamment mélangée, transférez-la dans un plat. Maintenant, placez la lamelle avec les neurones de culture dans le plat avec la solution colorante. Ensuite, incubez les neurones dans le noir, le temps nécessaire, à la température appropriée, qui sont dans ce cas 30 minutes à 37°C. Après la période d’incubation, transférez la lamelle dans un autre plat sans le colorant.
L’étape suivante est de monter la lamelle dans la chambre d’imagerie du microscope. Une fois montée, connectez le tuyau du système de perfusion d’entrée et remplissez lentement la chambre. Sécurisez la chambre sur le plateau du microscope et installez le tuyau de perfusion de sortie, assurant un flux continu à travers le système de perfusion.
Maintenant que le plateau du microscope est prêt, faites la mise au point sur les neurones sous la lumière visible. Testez le colorant en illuminant les cellules aux longueurs d’onde de 340 et 380 nm. Rappelez-vous qu’avec le Fura-2, des neurones non activés devraient émettre plus de lumière lorsqu’ils sont excités à 380 nm vu que le calcium n’est pas lié.
Ensuite, ajustez les paramètres de la caméra en vue d’optimiser la gamme dynamique avant de commencer l’expérience. Collectez une image à chaque longueur d’onde, puis utilisez l’outil « région d’intérêt » (ROI tool) pour mesurer l’intensité du bruit de fond à chaque longueur d’onde. Entrez les valeurs du bruit de fond dans le logiciel afin qu’elles soient soustraites des images ultérieures.
Une fois que le paramétrage initial est fini, choisissez les cinq champs de vue qui vont être imagés pour l’expérience et sauvez les coordonnées dans le logiciel. Pendant l’expérience, le plateau automatisé bouge vers un champ, collecte une portion de l’intensité du champ aux longueurs d’onde 340 et 380 nm, et se déplace vers le champ suivant jusqu’à ce que tous les champs soient collectés. Dans certaines expériences, un agent pharmacologique qui provoque des changements dans les niveaux de calcium intracellulaire est ajouté au fluide de perfusion. Une solution haute en potassium, qui dépolarise les neurones, peut provoquer l’augmentation de la concentration intracellulaire en calcium comme montré dans cette série d’images au cours du temps et sert de bon contrôle positif. Une fois que la collecte des données est terminée, passez à l’analyse.
Pour analyser les résultats, sélectionnez les régions d’intérêt qui incluent des neurones ou des parties de neurone en utilisant le software. Ensuite, utilisez le logiciel pour mesurer l’intensité ratiométrique de l’image, pour les deux longueurs d’onde, à chaque ROI et dans toutes les images collectées. Avec cette information, une estimation quantitative des changements de concentration intracellulaire en calcium au cours du temps peut être faite.
Maintenant que vous comprenez comment l’imagerie calcique est réalisée dans les neurones, regardons quelques moyens d’utiliser cette précieuse méthode en recherche aujourd’hui.
Tout d’abord, et principalement, l’imagerie calcium est utilisée pour étudier comment le calcium intracellulaire fluctue en relation à l’activité neuronale.
Dans cette étude, des neurones individuels ont été rempli d’un colorant indicateur de calcium pendant que le patch-clamp était enregistré. Le contrôle précis du potentiel de membrane permis par la technique de patch-clamp fournit une vue sur la dynamique des flux de calcium.
L’imagerie calcique permet aux chercheurs d’étudier l’activité hautement synchrone du réseau de neurones.
Ici, les neuroscientifiques ont utilisé l’imagerie calcique pour évaluer le signal de fluorescence de 40 neurones. Avec cette information, les propriétés du réseau telles que la propagation du signal et les corrélations neuronales peuvent être déterminées.
La dynamique du calcium peut aussi révéler comment les neurones traitent les signaux du monde extérieur, comme les odeurs.
Dans cette expérience, les neurones à l’intérieur des tissus furent incubés avec du Fura-2 et imagés en même temps que d’être présentés à des substances odorantes comme l’urine ou des phéromones purifiées. En manipulant l’expression des protéines réceptrices d’odeurs dans les neurones olfactifs, il est possible de visualiser directement comment une protéine unique influence l’habilité d’une cellule à répondre à une seule odeur.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’imagerie calcium dans les neurones. Dans cette vidéo, nous avons présenté les principes derrière la technique et passé en revue une expérience typique. Etant donné les nombreux rôles important du calcium, l’imagerie calcique restera un outil vital dans la compréhension des neurones et de la facon dont ils interagissent. Merci de nous avoir regardés!
