Le cerveau est l’un des organes les plus complexes du corps, et les neuroscientifiques ont donc souvent besoin d’un système simplifié pour effectuer des manipulations expérimentales et des observations. La culture cellulaire est un procédé qui permet d’accéder facilement aux neurones vivants. En général, la culture cellulaire implique leur croissance dans une solution spéciale appelée milieu de culture, dans un environnement stérile et contrôlable (habituellement un incubateur chauffé). Une culture primaire est produite à partir de tissus disséqués d’un organisme. Différents types de cultures primaires neuronales peuvent être obtenus à partir d’une variété d’organismes, d’étapes du développement et de tissus du système nerveux. Cette vidéo comporte une introduction aux méthodes de production de cultures primaires de neurones ainsi que quelques expériences qui utilisent habituellement ces cellules.

De nombreux modèles animaux importants pour la recherche en neuroscience peuvent être utilisés pour préparer des cultures primaires de neurones. A partir de souris et de rats –deux des mammifères les plus utilisés en recherche biomédicale- du tissu neuronal d’embryons, de nouveau-nés ou d’adultes peut être disséqué pour être cultivé. Les embryons et nouveau-nés sont préférablement utilisés car leurs cellules cérébrales sont immatures et présentent moins de risques d’être endommagées.

Différents tissus du système nerveux peuvent être isolés et utilisés pour produire différents types de cultures primaires neuronales. Par exemple, on peut disséquer des endroits spécifiques du cerveau, comme le cervelet, le cortex et l’hippocampe. La moelle épinière ou les composants du système nerveux périphérique, comme le ganglion sacré, peuvent aussi être disséqués et cultivés pour obtenir des types de neurones spécifiques.

Quelle que soit l’origine du tissu, la méthode générale pour réaliser des cultures primaires neuronales peut être résumée en quelques étapes importantes : la dissection, la dissociation, la mise en culture et l’entretien.

Commençons la revue en profondeur de ces étapes par la première : la dissection. En préparant les étapes de dissection et de culture, la stérilité est indispensable pour éviter la contamination des cultures. Les outils doivent être stérilisés à l’alcool et une hotte à flux laminaire est souvent utilisée pour enlever les contaminants présents dans l’air.

Pour cultiver des neurones de rongeurs, le tissu doit provenir d’un animal récemment euthanasié maintenu dans une solution tampon saline froide. En utilisant un microscope de dissection, de petits endroits du tissu – comme l’hippocampe - peuvent être isolés avec précaution pour un traitement ultérieur.

Ensuite, il est nécessaire de réduire l’échantillon à ses composants cellulaires en utilisant un processus appelé dissociation. Le tissu disséqué est d’abord émincé au moyen d’un scalpel ou de ciseaux. Les morceaux de tissus obtenus sont transférés dans un nouveau contenant. Une enzyme protéolytique comme la trypsine ou la papaïne est ajoutée pour digérer les protéines de la matrice extracellulaire qui lient les cellules entre elles. Après une courte incubation dans un incubateur chaud ou au bain marie, les morceaux de tissus sont lavés délicatement avec une solution tampon pour éliminer les enzymes.

Les morceaux de tissus ramollis peuvent maintenant être dissociés par trituration, qui consiste à faire passer le tissu à travers une pipette, à plusieurs reprises, de manière à obtenir une suspension monocellulaire. A ce moment, les cellules peuvent être comptées pour en déterminer la concentration, et leur viabilité peut être vérifiée avec des colorants comme le bleu Tryptan, ce qui permet de calculer la dilution idéale pour favoriser la croissance cellulaire.

Enfin, les neurones sont prêts à être mis en culture ! Revoyons certaines des mesures importantes à suivre afin de les maintenir en vie et en bonne santé. La composition du milieu de culture utilisé pour la croissance des neurones est très importante. On ajoute habituellement au milieu des suppléments spécifiques qui aident à la survie et à la croissance des neurones. On peut aussi ajouter des médicaments qui inhibent la division de cellules non-neuronales comme les cellules gliales.

Une fois que la suspension cellulaire de neurones est mélangée avec le milieu, les cellules sont prêtes à être mise en culture dans les contenants choisis. Il peut s’agir de boîtes de culture et de plaques ou lamelles de verre placées à l'intérieur de ces contenants. Puisque les neurones ne peuvent pas croitre directement sur du verre, les lamelles sont traitées préalablement pour obtenir une meilleure surface pour la fixation et la croissance cellulaire. Ces traitements peuvent inclure un revêtement avec des protéines synthétiques de la matrice extracellulaire; par exemple, la poly-lysine et la laminine ; ou un grattage à l’acide pour rendre la surface rugueuse.

Une fois mis en plaque, les neurones sont cultivés dans un incubateur chaud et humide. La croissance du processus neuronal peut être observée en quelques heures jusqu’à plusieurs jours. Pour maintenir les cultures, une partie du milieu est remplacée par du milieu frais une fois par semaine. Typiquement, des cultures neuronales primaires sont utilisées pour des expériences, de quelques jours à quelques semaines après la mise en culture.

Maintenant que vous avez des neurones en culture qu’allez-vous faire avec ces cellules ?

La manipulation génétique par transfection ou transduction virale est une méthode de base utilisée sur les cultures de neurones. Du matériel génétique codant, comme une protéine mutante, peut être introduit dans les neurones en culture pour altérer les fonctions neuronales. Sinon, la transfection d'ARN double brin est une technique efficace pour bloquer l'expression des protéines. La disponibilité de multiples méthodes et réactifs pour la manipulation génétique rend cette application particulièrement utile pour une grande variété de questions de recherche.

Un exemple de question à laquelle on peut répondre grâce à la transfection de cultures de neurones est : où et de quelle manière certaines protéines ou complexes protéiques évoluent au sein des différentes structures morphologiques du neurone ? Pour obtenir la réponse, des neurones sont transfectés avec de l’ADN codant pour la protéine d’intérêt, qui peut être couplée avec une protéine fluorescente comme la Green Fluorescent Protein ou GFP. Les habitudes de déplacement et la localisation de la protéine fluorescente marquée peuvent alors être surveillées par imagerie en temps réel. Cette méthode peut être utilisée pour étudier, par exemple, le trafic de récepteurs de neurotransmetteurs à la surface de la cellule.

Les cultures primaires de neurones sont aussi très utiles pour les études d’électrophysiologie, dans lesquelles l’activité électrique de cellules uniques peut être mesurée à l’aide de microélectrodes. La monocouche de neurones en culture signifie que les cellules sont faciles à cibler, et des manipulations comme des traitements pharmacologiques sont effectuées rapidement et de manière uniforme. Par exemple, l'effet d'un échantillon test sur l'activité d'un neurone peut être mesuré par la technique de patch-clamp dans des neurones en culture.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE aux cultures primaires de neurones. Dans cette vidéo nous avons présenté la façon dont ces cultures sont préparées et le type d’expériences dans lesquelles elles sont communément utilisées. Les cultures primaires de neurones peuvent être générées à partir d’une grande variété de sources tissulaires, selon une méthodologie comprenant dissection, dissociation dans une suspension cellulaire, et croissance sur un milieu de culture en incubateurs. Merci de nous avoir regardés!