Le programme NSF-IRM (CHE: 1229103) est reconnu pour financer l&#39;achat de nouveaux appareils électroniques de contrôle, des logiciels, des cellules liquides, et d&#39;autres équipements nécessaires à l&#39;assemblage d&#39;un double AFM / STM. Nous reconnaissons les équipements communs à l&#39;Université de Chicago programme NSF-MRSEC (DMR-0820054) pour l&#39;assistance avec l&#39;AFM instrumentation, de la formation et de l&#39;imagerie, et pour le temps de l&#39;instrument mis à disposition par le Réseau Installations de recherche Matériaux (DMR-0820054). Nous remercions tout particulièrement le Dr Qiti Guo, le Dr Justin Jureller, et le professeur Ka Yee Lee pour accueillir nos étudiants avant que le financement de la proposition NSF-IRM qui a l&#39;instrumentation nécessaire à notre campus. Nous reconnaissons le financement d&#39;une subvention STEM titre III (ID: P031C110157) confiée à l&#39;Université Northeastern Illinois qui a fourni des bourses de recherche d&#39;été pour les étudiants et les professeurs ainsi que le soutien pour les consommables. Enfin, nous reconnaissons Bruker-Nano, Inc. pour le soutien instrumental continue et la permission de reproduce un graphique montrant le mécanisme de PeakForce QNM et d&#39;utiliser le mot ScanAsyst pour décrire le logiciel automatisé.

1. informatique et Microscope mis en place <ol><li> Ouvrir la vanne de la bouteille de N 2 et d&#39;ajuster les commandes pour assurer la table d&#39;air est flottant et le niveau. </li><li> Allumez l&#39;ordinateur, le contrôleur et la fibre optique lumière dans cet ordre. </li><li> Réglez le scanner en mode / LFM AFM et centrer la caméra sur la tête AFM. </li><li> Ouvrez le logiciel. Sélectionnez la catégorie de l&#39;expérience &quot;Propriétés nanomécaniques&quot;, &quot;Quantitative nanomécanique Mapping&quot; dans le groupe expérimental, et &quot;PeakForce QNM dans le liquide&quot; en cours d&#39;expérimentation. Cliquez sur l&#39;expérience de charge et puis Configuration. </li><li> Concentrer la caméra avec l&#39;objectif de Z à voir la surface de la scène. Utilisation du grossier vers le haut / vers le bas piezos déplacer le stade d&#39;environ 1 mm en dessous de la surface de l&#39;ouverture de la tête AFM. </li></ol> 2 Préparation de Mica Surface <ol><li> Appuyez sur un autocollant sur la face d&#39;un disque propre de support d&#39;échantillon (de 15 mm de diamètre, 0,8 mm d&#39;épaisseur). Poussez un mica V-4disque de qualité (25 x 25 x 26 mm) sur l&#39;adhésif jusqu&#39;à fermement attaché. </li><li> Frotter un morceau de ruban adhésif transparent sur le mica s&#39;assurant qu&#39;elle est bien respectée sans bulles d&#39;air. Tirez la bande de mica d&#39;un côté à cliver de façon homogène. Répétez si nécessaire pour assurer le mica est plat. </li><li> Saisir le disque de support, côté mica nettoyage, avec une paire de pinces circulaires (pinces de disques), et placer sur le scanner. Le mica doit être en dessous du niveau de l&#39;ouverture de la tête AFM. </li></ol> 3. fluide Assemblée cellulaire et l&#39;imagerie de Mica Surface <ol><li> Rincer la cellule de fluide, un joint torique, l&#39;adaptateur de seringue, l&#39;adaptateur de tuyau flexible et le tuyau d&#39;éjection dans 100% d&#39;éthanol. Rincer la cellule fluide dans l&#39;eau DI. Laissez toutes les pièces sécher à l&#39;air complètement. </li><li> Poussez l&#39;adaptateur de tuyau dans le port de la cellule fluide propre. Appuyez doucement sur le joint torique dans l&#39;encoche centre de la cellule fluide en utilisant des pinces à tête plate. </li><li> Appuyez sur le ressort légèrement sur le clip sonde de retenue et le détourner de la Groove pour la pointe. </li><li> Saisissez la sonde sur la partie longue de la pointe avec des pincettes à tête plate. Placer la sonde dans la rainure avec la pointe tournée vers le centre de la cellule. Poussez le ressort dans et ajuster le clip de retenue sur la sonde pour le fixer (figure 1B). </li><li> Vérifiez la pince sur l&#39;AFM afin de s&#39;assurer qu&#39;elle est complètement rétracté (figure 1C). </li><li> Placer le tube de fluide, le joint torique et la sonde vers le bas, au-dessus de l&#39;échantillon de mica. Permettre à la cellule fluide pour se reposer sur les goujons de l&#39;AFM. Abaisser la pince à stabiliser la cellule fluide sur la scène. Appuyez sur le bouton vers le bas sur le microscope jusqu&#39;à ce qu&#39;une inspection visuelle indique que le joint torique comprimé fermement entre le disque de support et la cellule de fluide. </li><li> Tout en regardant le moniteur, concentrer le bouton de réglage grossier de visualiser la partie supérieure de la cellule fluide sur l&#39;écran. </li><li> Déplacez le microscope jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est une image claire de la pointe à l&#39;aide des X / Y boutons de réglage et l&#39;objectif de Z. La pointe sera apporeille comme un triangle d&#39;or métallique. Déplacer l&#39;extrémité proche de la surface de l&#39;échantillon à l&#39;aide du levier piézoélectrique sur le microscope. Focus sur la réflexion de la pointe. Gardez une trace de la console réelle par rapport à sa réflexion. A ce stade, ils doivent être étroitement alignés, mais pas complètement chevauchement. </li><li> Fixez l&#39;adaptateur de la seringue pour une seringue de 1 ml stérile. Attacher une extrémité du tuyau d&#39;éjection de l&#39;adaptateur de seringue et placer l&#39;autre extrémité du tuyau dans le réservoir de solution tampon. Déployez complètement le piston de la seringue. </li><li> Fixer le tuyau à l&#39;adaptateur de tuyau sur la cellule fluide. Appuyez doucement sur le piston jusqu&#39;à ce que le fluide remplit entièrement la chambre centrale. Vérifiez la cellule pour assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air. Vérifiez qu&#39;il n&#39;y a pas de liquide débordant de la cellule fluide sur le microscope. Placer la seringue sur un support solide en relief. </li><li> Utilisez l&#39;alimentation de l&#39;appareil photo et les boutons X / Y de traduction pour localiser le laser sur l&#39;écran (un point rouge diffuse). Utilisation du laser mouvemboutons de commande ent, déplacer le laser sur la pointe. </li><li> Ajuster finement les commandes de laser et de miroir, jusqu&#39;à ce que le signal de somme affichée sur le microscope est maximisée (value = 4-6). </li><li> Ajustez l&#39;angle de la diode quadrant en utilisant les boutons sur le côté arrière gauche et en haut à gauche de la tête de balayage pour réduire les déviations verticales et horizontales affichées sur le microscope le plus près possible de zéro (± 0,1). </li><li> Dans le logiciel, sélectionnez les options d&#39;acquisition. Au minimum, sélectionnez hauteur (trace et retrace), l&#39;erreur de la force maximale et la déformation. Les autres options dépendent utilisateur et peuvent être adaptés en fonction de l&#39;information spécifique désirée par l&#39;expérimentateur. </li><li> Sélectionnez &quot;ligne&quot; pour RT Avion Fit dans chaque fenêtre d&#39;acquisition. Sélectionnez «aucun» pour l&#39;OT plan Fit dans les fenêtres de hauteur. Réglez la décalages X et Y et l&#39;angle de balayage à zéro, si ce n&#39;est déjà fait. </li><li> Réglez la vitesse de balayage de 1 Hz, l&#39;échantillon par ligne 256, le contrôle automatique de ScanAsystà l&#39;individu, et l&#39;auto Z limite de ScanAsyst désactivé. Modifier la limite de Z à 500 nm. Régler la taille de balayage à 1 pm. </li><li> Cliquez engager. A ce stade, la pointe se rapproche de la surface. Bien que la pointe est proche, observer Z changement de tension piézo-électrique dans le coin inférieur gauche de l&#39;écran. Si la pointe sort de la plage, retirer la pointe et re-approche. En cas d&#39;échec, la pointe peut-être besoin d&#39;être changé afin d&#39;avoir une approche réussie. Une fois que la pointe est engagée, les lignes vont commencer à apparaître sur chacune des fenêtres d&#39;acquisition qui composeront une image. </li><li> Prendre des images de mica à 1 x 1 um et agrandir lentement afin de s&#39;assurer que la surface du mica est propre et plane. Cliquez sur la capture continue d&#39;enregistrer des images telles qu&#39;elles apparaissent. Zoomer et se déplacer autour de la surface comme vous le souhaitez. </li></ol> 4. protéines dépôt et Préparation de l&#39;échantillon pour l&#39;imagerie <ol><li> Obtenir protéine purifiée échantillon 38 et garder sur la glace. Si elles sont stockées dans un congélateur, décongeler échantillon surde la glace pendant 5 min. </li><li> Diluer la protéine de 0,0010 mg / solution tampon d&#39;imagerie utilisant ml réfrigéré. Le tampon d&#39;imagerie utilisée ici est 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM de NaCl et 15 mM de MgCl2. </li><li> Remplir une chambre 4 (100 x 15 mm) de boîte de Pétri avec une solution tampon d&#39;imagerie réfrigéré. Remplir chaque chambre avec au moins 5 ml de solution. Mélanger la solution de protéine diluée avec le bout attaché à micropipetteur doucement. </li><li> Appliquer 200 ul de la solution de protéine diluée à la surface du mica déjà préparé. Après 30 secondes, ramasser la protéine de surface / mica avec les pinces circulaires (pinces de disque). Maintenez l&#39;échantillon parallèle à la paillasse. </li><li> Tout en maintenant l&#39;échantillon, immédiatement immerger l&#39;échantillon dans la solution tampon contenue dans le premier quadrant de la boîte de Pétri (étape 4.2), tout en veillant à ce que l&#39;échantillon est parallèle à la cuvette de la boîte de Pétri. Après 1 sec, retirer l&#39;échantillon. </li><li> Continuer à maintenir l&#39;échantillon parallèle au bassinde la boîte de Pétri, répétez l&#39;étape 4.5 pour les trois autres quadrants. </li><li> Placez le disque sur un chiffon à poussière sec pour absorber l&#39;excès d&#39;humidité et de transférer le disque sur la platine du microscope. Ne touchez pas la surface réelle avec le chiffon. Ne pas laisser l&#39;échantillon à sécher. </li><li> Répétez les étapes 3.6 à 3.16. </li></ol> 5. imagerie protéines sur Mica <ol><li> Cliquez sur les paramètres de contrôle boîte sur le côté gauche de l&#39;écran. taille de printemps et le rayon de pointe devraient être fixés repose sur la pointe utilisée. </li><li> Cliquez engager. De même pour le processus d&#39;imagerie de mica (étape 3.17), observer la fenêtre z-piézo à l&#39;approche de pointe. </li><li> Autoriser le scanner à l&#39;image de la même zone pendant au moins deux passes consécutives. Cliquez sur la capture continue à enregistrer chaque image recueillie. </li><li> Déplacez le scanner à une nouvelle région et / ou changer la taille de l&#39;image comme vous le souhaitez. </li><li> Après que le logiciel automatisé a terminé le réglage de laparamètres de numérisation pour une taille d&#39;image particulier, tournent le logiciel off. </li><li> Ajuster manuellement la vitesse de balayage, limite z, le nombre de lignes, et de la tension afin de peaufiner la mise au point de l&#39;image. Si l&#39;image est trop loin de la mise au point, tourner logiciel de back sur pour retourner la position de départ. Pour augmenter la résolution d&#39;une image lors d&#39;un zoom sur une protéine, diminuer la vitesse de balayage et d&#39;augmenter le nombre de lignes proportionnellement. </li><li> Après l&#39;expérience, nettoyer la cellule liquide avec 100% d&#39;éthanol et rincer à DI H 2 O. Permettre à la cellule liquide pour sécher complètement. </li><li> Ouvrez le logiciel de données pour traiter des images de données brutes. Tout d&#39;abord, aplatir l&#39;image en cliquant sur l&#39;icône de l&#39;aplatir. Sélectionnez zéro ème ordre et cliquez sur exécuter. En fonction de l&#39;image, un plan de coupe peut être nécessaire pour obtenir une image appropriée à plat. Dans ce cas, sélectionnez l&#39;ajustement avion icon et dessiner un plan d&#39;une zone plate de l&#39;image à l&#39;aide du curseur. Cliquez sur exécuter. Répéter au besoin </li><li> Select l&#39;onglet de section à mesurer les dimensions de la protéine. Tracez une ligne avec le curseur déplacer sur la molécule ou de la zone à analyser. Répétez l&#39;opération pour de multiples domaines et le logiciel va générer une superposition. Exporter l&#39;image ou les données utilisées pour générer l&#39;image dans un format compatible avec d&#39;autres logiciels et dessin. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Near-Infared+Fluorescent+Protein+for+in+vivo+Imaging.">Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging.</a> Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).</li><li>Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Origin+of+Fluorescence+in+Bacteriophytochrome+Infrared+Fluorescent+Proteins.">On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins.</a> J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).</li><li>Lehtivuori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Properties+of+the+Chromophore-Binding+Domain+of+Bacteriophytochrome+from+Deinococcus+radiodurans.">Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans.</a> J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).</li><li>Toh, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Reactions+of+Bacteriophytochrome+Observed+with+Ultrafast+Mid-Infrared+Spectroscopy.">Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).</li><li>Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein.">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li><li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-transfer+and+hydrogen-bond+interactions+determine+fluorescence+quantum+yield+and+photochemical+efficiency+of+bacteriophytochrome.">Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1.">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , .</li><li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome,+RpBphP3,+reveals+residues+that+modulate+photoconversion.">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

There are no competing financial interests or conflicts of interest.

L&#39;AFM est un procédé de microscopie à sonde de balayage tout à fait capable d&#39;imager des protéines et d&#39;autres macromolécules biologiques dans des conditions physiologiquement pertinentes. En comparaison à la cristallographie aux rayons X et RMN, une des limites de l&#39;AFM est son incapacité à obtenir la même résolution, en particulier la résolution latérale. Lors de l&#39;utilisation de l&#39;AFM analyser une molécule sur une surface, l&#39;impact de la surface et la sonde sur l&#39;image de...

Microscopie à force atomique (AFM) est devenu un outil très important pour l&#39;étude des propriétés structurales et mécaniques des surfaces, couches minces, et des molécules simples depuis son invention en 1986 (Figure 1). 1-3 Utilisation d&#39;une cellule de liquide, la méthode a devenir particulièrement utile dans les études des macromolécules biologiques et même de cellules vivantes dans un environnement physiologiquement pertinents. 4-10 Tapping mode AFM a traditionnellement été utilisé pour l&#39;imagerie des tissus mous ou des molécules faiblement liées à la surface, car le contact en mode AFM est généralement inadaptés en raison de pour les dommages causés par les forces latérales exercées sur l&#39;échantillon par la console. 11 Tapping mode AFM permet de réduire considérablement ces forces en ayant la pointe intermittence toucher la surface plutôt que d&#39;être en contact permanent. Dans ce mode, le cantilever est amené à osciller à ou près de sa fréquence de résonance normale à la surface. De même pour communiquer avec mode AFM, la topographie est analyzed en traçant le mouvement de la piézo-z comme une fonction de xy (distance). La dynamique en porte à faux peuvent être très instable à ou près de résonance; par conséquent, ils sont très difficiles à automatiser l&#39;extérieur d&#39;une situation dite de «stabilisation». Plus précisément, ces dynamiques dépendent à la fois les propriétés de l&#39;échantillon et de l&#39;environnement de la numérisation. Pour une molécule doux adsorbé à un (re) surface dure, une boucle de rétroaction bien réglé pour la molécule peut engendrer un retour oscillation de la surface. Fonctionnement en fluide complique encore la mise au point de la poutre. Changements dans les niveaux de température ou fluides exigent un réajustement constant de point de consigne, les gains, et d&#39;autres paramètres d&#39;imagerie. Ces ajustements ont tendance à prendre beaucoup de temps et très difficile pour les utilisateurs. Property Mapping pic de travail quantitative nanomécanique (PF-QNM), comme le mode de percussion AFM, d&#39;éviter les interactions latérales en contactant par intermittence l&#39;échantillon (Figure 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt; Toutefois, PF-QNM fonctionne en mode et fréquences beaucoup plus basses que-tapping mode AFM non-résonance. Ceci élimine les problèmes de réglage de mode taraudage AFM, en particulier ceux exacerbé par la présence de fluide. Avec PF-QNM, les images sont recueillies en prenant une courbe de réponse de la force à chaque point de contact. Avec l&#39;ajout de logiciels de ScanAsyst, 15 réglage des paramètres de numérisation peut être automatisée et une image à haute résolution obtenue dans une affaire de minutes, même par des utilisateurs inexpérimentés. Une fois que l&#39;utilisateur se familiarise avec l&#39;AFM, tout ou partie des paramètres automatiques peuvent être désactivées à tout moment qui permet à l&#39;expérimentateur d&#39;affiner la qualité de l&#39;image manuellement. Depuis sa création, le PF-QNM a été appliquée à la carte bactériorhodopsine, une protéine de la membrane, et d&#39;autres protéines natives au niveau submoléculaire. 16-18 Pour bactériorhodopsine, il existe une corrélation directe entre la flexibilité des protéines et X-ray structures cristallographiques. PF 12 -qnM a été utilisée pour étudier des cellules vivantes avec une résolution élevée. 19,20 liens importants outre, les données PF-QNM a élucidés entre la structure et la mécanique dans la membrane des érythrocytes qui sont critiques pour l&#39;intégrité et la fonction des cellules. 21 Nous avons utilisé la microscopie à sonde à balayage (SPM) méthodes, 22 y compris AFM, 23 pour étudier la structure des photorécepteurs aux feux rouges appelé bactériophytochromes (BphPs). 24,25 Ils se composent d&#39;un module de détection de lumière lié de façon covalente à un module de signalisation effecteur tel comme l&#39;histidine kinase (HK) 26. Le module de détection de lumière comprend généralement un chromophore bilin qui subit une transformation structurelle lors de l&#39;absorption d&#39;un photon, avec une série de modifications structurelles qui atteignent le module de signalisation de l&#39;effecteur et conduisant à une transformation globale de la protéine entière . 24,27-29 base de cette transformation, il ya deux lumière distincte absorbant stats de BphPs, un état absorbant la lumière rouge et rouge lointain, désignés comme Pr et Pfr. Pr est thermiquement stable, état ​​adapté à l&#39;obscurité pour la plupart des BphPs. 28 La base moléculaire de Pr / Pfr photoconversion n&#39;est pas entièrement comprise en raison de la connaissance structurelle limitée de ces protéines. A l&#39;exception d&#39;une structure de D. radiodurans, tous les 30 rayons X publiée structures cristallographiques de ces protéines sont dans l&#39;état adapté à l&#39;obscurité et manquent de domaine effecteur. Les BphPs intacts sont trop gros pour être étudié de manière efficace par résonance magnétique nucléaire (RMN) et sont notoirement difficiles à cristalliser dans leur forme intacte (en particulier dans l&#39;Etat de lumière adapté) pour la cristallographie aux rayons X. BphPs ont récemment été conçu en tant que marqueurs de protéines fluorescentes infrarouge (IFP). 31 Caractérisation structurale de ces protéines peut favoriser l&#39;aide à la conception IFP efficace. 32-36 Est l&#39;objet de cet article de présenter une procédure pourde formation d&#39;image à l&#39;aide de l&#39;AFM BphPs liquide-cellule par l&#39;intermédiaire de PF-QNM. La méthode est démontrée par des études de l&#39;état de lumière adaptée de la bactériophytochrome RpBphP3 (P3) de la bactérie photosynthétique R. palustris. La procédure de l&#39;AFM approche présentée ici est simple et commode pour l&#39;imagerie de protéines ainsi que d&#39;autres macromolécules biologiques. Avec cette méthode, les détails de structure des molécules individuelles peuvent être collectées dans un court laps de temps, similaire à une session de cours de science de laboratoire de niveau supérieur. Grâce à la mesure de sections et de compléter d&#39;autres analyses dimensionnelles, les données expérimentales peuvent être comparés à des modèles informatiques utiles. 37-42

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4997-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode 8 AFM</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>492-008-011</td>
			<td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapping Mode Fluid Cell</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>MTFML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica V-4 Grade</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>1150503</td>
			<td>25 x 25 x .26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample support disk</td>
			<td>nanoSurf</td>
			<td>BT02236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Plasta-Medic, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 15 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettors</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>XL 3000i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RpBphP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared according to cited references</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light</td>
			<td>Digital Instruments Inc.</td>
			<td>F0-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco AFM Disc Gripper</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1668</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>102-ST1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td>
			<td>Schrodinger, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

La microscopie à force atomique (AFM) utilise une pointe pyramidale fixée à un porte à faux à sonder la réaction d&#39;une surface de force. Les déviations de la pointe peut être mesurée à ~ 10 pN par un laser et d&#39;un détecteur à secteurs, qui peut être converti à l&#39;image de la topographie. Modulation d&#39;amplitude ou &quot;tapping mode&quot; AFM implique la sonde en contact intermittent avec la surface en oscillant à sa fréquence de résonance pour produire une image. Utilisé en association avec une cellule de fluide, en mode taraudage AFM permet l&#39;imagerie des macromolécules biologiques telles que les protéines dans des conditions physiologiquement pertinentes. Mode Tapping AFM nécessite un réglage manuel de la sonde et de fréquents ajustements d&#39;une multitude de paramètres d&#39;analyse qui peut être difficile pour les utilisateurs inexpérimentés. Pour obtenir des images de haute qualité, ces ajustements sont les plus coûteux en temps. PeakForce quantitative nanomécanique Property Mapping (PF-QNM) produit une image en mesurant une respon forcecourbe soi pour chaque point de contact avec l&#39;échantillon. Avec le logiciel de ScanAsyst, PF-QNM peut être automatisé. Ce logiciel permet de régler le point de consigne, la fréquence d&#39;entraînement, vitesse de balayage, les gains, et d&#39;autres paramètres de numérisation importants automatiquement pour un échantillon donné. Non seulement ce processus à protéger les deux sondes et les échantillons fragiles, il réduit considérablement le temps nécessaire pour obtenir des images à haute résolution. PF-QNM est compatible pour l&#39;imagerie AFM dans le liquide; par conséquent, il a une large application pour l&#39;imagerie de matériaux biologiquement pertinents. La méthode présentée dans ce document décrit l&#39;application de PF-QNM d&#39;obtenir des images d&#39;un photorécepteur de lumière rouge bactérienne, RpBphP3 (P3), de la photosynthèse R. palustris dans son état ​​adapté à la lumière. En utilisant cette méthode, les dimères de protéines individuelles de P3 et des agrégats de dimères ont été observées sur une surface de mica en présence d&#39;un tampon d&#39;image. Avec les ajustements appropriés à la surface et / ou de la concentration de la solution, cette méthodepeuvent généralement être appliquées à d&#39;autres macromolécules d&#39;intérêt biologique et de matériaux souples.

Images AFM représentatifs d&#39;une protéine de photorécepteur, P3, dans l&#39;état adapté à la lumière sont présentés sur les figures 3 et 4. Un substrat de mica fraîchement clivé (figure 3A) est une surface appropriée, plat pour l&#39;adsorption des protéines. Collecte d&#39;une image de mica propre en tant que témoin négatif est important pour plusieurs raisons. Tout d&#39;abord, il assure la cellule liquide est propre et pas de matières résiduelles ...

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Microscopie à force atomique de Red-Light photorécepteurs Utilisation de l&#39;association PeakForce quantitative nanomécanique propriété

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

atomic-force-microscopy-red-light-photoreceptors-using-peakforce

Research

JoVE Journal

Engineering

11.6K vues.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

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Preparation and Friction Force Microscopy Measurements of Immiscible, Opposing Polymer Brushes

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low friction at the interface. Nevertheless, these systems can be sensitive to wear due to interdigitation of the opposing brushes. In a recent publication, we have shown via molecular dynamics simulations and atomic force microscopy experiments, that using an immiscible polymer brush system terminating the substrate and the slider surfaces, respectively, can eliminate such interdigitation. As a consequence, wear in the contacts is reduced. Moreover, the friction force is two orders of magnitude lower compared to traditional miscible polymer brush systems. This newly proposed system therefore holds great potential for application in industry. Here, the methodology to construct an immiscible polymer brush system of two different brushes each solvated by their own preferred solvent is presented. The procedure how to graft poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) from a flat surface and poly(methyl methacrylate) (PMMA) from an atomic force microscopy (AFM) colloidal probe is described. PNIPAM is solvated in water and PMMA in acetophenone. Via friction force AFM measurements, it is shown that the friction for this system is indeed reduced by two orders of magnitude compared to the miscible system of PMMA on PMMA solvated in acetophenone.

The methodology to perform friction force microscopy experiments for contacting brushes is presented: Two polymer brushes that are grafted from (a) substrates and (b) colloidal probes are slid to show that, by using two contacting immiscible brush systems, friction in sliding contacts is reduced compared to miscible brush systems.

Mesures de préparation et de friction Microscopie à force de polymères non miscibles, Opposing Brosses

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low ...

Recherche

Ingénierie

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve geologic seals and allow CO2 to escape. However, the dissolution processes at reservoir conditions are poorly understood. Thus, time-resolved experiments are needed to observe and predict the nature and rate of dissolution at the pore scale. Synchrotron fast tomography is a method of taking high-resolution time-resolved images of complex pore structures much more quickly than traditional &#181;-CT. The Diamond Lightsource Pink Beam was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 hours. The images were segmented and the porosity and permeability were measured using image analysis and network extraction. Porosity increased uniformly along the length of the sample; however, the rate of increase of both porosity and permeability slowed at later times.

Synchrotron fast tomography was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 h.

Dynamic Pore échelle Reservoir condition d&#39;imagerie de Réaction en Carbonates utilisant Synchrotron Tomographie rapide

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Imaging Résolution Sous-nanomètre avec modulation d&#39;amplitude en microscopie à force atomique en liquide

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

An Efficient Method for Selective Desalination of Radioactive Iodine Anions by Using Gold Nanoparticles-Embedded Membrane Filter

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ion-selective removal of radioactive iodines. By using citrate-stabilized gold nanoparticles (mean diameter: 13 nm) and cellulose acetate membranes, gold nanoparticle-embedded cellulose acetate membranes (Au-CAM) have easily been fabricated. The nano-adsorbents on Au-CAM were highly stable in the presence of high concentration of inorganic salts and organic molecules. The iodide ions in aqueous solutions could rapidly be captured by this engineered membrane. Through a filtration process using an Au-CAM containing filter unit, excellent removal efficiency (&gt;99%) as well as ion-selective desalination result was achieved in a short time. Moreover, Au-CAM provided good reusability without significant decrease of its performances. These results suggested that the present technology using the engineered hybrid membrane will be a promising process for the large-scale decontamination of radioactive iodine from liquid wastes.

An efficient method for the rapid and ion-selective desalination of radioactive iodine in several aqueous solutions is described by using gold nanoparticles-immobilized cellulose acetate membrane filters.

Une méthode efficace pour le dessalement sélectif des Anions d’iode radioactif à l’aide du filtre à Membrane de nanoparticules-Embedded or

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ...

Surface Mapping of Earth-like Exoplanets using Single Point Light Curves

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate goal of this protocol is to determine whether these planetary worlds harbor geological features and/or climate systems. We present a method of extracting information from multi-wavelength single-point light curves and retrieving surface maps. It uses singular value decomposition (SVD) to separate sources that contribute to light curve variations and infer the existence of partially cloudy climate systems. Through analysis of the time series obtained from SVD, physical attributions of principal components (PCs) could be inferred without assumptions of any spectral properties. Combining with viewing geometry, it is feasible to reconstruct surface maps if one of the PCs are found to contain surface information. Degeneracy originated from convolution of the pixel geometry and spectrum information determines the quality of reconstructed surface maps, which requires the introduction of regularization. For the purpose of demonstrating the protocol, multi-wavelength light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, are analyzed. Comparison between the results and the ground truth is presented to show the performance and limitation of the protocol. This work provides a benchmark for future generalization of exoplanet applications.

The protocol extracts information from light curves of exoplanets and constructs their surface maps. It uses light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, to demonstrate the approach.

Cartographie de surface des exoplanètes de la Terre à l’aide de courbes lumineuses à point unique

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate ...

Optimizing Magnetic Force Microscopy Resolution and Sensitivity to Visualize Nanoscale Magnetic Domains

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force microscopy (AFM) probe whose tip has been magnetized vertically (i.e., perpendicular to the probe cantilever) is oscillated at a fixed height above the sample surface. The resultant shifts in the oscillation phase or frequency, which are proportional to the magnitude and sign of the vertical magnetic force gradient at each pixel location, are then tracked and mapped. Although the spatial resolution and sensitivity of the technique increases with decreasing lift height above the surface, this seemingly straightforward path to improved MFM images is complicated by considerations such as minimizing topographical artifacts due to shorter range van der Waals forces, increasing the oscillation amplitude to further improve sensitivity, and the presence of surface contaminants (in particular water due to humidity under ambient conditions). In addition, due to the orientation of the probe's magnetic dipole moment, MFM is intrinsically more sensitive to samples with an out-of-plane magnetization vector. Here, high-resolution topographical and magnetic phase images of single and bicomponent nanomagnet artificial spin-ice (ASI) arrays obtained in an inert (argon) atmosphere glovebox with &lt;0.1 ppm O2 and H2O are reported. Optimization of lift height and drive amplitude for high resolution and sensitivity while simultaneously avoiding the introduction of topographical artifacts is discussed, and detection of the stray magnetic fields emanating from either end of the nanoscale bar magnets (~250 nm long and &lt;100 nm wide) aligned in the plane of the ASI sample surface is shown. Likewise, using the example of a Ni-Mn-Ga magnetic shape memory alloy (MSMA), MFM is demonstrated in an inert atmosphere with magnetic phase sensitivity capable of resolving a series of adjacent magnetic domains each ~200 nm wide.

Magnetic force microscopy (MFM) employs a vertically magnetized atomic force microscopy probe to measure sample topography and local magnetic field strength with nanoscale resolution. Optimizing MFM spatial resolution and sensitivity requires balancing decreasing lift height against increasing drive (oscillation) amplitude, and benefits from operating in an inert atmosphere glovebox.

Optimisation de la résolution et de la sensibilité de la microscopie à force magnétique pour visualiser les domaines magnétiques à l’échelle nanométrique

Magnetic force microscopy (MFM) enables mapping local magnetic fields across a sample surface with nanoscale resolution. To perform MFM, an atomic force ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Microscopie à force atomique Nanoindentation basée sur le porte-à-faux: mesures des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique dans l’air et les fluides

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Réseaux de porte-à-faux actifs parallèles dans l’AFMS pour permettre des inspections à haut débit

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

Pleins feux sur l’auteur : Introduction à la microscopie à force atomique à sonde active avec réseaux de porte-à-faux quattro-parallèles

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

Microscopie à force atomique à sonde active avec réseaux en porte-à-faux quattro-parallèles pour l’inspection d’échantillons à grande échelle à haut débit

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...