This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

1. 3D Culture cellulaire et préparation pour l&#39;imagerie <ol><li> Culture d&#39;une lignée cellulaire appropriée, ce est à dire, la lignée cellulaire de carcinome du côlon HCT116, en deux dimensions, de la culture monocouche. </li><li> Cultiver les cellules HCT 116 dans un flacon T-25 avec les supports de McCoy 5A + 10% de sérum bovin fœtal dans un incubateur à CO2 à 5% jusqu&#39;à 50 à 70% de confluence, ce qui prend généralement quelques jours. </li><li> cellules de sortie avec une solution de trypsine-EDTA 0,25% et comptent une partie des cellules en utilisant un hémocytomètre et coloration au bleu trypan pour vérifier la densité et la viabilité cellulaire. </li><li> Après comptage, diluer les cellules avec du milieu complet pour obtenir une densité d&#39;ensemencement appropriée de 6000 cellules / puits, ou 30 000 cellules / ml. </li></ol> 2. Préparer Agarose Coated plaques à 96 puits <ol><li> Ajouter 0,19 g d&#39;agarose à 10 ml de milieu standard dans un tube conique de 50 ml (solution d&#39;agarose à 1,5% dans des milieux 10). Veiller à l&#39;incorporation par mélange doux. Autoclave l&#39;agarose dans un bain d&#39;eaupendant 20 min. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, aspirer 50 pi du mélange d&#39;agarose + supports dans les 60 puits centraux du fond 96 puits plaque de culture de plaque plane. Comme les puits au niveau des bords périphériques de la plaque ont des taux légèrement plus élevés d&#39;évaporation, ajouter 200 ul de phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS) au lieu de l&#39;agarose à ces bords. </li><li> Une fois le mélange agarose a été ajouté dans les puits intérieurs, réglez la plaque de côté pour refroidir à 37 ~ ° C avant l&#39;addition des cellules. </li></ol> 3. Plutôt semences et la culture tridimensionnelle REMARQUE: Les cellules plus ou moins peuvent être ensemencées en fonction des exigences de la culture concernée, mais il a été déterminé que ces conditions conduisent à des structures 3D de culture de cellules d&#39;environ 1 mm de diamètre après 10 à 14 jours de culture (données non présentées) . <ol><li> Ajouter 200 ul de la solution de cellules appropriée (dilué pour contenir ~ 6000 cellules) de l&#39;agarose enduitePlaque de 96 puits. Couvrir la plaque et mettre dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C pour la croissance cellulaire. </li><li> Changer de support de cellules un minimum de toutes les 48 heures, ou lorsque les médias semble changer de couleur. <ol><li> Changer médias en aspirant soigneusement l&#39;ancien médias à travers le petit culture cellulaire 3D (visible à l&#39;oeil nu par jour 2) au fond de l&#39;agarose. Ajouter 200 ul de milieu frais doucement sur la culture de cellules 3D. </li><li> (Étape optionnelle) Au cours de ces changements des médias, ajouter de chimiothérapie ou d&#39;autres médicaments pour les essais. Diluer le médicament de choix à la concentration finale avec les médias complètes et ajouter les nécessaires 200 pi dans chaque puits. </li><li> Surveiller 3D croissance de culture de cellules au microscope optique, jusqu&#39;à ce que les cultures de cellules 3D sont d&#39;environ 1 mm de diamètre. </li></ol></li></ol> 4. Récolte des cultures de cellules 3D <ol><li> Utilisez un 2 ml pipette sérologique pour enlever délicatement la culture cellulaire 3D du lit agarose. </li> &lt;li&gt; Lavez les cultures de cellules en 3D avec PBS en les pipetant doucement dans environ 1 ml de PBS dans une plaque à 24 puits en attente. </li><li> Transfert récolté des cultures de cellules 3D via une pipette sérologique de tubes à centrifuger de protéine ou d&#39;un métabolite extraction, ou de les incorporer dans un support de coupe pour aider à découper pour des applications d&#39;imagerie. </li></ol> 5. Intégrer les cultures de cellules en 3D dans de la gélatine <ol><li> Préparer une solution de ~ 175 mg / ml de gélatine dans de l&#39;eau de haute pureté (18 MQ préféré). 22,23 Mélanger la gélatine vigoureusement. Observez la solution devenir visqueux et difficile à manipuler. Placer le tube conique contenant de la gélatine dans un bain d&#39;eau à ~ 60 ° C et au chaud jusqu&#39;à ce que la solution devient limpide et facile à aspirer. REMARQUE: La solution de gélatine chaude durcit rapidement en se refroidissant, donc effectuer toutes les étapes suivantes rapidement avant de les congeler. </li><li> Après il est chauffé, prendre immédiatement la gélatine à la hotte de culture cellulaire. Garder le tube avec de la gélatine dans un beaker avec de l&#39;eau préchauffée à environ 60 ° C pour éviter le durcissement de la solution de gélatine. </li><li> En utilisant une pipette sérologique de 2 ml, déposer 0,6 ml de la solution de gélatine chaude dans le puits d&#39;une plaque à fond plat 24. Ce volume est suffisant pour couvrir le fond d&#39;une couche mince. Déposer doucement sur les cultures de cellules 3D immédiatement au-dessus de la couche de gélatine en utilisant une pipette de 2 ml différent pour éviter la rupture de la structure 3D. NOTE: Il faut veiller à ce stade de ne pas placer PBS dans la gélatine. Si cela se produit, cependant, enlever le PBS à partir du haut de la gélatine en utilisant une pipette de 200 pi. </li><li> Après que les cultures de cellules 3D sont placées sur la surface de la couche de gélatine, une pipette soigneusement autre 0,6 ml du mélange de gélatine chaude sur les cultures de cellules 3D, afin de ne pas perturber la position des cultures. Après la deuxième couche est placé, geler les cultures de cellules 3D gélatine intégré à -80 ° C. </li></ol> 6. Trancher et Thaw mont ee-gélatine intégrée des cultures cellulaires 3D pour l&#39;imagerie par spectrométrie de masse <ol><li> Retirer la plaque à 24 puits contenant les cultures de cellules 3D du congélateur. Chauffer le bas de la plaque avec la chaleur de votre main jusqu&#39;à une pince ou d&#39;un scalpel seront faites glisser doucement sur le côté du puits. </li><li> Glisser doucement la pince à épiler ou un scalpel, libérant la gélatine sans décongélation du centre. Prendre une goutte d&#39;eau sur le support de cryostat et l&#39;utiliser pour faire adhérer la gélatine disque sur le support. <ol><li> Des cultures de cellules 3D incorporés dans de la gélatine se prêtent le mieux à découper à -30 ° C. Nettoyez la lame de cryostat et le verre avec 70% d&#39;éthanol avant utilisation. Utilisez une autre partie de la lame ou une nouvelle lame pour chaque cellule disque 3D culture gélatine pour empêcher ternissement de la lame. </li></ol></li><li> Utilisation du cryostat, doucement face à l&#39;excès de gélatine jusqu&#39;à ce que les cultures de cellules 3D deviennent visibles. </li><li> À ce stade couper lentement les cultures de cellules en 3D avec un mouvement lisse 12-16 um sections. NOTE: Les facteurs critiques à trancher comprennent la distance du verre à la lame, l&#39;angle de la lame, la température du cryostat, et l&#39;angle du disque sur le support, de sorte que tous ceux-ci doivent être vérifiés pour se assurer des résultats cohérents. </li><li> Décongeler délicatement les tranches et les monter sur indium oxyde de titane (ITO) lames de verre revêtues d&#39;correctement étiquetés et rangez-la dans un dessiccateur. Utilisez les tranches aussi rapidement que possible pour une qualité maximale. </li></ol> 7. Demande de Matrix et la préparation d&#39;échantillons pour MALDI Imaging <ol><li> Avant imagerie MALDI, préparer tranches avec la matrice appropriée. <ol><li> Pour l&#39;analyse petite molécule, aucune des étapes de lavage sont généralement nécessaires. Pour la détection de la protéine intacte, laver les tranches dans 100% d&#39;acétone froid, le liquide de Carnoy, ou 70% / 95% d&#39;isopropanol pour éliminer les petites molécules telles que des lipides qui pourraient masquer le signal 24 - 26. </li><li> Lavez délicatement pour pas plus de 30 secondes à la fois. Ne pasdéranger les tranches. </li></ol></li><li> Préparer matrice dans une solution de solvant organique et d&#39;eau, avec 0,1% de TFA. Pour de petites molécules tels que α-cyano-4-hydroxycinnamique acide (CHCA), utiliser 60% d&#39;ACN: 40% H 2 O: 0,1% de TFA (10 mg / ml). Pour la détection de protéines tels que l&#39;acide sinapique (30 mg / ml), utiliser la même solution dans un solvant. Pour solubilité optimale de l&#39;acide sinapique, dissoudre d&#39;abord dans de l&#39;acétonitrile avant l&#39;addition du TFA: H 2 O solution. D&#39;autres matrices peuvent être utilisées le cas échéant. REMARQUE: matrice peut être appliquée à plusieurs méthodes différentes, mais il convient de noter certaines matrices ont été trouvées de co-cristalliser avec de la gélatine, tel que l&#39;acide férulique, rendant l&#39;échantillon inutilisable. Les petits cristaux produisent des spectres de masse plus uniforme, ce qui permet d&#39;espèces moléculaires plus être détectés et attribués à des différences biologiques plutôt que des effets de matrice. </li><li> Appliquer la matrice par la méthode handspotting. <ol><li> Utiliser une seringue de pointe fine pour appliquer 0,5 pi de la matrix solution sur la culture cellulaire 3D tranche et permet la matrice pour cristalliser. </li></ol></li><li> Vous pouvez également utiliser la méthode de l&#39;aérographe. Remplissez un aérographe de qualité commerciale avec la solution de matrice. <ol><li> Tenir le pulvérisateur 8-12 centimètres de la diapositive, viser une fine pulvérisation à la tranche. Entre les passages, la matrice permet de sécher pendant 1 min pour permettre la meilleure formation de cristaux. Jusqu&#39;à 10-20 passes de l&#39;aérographe est nécessaire pour produire une couche optimale de la matrice 22. </li></ol></li><li> Vous pouvez également utiliser la méthode de sublimation détaillé ailleurs. 25,27 </li><li> Lames sécher dans un dessiccateur pendant au moins 30 min avant l&#39;MALDI-MSI, quelle que soit la méthode d&#39;application de la matrice 25. </li></ol> 8. MALDI-MSI analyse à partir d&#39;un système MALDI-TOF (c.-à-AUTOFLEX III) NOTE: Cette section contient des instructions et des conseils pour le réglage des paramètres pour une expérience d&#39;imagerie MALDI-TOF. Selon les tenantsfabricant et logiciels utilisés trument, le processus peut varier. <ol><li> Monter les diapositives dans un adaptateur fait pour tenir solidement 75 mm x 25 diapositives mm à l&#39;image 3D les tranches de culture cellulaire attachés à lamelles recouvertes ITO. Charger l&#39;adaptateur de diapositives dans l&#39;instrument. </li><li> Préparer l&#39;instrument de MALDI-MSI en sélectionnant une norme de calibrage approprié pour la gamme de masse en question. Pour interrogation de petites molécules, les signaux détectés qui correspondent à la matrice utilisée, α-CHCA, sont un groupe commun de étalons. Pour l&#39;analyse de protéines, les normes de protéine connue (ce est à dire, l&#39;ubiquitine, trypsinogène) dans la gamme de masse d&#39;intérêt sont choisis et repérés à proximité des cultures de cellules 3D comme étalons. Calibrer l&#39;appareil avant de procéder à l&#39;élaboration de méthodes. </li><li> Avant imagerie, développer des méthodes d&#39;acquisition de données pour la gamme de masse de choix en utilisant le logiciel fourni par le fabricant de l&#39;instrument. Voir les figures 1 et 2 pourune petite molécule de protéine et d&#39;imagerie. Pour l&#39;imagerie du petit molécule, utiliser le mode réflectron pour la résolution de masse plus élevée. <ol><li> Réglez la plage de masse pour l&#39;acquisition de données de petites molécules entre 100-1000 m / z et pour les protéines entre 8,000- 25,000 m / z. Réglez la plage de masse pour englober la région de choix tout en offrant la résolution de masse plus élevée possible avec l&#39;instrument. </li><li> Réglez la puissance du laser, la fréquence, le nombre de tirs laser et taille de la tache à l&#39;aide de la solution d&#39;étalonnage et une «sacrificielle» culture cellulaire 3D tranche à proximité. Observez ces paramètres dans le logiciel de commande principal de l&#39;instrument. Utilisez les paramètres suivants comme point de départ recommandée: puissance de 60%, 400 tirs laser, ultra petite taille de spot. Ces paramètres varient selon les instruments et méthodes, afin d&#39;optimiser les paramètres de l&#39;appareil pour donner le spectre de la plus haute qualité pour chaque instrument spécifique. D&#39;autres paramètres qui peuvent être ajustés comprennent le gain du détecteur, la fréquence d&#39;échantillonnage, et le gain électronique. Save cette méthode pour une utilisation dans le logiciel d&#39;imagerie (ie., Exécution automatique Méthode qui se appuiera sur FlexImaging). REMARQUE: Supprime les ions ci-dessous la gamme de masse d&#39;intérêt (à nouveau trouvé dans le contrôle de l&#39;instrument) afin de ne pas interférer avec la détection. </li><li> Développer protéines méthodes d&#39;acquisition de données pour la gamme de masse de choix. Suivez les mêmes étapes décrites ci-dessus, mais pour les gammes milieu à la masse élevée, supérieure à environ 3 kDa, utiliser le mode linéaire. REMARQUE: Les paramètres diffèrent de ceux utilisés pour les petites méthodes de molécules. </li></ol></li><li> paramètres de l&#39;appareil de configuration spécifiques MS en utilisant le logiciel d&#39;imagerie fournie par le fabricant de l&#39;instrument, comme FlexImaging pour les systèmes Bruker MALDI-TOF. <ol><li> Créez un nouveau fichier d&#39;imagerie et le dossier, en utilisant les méthodes développées avant et enregistrés. Sélectionnez les paramètres de l&#39;appareil tels que la taille du spot de trame (de changement de la valeur par défaut environ 200 um à 50 um), mis en place la méthode de contrôle d&#39;instruments (de configuration de l&#39;étape 8.3.2 ou 8.3.3), et Position où numériser sur la culture cellulaire 3D. </li><li> Sélectionner trois points enseignent appropriées sur l&#39;échantillon, le déplacement du laser à chaque tour à tour. Obtenir la photographie optique depuis le logiciel de commande de laser MALDI-TOF utilisant &#39;écran d&#39;impression&#39;. NOTE: De nombreux logiciels d&#39;imagerie nécessitent une photographie optique de l&#39;échantillon à «enseigner» le logiciel où le laser est situé, qui peut être obtenu avec un scanner ou souvent la caméra de l&#39;appareil. </li></ol></li><li> Puis démarrer le processus d&#39;imagerie à partir du logiciel d&#39;imagerie (pas le contrôle de l&#39;instrument) et d&#39;acquérir des spectres de masse de chaque tranche. Observez la plupart des masses à travers la culture cellulaire 3D et d&#39;autres localisés à des zones particulières. </li></ol> 9. Facultatif Méthodes d&#39;analyse de données <ol><li> Pour l&#39;analyse ciblée, effectuer une analyse manuelle des spectres en cliquant sur ​​une masse dans le spectre de moyenne, ou de permettre le logiciel d&#39;imagerie de récupérer automatiquement des masses dessus d&#39;un seuil particulier (par exemple., Pics above haut seuil de 20%). Pour le contrôle de qualité, examiner la distribution des pics de la matrice ou le spectre moyen. </li><li> Effectuer des analyses statistiques avec des données extraites des logiciels mathématiques tels que R ou Matlab. <ol><li> Export spectres unique, au format ASCII, un fichier texte lisible, pour charger dans le logiciel de choix. </li><li> Convertir les différents spectres en ASCII, mzXML, format mzML pour la lecture de plusieurs logiciels différents, 28 -. 31 ou exporter les données comme un Analyser (.img) de format, un format couramment utilisé pour d&#39;autres applications d&#39;imagerie telles que l&#39;IRM 32 Deux options open-source pour l&#39;analyse sont MSiReader et BioMap 32,33. </li><li> Une fois les fichiers sont exportés dans un format lisible par le logiciel, charger l&#39;ensemble de données via les instructions du logiciel respectif. Après le chargement, effectuer un traitement post-acquisition, comme l&#39;enlèvement de base et de la normalisation. </li><li> Avec cet ensemble de données, effectuer des statistical traitements tels que l&#39;analyse en composante de classification hiérarchique en utilisant des scripts ou construites dans les algorithmes des logiciels tels que Matlab 18 personnalisés. </li></ol></li></ol>

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	<li>Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., R&#246;mpp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+imaging.">Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging.</a> Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).</li><li>Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-FTICR+imaging+mass+spectrometry+of+drugs+and+metabolites+in+tissue.">MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue.</a> Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).</li><li>Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+drug+candidates+in+tissue+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry.">Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).</li><li>Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+molecular+analysis+of+whole-body+animal+tissue+sections+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).</li><li>Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).</li><li>Guenther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology+by+mass+spectrometry:+label-free+tissue+characterization+obtained+from+high-accuracy+bioanalytical+imaging.">Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).</li><li>Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+mass+spectrometry--looking+beyond+classical+histology.">Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. a., Kreutz, M., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids:+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+to+study+tumour+biology.">Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology.</a> Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).</li><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li><li>Fernandes, T. G., Kwon, S. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate.">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li><li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+three-dimensional,+microarray+environment+on+human+cell+culture+in+drug+screening+systems.">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).</li><li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry:+From+tissue+sections+to+cell+cultures.">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li><li>Li, H., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+three-dimensional+cell+culture+systems.">Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems.</a> Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).</li><li>Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Therapeutics+in+Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry.">Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).</li><li>Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Confocal+Raman+Microscopy+for+Studies+of+Three-Dimensional+Cell+Culture+Sections.">Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections.</a> Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).</li><li>Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multizone+paper+platform+for+3D+cell+cultures.">Multizone paper platform for 3D cell cultures.</a> PloS one. 6 (5), 18940 (2011).</li><li>Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. a. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+protein+in+3D+neural+stem+cell+culture:+a+hybrid+visualization+methodology.">Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology.</a> J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).</li><li>He, W., Kuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Comparison+of+3D+and+2D+Glioma+Models+Reveals+Increased+HLA-E+Expression+in+3D+Models+is+Associated+with+Resistance+to+NK+Cell-Mediated+Cytotoxicity.">Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).</li><li>Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometric+Imaging+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).</li><li>DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).</li><li>Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+paper+based+tissue+washing+method+for+mass+spectrometry+imaging:+localized+washing+and+fragile+tissue+analysis.">An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).</li><li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Sublimation/Recrystalization+for+Imaging+Proteins+by+Mass+Spectrometry+at+High+Spatial+Resolution.">Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).</li><li>Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+protein+sensitivity+for+MALDI+imaging+mass+spectrometry+after+chemical+treatment+of+tissue+sections.">Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).</li><li>Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-mass+spectrometric+imaging+for+the+investigation+of+metabolites+in+Medicago+truncatula+root+nodules.">MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules.</a> J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).</li><li>Deutsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML:+a+single,+unifying+data+format+for+mass+spectrometer+output).">mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output).</a> Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).</li><li>Pedrioli, P. G. a., Eng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research.">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li><li>Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+mzXML+good+for.">What is mzXML good for.</a> Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).</li><li>Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+the+data+explosion.+A+report+on+the+HUPO-PSI+Workshop.+August+2008,+Amsterdam,+The+Netherlands.">Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands.</a> Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction.</a> Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).</li></ol>

This article is part of a special issue on Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsored by Bruker Biospin. The MALDI-TOF system used to obtain the representative results is a Bruker AutoFlex III.

En utilisant les procédés décrits ci-dessus, les cultures cellulaires peuvent être cultivées en 3D et analysés par MALDI-MSI. Beaucoup de lignées cellulaires immortalisées seront former des structures 3D lorsqu&#39;elles sont cultivées de façon appropriée. 9,10 Il faut prendre soin de cultiver des cellules qui ne ont pas été transmis trop de fois, ce est avoir un faible nombre de passages. En général, les cellules ayant les numéros de passage de dix et inférieur sont optimales pour des cultures de cellules en croissance 3D. La croissance des cultures de cellules en 3D dans un support traditionnel agarose fournit un moyen rentable pour les groupes de recherche intéressés par la culture cellulaire 3D pour essayer ce système. Cette méthode utilise peu de composants ne sont pas déjà dans la plupart des laboratoires de mammifère en culture cellulaire. Une attention particulière doit être accordée à la préparation des plaques d&#39;agarose pour la croissance afin que les cultures de cellules 3D sont compatibles en taille et en forme; certains aspects qui nécessitent une attention particulière comprennent la vérification qu&#39;aucune des bulles d&#39;air sont piégées dans le mélange et en ce qu&#39;un ménisque appropriée est formée au fond de chaque well. Si le ménisque ne se forme pas correctement, les cellules peuvent croître dans des formes non sphéroïde ou en petits amas. De plus, il faut prendre soin de ne pas placer dans le PBS gélatine avec les sphéroïdes. Si cela se produit, enlever le PBS à partir du haut de la gélatine en utilisant une pipette de 200 pi. Si le coût ne est pas un facteur, ultra-faible plaques à fond rond contraignantes sont commercialement disponibles et offrent la simplification de ces étapes. Bien que d&#39;autres méthodes d&#39;incorporation de tissu peuvent également être coûteux et spectrométrie de masse non-compatible, la gélatine-enrobage a été démontré à la fois peu coûteux et versatile. stratégies de préparation décrites ci-dessus ont été optimisés pour les cultures cellulaires 3D pour obtenir des données de la plus haute qualité. Alors que la gélatine-enrobage a été montré pour être compatible avec l&#39;analyse par spectrométrie de masse, ce processus fait rétrécir les matrices disponibles en raison de co-cristallisation. Une fois congelés, les cultures de cellules en 3D sont stables pendant des mois tant qu&#39;ils ne sont pas congelé et décongelé. La gélatine devient opaque quand ils sont gelés, et la cellule 3Dcultures sont d&#39;une couleur similaire, il est donc conseillé avant de les congeler pour documenter la 3D placement de culture cellulaire pour aider à trancher. Lors de la préparation des diapositives, la matrice peut être appliquée à plusieurs méthodes différentes, mais il convient de noter que certaines matrices ont été trouvées de co-cristalliser avec de la gélatine, tel que l&#39;acide férulique, rendant l&#39;échantillon inutilisable. Les petits cristaux de matrice produisent des spectres de masse plus cohérente. Alors que handspotting est la méthode la plus simple d&#39;application de la matrice, le plus grand volume de solvant peut entraîner de plus grandes tailles de cristal et de la migration de l&#39;analyte significatif. Au spectromètre de masse, les progrès dans les technologies MALDI-MSI ont réduit l&#39;expertise nécessaire pour les analyses début. L&#39;acquisition et l&#39;analyse des données est simple sur la plupart des systèmes, permettant même un novice d&#39;obtenir des informations de haute qualité à partir de diapositives ITO. Une sélection rigoureuse des paramètres de l&#39;appareil, à proximité optimisé sur non-image 3D digne cellule cultures, est essentielle pour obtenir des données de haute qualité. Par exemple, l&#39;augmentation de la puissance du laser peut augmenter l&#39;intensité de pointe, mais la baisse du pouvoir laser peut améliorer la résolution et de donner les formes des pics plus symétriques. Cultures de cellules en 3D doivent être utilisés rapidement après la coupe pour assurer la qualité optimale de l&#39;échantillon. Dégradation de signal de la protéine peut être vu en moins d&#39;une semaine sans stockage approprié (dessiccateur / -80 ° C congélateur), en particulier dans la région de masse élevée (supérieure à 20 kDa). En raison de la demande croissante, de nombreux logiciels de visualisation différents ont été développés et sont gratuits pour le public de recherche. La plupart des spectromètres de masse d&#39;imagerie ont installé le logiciel nécessaire pour visualiser les masses simples avec les formats propriétaires utilisés sur chaque instrument. Ces logiciels peuvent être utilisés pour obtenir des images de masse unique et exporter les données. La plupart des logiciels permettra également la superposition de deux ou plusieurs masses d&#39;intérêt. En outre, de nombreux téléspectateurs différents pour les données MSI sont téléchargeables gratuitement, comme un MSiReaderd BioMap. 32,33 Les données de spectrométrie de masse obtenus peuvent également être traitées post-acquisition avec facilité, apportant des informations plus utiles à l&#39;avant-garde. Des produits pharmaceutiques à des lipides des protéines, le système décrit ci-dessus permet l&#39;acquisition rapide de données pour évaluer la distribution de molécules d&#39;intérêt à travers une structure de culture de cellules 3D. Des coupes en série peuvent être prises pour l&#39;image entière de la structure 3D de la construction à partir de chaque image en 2D d&#39;une tranche de la culture de cellules 3D. Les techniques et les notes dans le protocole seront utiles aux chercheurs désireux de commencer la culture de cellules en trois dimensions comme un pont entre culture monocouche et des modèles animaux. Une fois maîtrisé, ces techniques peuvent être appliquées à de multiples types de cultures 3D de cellules, les tissus et les cultures de cellules, permettant aux chercheurs de l&#39;image selon échantillons qu&#39;ils choisissent.

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1&#8211;4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5&#8211;7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8&#8211;11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12&#8211;14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15&#8211;21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-247</td>
			<td>Potential hazard, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin, unflavored</td>
			<td>Knox</td>
			<td>--</td>
			<td>Available at most grocery stores in single-packets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITO-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Limited</td>
			<td>CG-90IN-S115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sinapic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set</td>
			<td>RoyalMax Airbrush</td>
			<td>--</td>
			<td>Many options available on sites such as Amazon.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3d cell culture models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

MSI imagerie a le potentiel de révéler beaucoup distribution moléculaire différente dans des cultures de cellules 3D. En utilisant la méthode décrite ci-dessus, les espèces de petites molécules (figure 1) à de grandes protéines (Figure 2) peuvent être suivis à travers la culture. Ces résultats montrent la visualisation d&#39;un seul ion avec l&#39;outil MSiReader libre. 32 Les résultats peuvent être analysés pour les ions uniques d&#39;intérêt dans la culture cellulaire 3D avec un logiciel de visualisation, soit dans une région d&#39;intérêt ou la totalité de la région balayée. En outre la plupart des logiciels de visualiser automatiquement ions dessus d&#39;un certain seuil fixé par l&#39;utilisateur, ce qui peut aider les efforts de découverte. Une fois les cartes d&#39;ions uniques sont obtenus, la plupart des logiciels comprend une possibilité de superposer les images pour voir la colocalisation des ions. Soit dans la découverte approches fondées ou de manière ciblée, l&#39;imagerie par spectrométrie de masse est un outil puissant pour analyser les cultures de cellules 3D. Figure 1. Les résultats représentatifs de 3D ​​croissance de culture de cellules et de sectionnement. Gauche) de l&#39;image optique d&#39;une structure de culture de cellules intactes colorectal HCT-116 en 3D tel que vu à 14 jours avant la récolte. Droite) optique de l&#39;image d&#39;une tranche d&#39;environ équatoriale d&#39;une 3D dégel de culture cellulaire colorectal monté sur une glissière ITO pour l&#39;imagerie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Figure 2. Les résultats représentatifs de petite molécule MALDI-MSI d&#39;une section équatoriale d&#39;une culture cellulaire 3D. Haut) de spectres de masse moyenne obtenue avec α-CHCA dans la gamme faible masse (petite molécule). Bas) images représentatifs deune seule masse: 327,8 m / z principalement localisée à l&#39;intérieur de la culture de la cellule 3D et 429,7 m / z principalement localisé sur le bord de la culture de cellules 3D. La ligne pointillée indique le bord approximative du sphéroïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Figure 3. Les résultats représentatifs de l&#39;imagerie des protéines par MALDI-MSI d&#39;une section équatoriale d&#39;une culture cellulaire 3D. Haut) de spectres de masse moyenne atteint avec de l&#39;acide sinapique dans le supérieur (gamme de protéines) de masse. Bas) représentatifs des images d&#39;une seule masse: 10 871 m / z principalement localisé sur le bord de l&#39;ellipsoïde, et 12 184 m / z localisée plus vers l&#39;intérieur de l&#39;ellipsoïde. La ligne pointillée indique le bord approximative du sphéroïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Des lignées cellulaires de cancer immortalisées peuvent être cultivées sous forme de cultures de cellules 3D, un modèle précieux pour la recherche biologique. Ce protocole décrit imagerie par spectrométrie de masse des cultures de cellules 3D, y compris l&#39;amélioration de la plate-forme de préparation de l&#39;échantillon. L&#39;objectif de ce protocole est de demander aux utilisateurs de préparer des cultures cellulaires 3D pour la masse analyse de l&#39;imagerie par spectrométrie.

Exemple Stratégies Préparation de Spectrométrie de Masse Imagerie de culture cellulaire 3D Modèles

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.0K vues.  University of Notre Dame.  Des lignées cellulaires de cancer immortalisées peuvent être cultivées sous forme de cultures de cellules 3D, un modèle précieux pour la recherche biologique. Ce protocole décrit imagerie par spectrométrie de masse des cultures de cellules 3D, y compris l'amélioration de la plate-forme de préparation de l'échantillon. L'objectif de ce protocole est de demander aux utilisateurs de préparer des cultures cellulaires 3D pour la masse analyse de l'...

Vidéo: Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Recherche

Bio-ingénierie

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Préparation de la 3D pour les applications de fibrine Échafaudages CULTURE DE CELLULES SOUCHES

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imagerie des tissus biologiques par désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selective Cellule élimination de Mixed Culture 3D en utilisant une technique proche infrarouge Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Corps entier Spectrométrie de masse d&#39;imagerie par infrarouge laser assistée par matrice désorption Electrospray Ionisation (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Establishing the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

To begin, take the pellet of the GFP-HUVECs grown to a confluence level of 80 to 100%and resuspend the cells in an appropriate volume of basal medium to achieve a concentration of one times 10 to the seventh cells per milliliter of stock solution. Prepare 50-milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors. Add the GFP-HUVECs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per microliter.Then aspirate the medium from the plate containing the stromal monoculture and add 200 microliters per well of the prepared GFP-HUVECs suspension. Incubate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere, changing the medium every three to four days. Monitor the development of the culture by bright-field and fluorescence microscopy using a five times objective.Differences between the cultures could be observed from the bright-field and fluorescence images showing only the GFP-HUVECs. The cultures appeared less developed without any growth factor, However, faster development was observed in the presence of FGF-2. In contrast, the bright-field images showed the densest cultures in the presence of BMP-2.However, vascular like networks formed in both growth factor-containing conditions and the most extensive and interconnected networks were formed with FGF-2.

Mise en place de la co-culture 3D de cellules stromo-endothéliales

Génération évolutive de sphéroïdes cellulaires uniformes à l’aide d’un dispositif d’assemblage acoustique 3D

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Pleins feux sur l’auteur : Développement d’une méthode d’assemblage acoustique sans échafaudage pour la culture de sphéroïdes cellulaires 3D de haute qualité 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dispositif d’assemblage acoustique tridimensionnel pour la fabrication en série de sphéroïdes cellulaires

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...