This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

이미징 1. 3 차원 세포 배양 및 준비 <ol><li> 적절한 배양 세포주, 즉, HCT116 결장암 세포 라인, 2 차원 단층 배양에서. </li><li> 일반적으로 몇 일이 소요 50~70%의 자랄, 때까지 5 % CO 2 배양기에서 + 10 % 소 태아 혈청 맥코이의 5A 미디어와 T-25 플라스크에 HCT 116 세포를 성장. </li><li> 0.25 % 트립신 EDTA 용액으로 분리하고 세포를 이용하여 혈구 세포의 일부를 카운트하고 세포 밀도와 생존을 확인하기 위해 트리 판 블루 염색. </li><li> 카운팅 후 / 웰의 세포를 6,000 적절한 파종 밀도를 달성하기 위해 세포를 완전 배지로 희석, 또는 30,000 세포 / ml. </li></ol> 2. 아가로 오스 96 웰 플레이트를 코팅를 준비 <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브 표준 용지 10 ㎖ (미디어 1.5 % 아가로 오스 용액) 10 아가로 오스의 0.19 g을 추가합니다. 부드러운 혼합하여 통합을 확인합니다. 수욕 아가 압력솥20 분. </li><li> 평평한 바닥 96 웰 플레이트 문화 판의 60 중앙 우물에, 아가로 오스 + 미디어 혼합물의 대기음 50 μl를 멀티 채널 피펫을 사용. 판의 주변 가장자리에 우물이 약간 더 높은 증발 요금을 제공하고 있으므로, 200 μL 1X 인산염 완충 식염수 (PBS) 대신이 가장자리에 아가로 오스를 추가합니다. </li><li> 아가 혼합물 내부 웰에 추가되면, 옆으로 냉각 플레이트 세트 ~ 37 세포의 추가하기 전에 C를 °. </li></ol> 3. 씨와 3 차원 문화 경향 주 : 더 많거나 더 적은 세포가 관여 문화의 요구 사항에 따라 시드 할 수도 있지만, 이러한 조건은 배양 10-14 일 후에 직경 1mm 정도의 3D 세포 배양 구조 초래할 것으로 판정되었다 (데이터 미기재) . <ol><li> 해당 셀 솔루션의 200 μl를 추가로 (~ 6000 세포를 포함 희석) 아가로 오스 코팅96 웰 플레이트. 커버 플레이트 및 세포 성장 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 설정. </li><li> 세포 매체마다 48 시간의 최소 변경, 또는 미디어가 나타날 때 색상을 변경합니다. <ol><li> 조심스럽게 아가로 오스의 하단에 (하루 2 육안으로) 작은 3 차원 세포 배양 주위에서 이전 미디어를 흡입하여 미디어를 변경합니다. 부드럽게 3D 세포 배양을 통해 새로운 매체의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 이러한 미디어 변경시 (선택 단계), 테스트를 위해 화학 요법 또는 다른 약물을 추가합니다. 전체 미디어와 최종 농도 선택의 약물을 희석하고, 각 웰에 필요한 200 μl를 추가합니다. </li><li> 3D 세포 배양 직경 약 1mm가 될 때까지, 광학 현미경으로 3 차원 세포 배양 증가를 모니터링. </li></ol></li></ol> 4. 수확 3D 세포 배양 <ol><li> 부드럽게 아가로 오스의 침대에서 3D 세포 배양을 제거하기 위해 2 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다. </li> &lt;리&gt; 부드럽게 대기 24 웰 플레이트에서 약 1 ml의 PBS로 피펫 팅하여 PBS로 3 차원 세포 배양을 씻으십시오. </li><li> 전송 단백질 또는 대사 추출 원심 분리 튜브에 피펫을 통해 3D 혈청 세포 배양을 수확하거나는 이미징 애플리케이션을위한 슬라이싱 돕기 위해 절단 매체에 임베드. </li></ol> 젤라틴 5. 퍼가기 3D 세포 배양 <ol><li> 고순도 물 ~ 175 ㎎ / ㎖ 젤라틴 용액을 준비합니다 (18 MΩ 선호). (22, 23)는 적극적으로 젤라틴을 섞는다. 점성 및 조작하기 어려워지고 솔루션을 관찰한다. 용액 대기음 손쉽게 분명해질 때까지 ~ 60 ° C에서 수욕 젤라틴 함유 원뿔 관을 삽입하고 따뜻한. 참고 : 따뜻한 젤라틴 용액의 온도가 내려 가면으로 빠르게 경화, 급속히 동결하기 전에 다음 단계를 모두 수행합니다. </li><li> 이 가열 된 후, 세포 배양 후드 즉시 젤라틴 걸릴. BEA에서 젤라틴으로 튜브를 유지약 60에서 데워진 물 KER 젤라틴 용액의 경화를 방지하기 위해 C를 °. </li><li> 2 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 24 바닥이 평평한 판의 우물에 따뜻한 젤라틴 용액 0.6 ml에 입금. 이 볼륨은 얇은 층 바닥을 커버하기에 충분하다. 부드럽게 즉시 3D 구조를 파열 피하기 위해 다른 2 ㎖를 피펫을 사용하여 젤라틴 층의 상부에 3 차원 세포 배양을 침착. 참고 : 케어는 젤라틴으로 PBS를 배치하지이 단계에서주의해야합니다. 이 경우, 그러나, 200 μL 피펫을 사용하여 젤라틴의 상부로부터 PBS를 제거. </li><li> 3D 세포 배양은 젤라틴 층의 표면에 배치 된 후 배양의 위치를​​ 방해하지 않도록주의해서, 3 차원 세포 배양을 통해 따뜻한 젤라틴 혼합물을 또 다른 0.6 ㎖를 피펫. 두번째 층이 배치 된 후에, -80 ° C에서 젤라틴 매립 차원 세포 배양을 동결. </li></ol> 6. 조각과 해동 마운트 번째전자 질량 분석 이미징을위한 3 차원 세포 배양을 젤라틴 내장 <ol><li> 냉동실에서 3 차원 세포 배양을 포함하는 24 웰 플레이트를 제거합니다. 트위터 나 메스가 잘의 측면 아래로 부드럽게 미끄러 때까지 손에서 열 함께 접시의 바닥을 따뜻하게. </li><li> 부드럽게 중심을 해동하지 않고 젤라틴을 확보, 트위터 또는 메스를 밀어 넣습니다. 저온 유지 장치 지원에 물 한 방울을 가지고 지원 젤라틴 디스크를 부착 할 때 사용합니다. <ol><li> 젤라틴에 포함 된 3 차원 세포 배양은 -30 ° C에서 슬라이스에 가장 의무가 있습니다. 사용하기 전에 70 % 에탄올로 저온 유지 장치 블레이드와 유리를 청소합니다. 블레이드 또는 블레​​이드의 둔하게 방지하기 위해 각 3D 세포 배양 젤라틴 디스크의 새로운 블레이드의 다른 부분을 사용합니다. </li></ol></li><li> 3 차원 세포 배양이 표시 될 때까지 저온 유지 장치를 사용하여 부드럽게 초과 젤라틴을 직면하고있다. </li><li> 이 시점에서 천천히 12 ~ 16 μm의 섹션에서 부드러운 움직임과 3D 세포 배양 슬라이스. 주 : 슬라이싱에 중요한 요인이므로 이들 모두 일관된 결과를 보장하기 위해 점검해야 블레이드 유리의 거리, 날개 각, 저온 유지 장치의 온도, 지지체 상에 디스크의 각도를 포함한다. </li><li> 조심스럽게 조각을 해동하고 적절하게 레이블 인듐 티타늄 산화물 (ITO) 코팅 된 유리 슬라이드에 그들을 탑재하고 데시 케이 터에 보관하십시오. 최대 품질을 가능한 한 빨리 조각을 사용합니다. </li></ol> MALDI 이미징 7. 매트릭스 응용 프로그램 및 샘플 준비 <ol><li> MALDI 이미징에 앞서, 적절한 매트릭스와 슬라이스를 준비한다. <ol><li> 작은 분자 분석의 경우, 세척 단계는 일반적으로 필요하지 않습니다. 그대로 단백질 검출을 위해, 차가운 100 % 아세톤의 조각을 씻어 Carnoy의 유체, 또는 70 % / 95 % 이소프로판올는 신호를 마스크 할 수 지질으로 작은 분자를 제거하기 위해 24 일 -. (26) </li><li> 부드럽게 한 번에 더 이상 30 초 동안 세척한다. 하지 마십시오어떤 조각을 방해합니다. </li></ol></li><li> 0.1 % TFA와 함께, 유기 용매 및 물의 용액에 매트릭스를 준비한다. 이러한 α - 시아 노 -4- 히드 록 시신 남산 (CHCA)와 같은 작은 분자를 들어, 60 % ACN을 사용 : 40 % H 2 O : 0.1 % TFA (10 ㎎ / ㎖). 단백질 검출을위한 이러한 sinapic 산 (30 ㎎ / ㎖)로서, 동일한 용매 용액을 사용한다. sinapic 산 최적의 용해도를 들면, TFA의 첨가하기 전에 먼저 용해 아세토 니트릴 : H 2 O 용액. 다른 행렬이 적절하게 사용될 수있다. 주 : 매트릭스는 여러 가지 방법이 적용될 수 있지만, 어떤 행렬이 불가능한 시료 렌더링, 예컨대 페룰 산 젤라틴과 협력 crystalize 밝혀졌다 주목해야한다. 작은 결정이 감지 및 생물학적 차이보다는 매트릭스 효과에 기인하기 위해 더 많은 분자 종을 허용, 더 일관성 질량 스펙트럼을 생산하고 있습니다. </li><li> 방법을 handspotting에 의해 행렬을 적용합니다. <ol><li> MATR의 0.5 μl를 적용 할 뾰족한 주사기를 사용하여IX의 3 차원 세포 배양 슬라이스 용액과 매트릭스 crystalize 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 또한, 에어 브러쉬 방법을 사용합니다. 매트릭스 솔루션을 상용 등급의​​ 에어 브러쉬를 입력합니다. <ol><li> 8-12 인치 (5 cm) 슬라이드에서 분무기를 잡고 조각에서 미세한 스프레이를 목표로하고 있습니다. 패스 사이에서 1 분 최고 결정 형성을 허용하는 행렬을 건조 할 수 있습니다. 에어 브러쉬의 최대 10 ~ 20 패스는 매트릭스 (22)의 최적의 층을 생성하는 데 필요합니다. </li></ol></li><li> 대안 적으로, 승화 법은 다른 상세 설. 25, 27 </li><li> 매트릭스없이 애플리케이션의 종래 방법의 MALDI-MSI에 적어도 30 분 동안 데시 케이 터에서 건조 슬라이드. 25 </li></ol> MALDI-TOF 시스템을 사용하여 8 MALDI-MSI 분석 (즉, AutoFlex III) 참고 :이 섹션은 MALDI-TOF 이미징 실험에 대한 매개 변수를 설정하기위한 지침과 조언이 포함되어 있습니다. 기능에 따라trument 제조 업체 및 소프트웨어 사용, 프로세스는 다를 수 있습니다. <ol><li> 안전하게 이미지에 ITO 코팅 된 슬라이드에 부착 된 3 차원 세포 배양 조각을 75mm × 25 mm 슬라이드를 개최했다 어댑터에 슬라이드를 장착한다. 악기에 슬라이드 어댑터를로드합니다. </li><li> 문제의 질량 범위에 대한 적절한 교정 표준을 선택하여 MALDI-MSI의 악기를 준비합니다. 소분자의 심문 사용될 매트릭스, α-CHCA 대응 검출 신호는, 하나의 공통의 캘리 그룹이다. 단백질의 분석을 위해, 관심있는 범위에서 공지 된 질량 기준 단백질 (즉, 유비퀴틴, 트립 시노 겐)이 선택되고 같은 캘리 3D 세포 배양에 인접하여 발견된다. 방법 개발을 진행하기 전에 악기를 보정합니다. </li><li> 촬상 이전에, 기기 제조업체가 제공하는 소프트웨어를 이용하여 원하는 질량 범위에 대한 데이터 수집 방법을 개발. 참고도 1 및 2작은 분자 및 단백질 촬상. 작은 분자 이미징의 경우, 가장 높은 질량 해상도 모드를 reflectron 사용합니다. <ol><li> 100 ~ 1000 m / Z 사이 8,000- 25,000m / Z 사이의 단백질 작은 분자 데이터 수집을위한 질량 범위를 조정합니다. 악기와 가장 높은 질량 분해능을 제공하면서 선택의 영역을 포함하는 질량 범위를 조정합니다. </li><li> 레이저 파워, 주파수 보정 용액과 가까운 &#39;희생&#39;차원 세포 배양을 이용하여 레이저 조각 샷과 스폿 사이즈의 수를 조정한다. 주요 기기 제어 소프트웨어에서 이러한 설정을 확인하십시오. 60 % 전력, 400 레이저 샷, 초소형 스팟 사이즈 : 추천 시작 지점으로 다음과 같은 설정을 사용합니다. 이러한 설정은 장치 및 방법에 따라 다르며, 각각의 특정 악기 고품질 스펙트럼을 수득 기기 파라미터를 최적화한다. 조절 될 수있는 다른 파라미터는 검출기 이득, 샘플 레이트, 및 전자 이득을 포함한다. 에스이미징 소프트웨어에 사용하기 위해이 방법을 집결지 (예., 자동 실행 방법은 FlexImaging가에 그리는 것). 참고 : 검출을 방해하지 않도록 관심의 질량 범위 아래 억제 이온 (다시 장비 제어에 있음). </li><li> 선택의 질량 범위 단백질 데이터 수집 방법을 개발. 위에 설명 된 동일한 단계를 수행하지만, 중간에 높은 질량 범위에 대해 약 3 kDa의 위, 선형 모드를 사용합니다. 참고 : 설정 작은 분자 방법에 사용되는 것과 다릅니다. </li></ol></li><li> 이러한 MALDI-TOF 브루 커 시스템 FlexImaging 같은 기기 제조사가 제공하는 영상 소프트웨어를 사용하여 특정 MS 설치 구 파라미터. <ol><li> 방법 이전의 개발 및 저장을 사용하여 새 이미지 파일과 폴더를 만듭니다. 래스터 자리 (단계 8.3.2 또는 8.3.3에 설치) 기기의 제어 방법을 설정 크기 (약 200 μm의 50 μm의 기본에서 변경) 및 포지 등의 악기 매개 변수를 선택3D 세포 배양 스캐닝하도록 기. </li><li> 차례로 각각에 레이저를 이동, 샘플에 세 적절한 가르쳐 포인트를 선택합니다. &#39;인쇄 화면&#39;을 사용하여 MALDI-TOF 레이저 제어 소프트웨어의 광학 사진을 얻습니다. 주 : 많은 이미징 소프트웨어 프로그램 &#39;티치&#39;스캐너 또는 종종 카메라 기기를 얻을 수있다 레이저가있는 소프트웨어에 시료의 광학 사진을 필요로한다. </li></ol></li><li> 이어서 이미징 소프트웨어 (안 기기 제어)에서 촬영 처리를 시작하고 각 슬라이스에서 질량 스펙트럼을 획득. 특정 지역에 현지화 된 대부분의 3 차원 세포 배양에서 대중과 다른 사람을 관찰한다. </li></ol> 9. 옵션 데이터 분석 방법 <ol><li> 표적 분석을 위해, 평균 질량 스펙트럼을 클릭하여 스펙트럼의 수동 분석을 수행하거나 (촬상 소프트웨어가 자동으로 특정 임계치를 초과하여 질량을 선택할 수 있도록 예를 들어., AB 봉우리) 상위 20 %의 임계 값을 비켜. 품질 관리 매트릭스 피크 분포 또는 평균 스펙트럼을 조사한다. </li><li> 이러한 R 또는 matlab에 수학적 소프트웨어에서 추출 된 데이터 세트와 통계 분석을 수행합니다. <ol><li> 선택의 소프트웨어에로드하는 ASCII 형식으로 읽을 수있는 텍스트 파일에 수출 단일 스펙트럼. </li><li> 여러 가지 소프트웨어 프로그램에 의해 28 읽는 mzML 형식의 ASCII, mzXML에 개별 스펙트럼을 변환 -. (31) 또는 분석 (.IMG) 형식의 파일, MRI와 같은 다른 이미징 애플리케이션에 사용되는 일반적인 형식으로 데이터를 내보낼 (32) 분석을 위해 두 오픈 소스 옵션 MSiReader 및 BioMap (32, 33)이다. </li><li> 파일이 소프트웨어에서 읽을 수있는 형식으로 내 보낸 후, 각각의 소프트웨어의 지침을 통해 데이터 집합을로드합니다. 로딩 후, 같은 기준 제거 및 정규화 (normalization), 취득 후 처리를 수행합니다. </li><li> 이 데이터 집합으로, 쓰레딩을 수행이러한 Matlab과 18로 소프트웨어 알고리즘에 내장 된 사용자 정의 스크립트 또는를 사용하여 계층 적 클러스터링의 주성분 분석과 같은 stical 치료. </li></ol></li></ol>

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M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometric+Imaging+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).</li><li>DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).</li><li>Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+paper+based+tissue+washing+method+for+mass+spectrometry+imaging:+localized+washing+and+fragile+tissue+analysis.">An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).</li><li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Sublimation/Recrystalization+for+Imaging+Proteins+by+Mass+Spectrometry+at+High+Spatial+Resolution.">Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).</li><li>Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+protein+sensitivity+for+MALDI+imaging+mass+spectrometry+after+chemical+treatment+of+tissue+sections.">Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).</li><li>Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-mass+spectrometric+imaging+for+the+investigation+of+metabolites+in+Medicago+truncatula+root+nodules.">MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules.</a> J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).</li><li>Deutsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML:+a+single,+unifying+data+format+for+mass+spectrometer+output).">mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output).</a> Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).</li><li>Pedrioli, P. G. a., Eng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research.">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li><li>Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+mzXML+good+for.">What is mzXML good for.</a> Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).</li><li>Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+the+data+explosion.+A+report+on+the+HUPO-PSI+Workshop.+August+2008,+Amsterdam,+The+Netherlands.">Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands.</a> Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction.</a> Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).</li></ol>

This article is part of a special issue on Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsored by Bruker Biospin. The MALDI-TOF system used to obtain the representative results is a Bruker AutoFlex III.

위에서 설명한 방법을 사용하여 3 차원 세포 배양 및 성장 MALDI-MSI 분석 될 수있다. 때 적절. 9,10- 용품, 즉, 너무 많은 시간을 전달 통로 낮은 번호가되지 않은 세포를 배양하기 위해 취해 져야한다 배양 많은 불멸화 세포주를 3 차원 구조를 형성 할 것이다. 일반적으로, 10 및 하부 통로의 숫자와 함께 세포는 3 차원 세포 배양을위한 최적의 성장이다. 전통적인 아가 지원 3D 세포 배양 성장은이 시스템을 시도하는 3 차원 세포 배양 연구에 관심이있는 그룹을위한 비용 효율적인 방법을 제공한다. 이 방법은 없습니다 이미 대부분의 포유 동물 세포 배양 실험실에서 몇 가지 구성 요소를 사용합니다. 세심한주의가 성장을위한 아가로 오스 판의 준비에 지불해야하는 3 차원 세포 배양은 크기와 모양에 일치되도록; 주의를 필요로하는 일부 양상들은 기포가 혼합물과 적절한 메 니스 커스가 각 w 저부에 형성되어있는 것을 포획되지되는지 확인할엘. 메 니스 커스가 정상적으로 형성되지 않는 경우, 세포는 비 회전 타원체 형상 또는 작은 덩어​​리로 성장할 수있다. 또한,주의가 회전 타원체와 젤라틴으로 PBS를 배치하지 않도록주의해야합니다. 이 경우, 200 μL 피펫을 사용하여 젤라틴의 상단에서 PBS를 제거합니다. 비용 인자가 아닌 경우, 초저 결합 둥근 바닥 판은 시판되고 다음 단계의 단순화를 제공한다. 다른 조직 매립 방법은 고비용 및 비 질량 분석 호환 될 수 있지만, 젤라틴 임베딩 저렴하고 다양한 양쪽 것으로 밝혀졌다. 3D 세포 배양은 최고 품질 데이터를 획득하기 위해 위에서 설명한 제조 전략을 최적화되었다. 젤라틴 임베딩 질량 분광 분석과 호환되도록 도시 하였지만, 이러한 과정으로 인해 공동 결정화 가능한 매트릭스를 좁힐 않는다. 냉동 후에, 3 차원 세포 배양은 그들이 동결 해동하지 않는 한 달 동안 안정하다. 젤라틴 냉동 때 불투명하게하고, 3 차원 셀문화는 비슷한 색상의, 그래서 그것은 분할에 도움이 3D 세포 배양 배치를 문서로 동결하기 전에 것이 좋습니다. 슬라이드를 제조하는 경우, 행렬은 여러 가지 방법이 적용될 수 있지만 어떤 행렬 못할 샘플 렌더링, 예컨대 페룰 산 젤라틴과 협력 crystalize 발견되었다는 것을 주목해야한다. 작은 매트릭스 결정의 일관성 질량 스펙트럼을 생산하고 있습니다. handspotting 매트릭스 애플리케이션의 가장 간단한 방법이지만, 더 큰 용매 부피는 더 큰 결정 크기 및 상당한 검체 이동 될 수있다. 질량 분석기에서 시작 분석에 필요한 전문 지식을 감소 MALDI-MSI 기술의 발전. 데이터 수집 및 분석을 ITO 코팅 된 슬라이드로부터 고품질의 정보를 얻을 초보자도 허용 대부분의 시스템에 간단하다. 근처의 이미지가 아닌 가치있는 3D 셀이 배양에 최적화 된 기기의 매개 변수를주의 깊게 선택,ES, 고품질의 데이터를 얻는데 중요하다. 예를 들면, 레이저 파워의 증가는 피크 강도를 증가시킬 수 있지만, 레이저 파워를 낮추면 해상도를 더 향상시키고 피크 대칭 형상을 부여 할 수있다. 3D 세포 배양 샘플 최적의 품질을 보장​​하기 위해 나눈 다음, 신속하게 사용되어야한다. 단백질 신호의 저하는 (20 kDa의 이상), 특히 높은 질량 영역에서, 적절한 보관 (데시 케이 / -80 ° C 냉장고)없이 일주일 이내에 볼 수있다. 수요 증가로 인해, 많은 다른 시각화 소프트웨어 프로그램 개발 및 연구 공용 자유롭게되었다. 대부분의 이미징 질량 분석기는 각각의 기기에서 사용하는 고유의 형식으로 하나의 질량을 시각화하는 데 필요한 소프트웨어를 설치했습니다. 이러한 소프트웨어 프로그램은 데이터를 단일 질량 이미지를 획득하고 익스포트 할 수있다. 대부분의 소프트웨어는 또한 관심의 두 개 이상의 대중의 오버레이를 허용합니다. 또한, MSI 데이터에 대한 많은 다른 시청자는 MSi​​Reader의로, 무료로 다운로드 할 수 있습니다D BioMap. 또한 최전선에 더 많은 유용한 정보를 데리고 쉽게 취득 후 처리 될 수 있습니다 얻은 32, 33 질량 분석 데이터는. 지질 단백질에 제약으로부터, 위에서 설명한 시스템은 3 차원 세포 배양 구조 걸쳐 관심 분자의 분포를 평가하기위한 데이터의 빠른 획득을 허용한다. 직렬 섹션에서는 3D 세포 배양의 조각의 각각의 2D 이미지에서 구축하여 이미지에 전체 3D 구조를 취할 수 있습니다. 프로토콜의 기술 및 메모 단층 문화와 동물 모델 사이의 다리 세 가지 차원 세포 배양을 시작하고자하는 연구자들에게 유용 할 것입니다. 마스터되면, 이들 기술들은 선택하든 샘플 화상 연구자 있도록 3D 세포 배양, 조직 및 세포 배양의 여러 유형에 적용될 수있다.

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1&#8211;4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5&#8211;7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8&#8211;11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12&#8211;14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15&#8211;21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-247</td>
			<td>Potential hazard, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin, unflavored</td>
			<td>Knox</td>
			<td>--</td>
			<td>Available at most grocery stores in single-packets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITO-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Limited</td>
			<td>CG-90IN-S115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sinapic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set</td>
			<td>RoyalMax Airbrush</td>
			<td>--</td>
			<td>Many options available on sites such as Amazon.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3d cell culture models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

MSI 촬상 차원 세포 배양에서 다양한 분자량 분포를 공개하는 잠재력을 가지고있다. 위에서 설명한 방법을 사용하여, 작은 분자 큰 단백질 (도 1) (도 2)으로부터 종 배양에 걸쳐 추적 될 수있다. 이러한 결과는 MSiReader. 32 개 결과 관심 영역 또는 전체 스캔 영역의 어느 시각화 소프트웨어와 3D 세포 배양 관심 걸쳐 단일 이온에 대해 분석 될 수없는 공구 단일 이온의 시각화를 나타낸다. 또한 대부분의 소프트웨어는 자동 발견 노력을 도울 수도 사용자에 의해 설정된 소정의 임계 값 이상으로 이온을 시각화한다. 단일 이온지도가 얻어지면, 대부분의 소프트웨어는 이온의 colocalization을를 보려면 이미지를 오버레이 할 수있는 기능이 포함되어 있습니다. 하나의 접근 방법을 발견 기반 또는 타겟 방식으로, 질량 분석 이미징은 3 차원 세포 배양을 분석하는 강력한 도구입니다. 도 3d 세포 배양 및 성장 절편. 좌)에 수확 전 14 일째 보아 그대로 대장 HCT-116 세포 배양 3D 구조의 광학상의 1. 대표 결과. 오른쪽) 대장 3D 세포 배양 해동의 약 적도 슬라이스의 광학 이미지 이미징을위한 ITO 코팅 슬라이드에 장착. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> 그림 3 차원 세포 배양. TOP) 낮은 질량 (작은 분자) 범위에서 α-CHCA 달성 평균 질량 스펙트럼의 적도 부분의 작은 분자 MALDI-MSI 2. 대표 결과. 하단) 대표 이미지단일 질량 : 327.8 m / z는 주로 3 차원 배양 및 세포의 내부에 국소 429.7 m / 3D 주로 세포 배양의 에지에 Z 지역화. 점선은 회전 타원체의 대략적인 우위를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> 그림 3 차원 세포 배양. TOP) 이상 (단백질) 질량 범위에서 sinapic 산으로 달성 평균 질량 스펙트럼의 적도 부분의 MALDI-MSI에 의한 단백질 이미징 3. 대표 결과. 맨 아래) 하나의 질량의 대표 이미지 : 주로 회전 타원체의 가장자리에 지역화 10,871m / Z, 그리고 더 많은 회전 타원체의 내부를 향해 지역화 12,184m / Z. 점선 타원체의 가장자리를 나타내는 근사. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

불멸화 암세포 차원 세포 배양, 생물학적 연구를위한 유용한 모델로 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 샘플 제조 플랫폼의 개선을 포함하여 3 차원 세포 배양의 질량 분석 이미징을 설명한다. 이 프로토콜의 목적은 질량 분석 이미징 분석 3D 세포 배양을 준비하도록 지시한다.

3 차원 세포 배양 모델의 질량 분석 이미징을위한 준비 전략 샘플

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.1K 조회수.  University of Notre Dame.  불멸화 암세포 차원 세포 배양, 생물학적 연구를위한 유용한 모델로 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 샘플 제조 플랫폼의 개선을 포함하여 3 차원 세포 배양의 질량 분석 이미징을 설명한다. 이 프로토콜의 목적은 질량 분석 이미징 분석 3D 세포 배양을 준비하도록 지시한다. 

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

연구

생체공학

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석에 의한 생물 조직의 이미지

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전자 분무 이온화에 의한 전신 질량 분석 이미징 (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...