We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

1. Computational identification du potentiel à petites molécules des groupes de recouvrement Remarque: En principe, une variété de pharmacophores accueil ou méthodes de recherche peut être utilisé pour prédire les groupes de coiffage potentiels. Le but principal de calcul dans REMPLACER études est d&#39;identifier de petites molécules qui conservent les caractéristiques et les interactions des acides aminés qui sont substitués. <ol><li> Validation du protocole LigandFit d&#39;accueil 14 </li></ol> Remarque: Dans des études antérieures, la méthode d&#39;accueil (LigandFit 15, un module dans le moléculaire suite de programme de modélisation, Discovery Studio 3.0) a été validé afin d&#39;assurer que cet algorithme est suffisante pour reproduire les modes de liaison des Ncaps connu et de montrer que les résultats obtenus pour composés inconnus sont prédictive 14. <ol style="margin-left: 40px;"><li> En utilisant les étapes (1,2 - 1,5) suivants, identifier les paramètres optimaux pour LigandFit comme suit: en PLP1ergy grille pour la génération de pose, la minimisation des poses générées et la fonction de notation PLP1 pour l&#39;analyse des poses. </li><li> Afin de limiter les conformations obtenus et à positionner de manière appropriée ligands pour la formation de liaison covalente dans le peptide coiffé, d&#39;azote et de régler les atomes d&#39;azote d&#39;indole amide de Trp217 et Gln254 respectivement en tant que filtres d&#39;interaction pour une liaison hydrogène. </li><li> Conception et ancrer une bibliothèque d&#39;alternatives de fragments dans la CDK2 / cycline Un récepteur (2UUE). Prioriser les groupes de coiffage potentiels pour la synthèse et l&#39;approvisionnement commercial basé sur PLP1 notation, les interactions avec les filtres d&#39;interaction et de complémentarité avec la CBG. Les différentes étapes nécessaires à LigandFit accueil sont les suivantes. </li></ol><ol start="2"><li> Préparation du récepteur de site de liaison 14 <ol><li> Importez le CDK2 / cycline A structure cristalline (id pdb: 2UUE) dans une fenêtre de visualisation dans le logiciel. Cette structure contient les FLIP précédemment identifié 5-méthyl-1-phényl-1 H-1, 2,4-triazole-3-carboxamide (3,5-DCPT) FRVR lié à la rainure de la cycline (Figure 3). </li><li> Supprimer ou de garder en place les résidus FRVR (C-terminale). Quand la séquence du peptide est conservée, utiliser le groupe amino N-terminal du peptide en tant que filtre pour l&#39;interaction ligand. De les «interactions ligand-récepteur&quot; outils, de créer une sphère autour de la N-Cap 3,5-DCPT de Show / Hide place sphère. La sphère est créée pour définir la zone active dans le site de liaison où les interactions ligand-récepteur sont autorisés à se produire au cours de la liaison. </li><li> Définir le site de liaison plus loin de la &quot;trouver le site que le volume du ligand choisi&quot; et supprimer le ligand 3,5-DCPT de la protéine. Effectuer cette étape pour définir le volume de la liaison au sein de la sphère créée. </li><li> Set d&#39;azote et des atomes d&#39;azote d&#39;indole amide des résidus Trp217 et Gln254 que des filtres d&#39;interaction pour une liaison hydrogène. Réglez les filtres d&#39;interaction de sorte que seuls les poses qui porcelaineRact avec les atomes de résidus de consigne sera filtrée pendant le processus d&#39;accueil préservant ainsi des interactions importantes dans les poses amarrés. </li></ol></li><li> Préparation de ligands 14 <ol><li> Concevoir une bibliothèque de 100 groupes de coiffage potentiels sur la base de critères tels que la masse moléculaire inférieure à 500, la présence d&#39;un groupe carboxylate pour la ligature avec le peptide tronqué et l&#39;inclusion de groupes hydrophobes appropriés (groupe phényle substitué) de van der Waals interaction dans la poche secondaire, indiqué dans le tableau 1. </li><li> Sélectionner noyaux hétérocycliques pour mimer des interactions de liaison hydrogène avec le peptide et Trp217 substituants inclus pour remplacer les interactions ion-appariement de chaînes latérales basiques de l&#39;HAKRRLIF. Dock ligands que des molécules d&#39;aldéhyde respectifs de sorte que l&#39;oxygène du carbonyle peut interagir avec l&#39;atome d&#39;azote d&#39;amide Gln254 analogue à squelette peptidique dans le peptide parent (Tableau 1). </li><li> Avant docroi, minimiser ligands conçus pour une conformation à faible énergie et de préparer dans un état d&#39;ionisation appropriée en utilisant le protocole &quot;Préparer ligands&quot;. Dessiner et exporter ces N bouchons potentiels dans le format de fichier .sdf dans ChemDraw pour une feuille de calcul avant d&#39;être importés dans le logiciel. Note: Préparer protocole de ligands est utilisée pour minimiser tous les ligands d&#39;être amarré à leurs états d&#39;énergie les plus bas et les frais d&#39;ionisation ont été appliqués aux atomes applicables. Les paramètres par défaut sont utilisés pour cette étape. </li></ol></li><li> Accueil des ligands dans la cycline A Groove 14 <ol><li> Sélectionnez la routine LigandFit de récepteur-ligand protocole de interactions ensemble du logiciel. Utilisation du récepteur et les ligands préparé comme entrée pour ce protocole. </li><li> Pour ces essais, sélectionnez PLP1 comme grille de l&#39;énergie, précisent que pose l&#39;énergie soit réduit au minimum et que le nombre de poses générés 10. Laissez tous les autres paramètres, les valeurs par défaut. Remarque: LigandFit estun procédé d&#39;ancrage qui permet d&#39;identifier et de générer des poses de grande affinité et complémentarité potentiel avec le site actif d&#39;une protéine en utilisant un filtre de comparaison de forme à base qui est combinée avec une recherche de Monte Carlo algorithme de conformation. La grille de l&#39;énergie utilisée par le programme d&#39;accueil est le domaine pour générer interactions ligand-récepteur et les poses potentiels vigueur. PLP1 potentiel est linéaire par morceaux qui privilégie en particulier des interactions de liaison hydrogène et où le type de PLP atome est attribué pour chaque atome de ligand non hydrogène ou un atome non-hydrogène du récepteur. </li></ol></li><li> Analyse des résultats <ol><li> Dans le premier cas, l&#39;affichage pose dans le programme de visualiseur puis trier par ordre décroissant des valeurs de la partition PLP1. Utiliser des fonctions telles que la notation PLP1 pour estimer l&#39;affinité de liaison d&#39;un ligand à base d&#39;un quai ligand candidat pose géométrie et de l&#39;interaction non covalente avec la structure de récepteur cible. Remarque: Ici, la fonction PLP1 de notation a été trouvé à give les meilleurs résultats car il comprend une estimation de la liaison hydrogène. </li><li> Analyser visuellement le top 25% des poses marqués pour 1) superposabilité avec le groupe de coiffage connu (ayant un rapport écart quadratique moyen (RMSD) valeur inférieure à 2 a), 2) remplie filtres d&#39;interaction et 3) la complémentarité visuel avec la rainure de la cycline . Il est admis que dans une pose amarré correctement (par rapport à une structure expérimentale) a une valeur RMSD de &lt;2 Å. </li><li> Examinez poses pour complémentarité visuelle, qui est défini comme ayant un remplissage efficace de la poche de liaison d&#39;une manière qui soit compatible avec les relations structure-activité connue. Les filtres d&#39;interaction sont définis pour inclure des restrictions d&#39;atomes qui nécessitent contacts intermoléculaires connues pour être essentielles pour la liaison et / ou sont nécessaires pour positionner le groupe de coiffage potentiel dans la géométrie correcte pour la formation de liaisons amide. Trois exemples de poses amarrés des groupes N coiffage potentiels faisant des liaisons hydrogène avec INTERACTIONSn filtres sont représentés sur la figure 4. </li></ol></li></ol> 2. synthèse et la caractérisation de N -capping Groupes potentiels <ol start="1"><li> Synthèse de N groupes de coiffage. </li><li> Pour la synthèse, utiliser tous les commerciaux à partir des matériaux, des solvants et des réactifs obtenue. Synthétiser groupes potentiels de N-coiffage en chimie organique de synthèse classique (Figure 5 12,13 pour un exemple). </li><li> Effectuer la Chromatographie sur couche mince (CCM) sur gel de silice pour des réactions de contrôle. <ol><li> On dissout le produit de départ et le mélange de réaction (1 mg) dans la phase mobile et les repérer sur la plaque de CCM en utilisant des tubes capillaires. </li><li> Placer la plaque de CCM dans la chambre de réception de phase mobile (l&#39;acétate d&#39;éthyle et d&#39;hexane dans un rapport 35:65). Une fois la phase mobile atteint 90% de la plaque de CCM, enlever et sécher à l&#39;air de la plaque. </li><li> Utilisez la lumière UV pour détecter les matériels et de réaction à partir des mélanges comme des taches visibles. Calculer la R f de tous les spots (rapport de la distance parcourue par la place et la phase mobile). Remarque: La réaction est terminée lorsqu&#39;il n&#39;y a pas lieu vu au Rf du produit de départ. </li></ol></li><li> Après l&#39;achèvement de la réaction travailler jusqu&#39;à le mélange de réaction en le plaçant dans un entonnoir de séparation et de lavage avec un acide aqueux ou d&#39;une solution de base selon le cas. Recueillir le solvant organique, évaporer dans un évaporateur rotatif et sécher le produit brut obtenu sous vide. </li><li> Dissoudre 500 mg de produit brut dans 3-5 ml de solvant approprié et ajouter à un 1 g de silice ou RP18 samplet et sécher sous air. Placez le samplet contenant le produit brut dans les / RP SNAP cartouches flash de silice et de purifier le matériau brut par Chromatographie flash haute performance automatisée (selon le protocole du fabricant) employant une colonne SNAP 100 g avec une course de gradient à partir de l&#39;acétate d&#39;éthyle 6%: 94 % d&#39;hexanes à acétate d&#39;éthyle à 50% et plus de 50% d&#39;hexanes15 volumes de colonne. </li><li> Sécher le produit purifié recueilli dans un solvant de Chromatographie éclair en utilisant un évaporateur rotatif par évaporation tout le solvant à sec et encore sécher le produit sous vide pour éliminer tous les solvants résiduels. Effectuer la caractérisation du produit purifié par RMN, MS et HPLC analytique. <ol><li> Pour RMN 1 H et 13 C RMN, peser environ 10 mg de l&#39;échantillon purifié, la dissoudre dans un solvant deutéré approprié, et transférer le contenu d&#39;un tube de RMN à sec pour enregistrer le spectre RMN 2,14. </li><li> Enregistrez la RMN 1 H et 13 spectres RMN C avec un champ haute spectromètre de RMN (minimum 300 MHz). Acquérir les spectres de masse en utilisant un QTOF (Tandem quadruple 1 heure de spectromètre de masse de vol), ionisation par électronébulisation (ESI) ou VG 70S (double focalisation spectromètre de masse à secteur magnétique, EI) 2,14. </li><li> Analyser la pureté des produits par CLHP avec un détecteur à barrettes de diodes et équipé avecC18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um colonne pour analyse. Utilisez un terme de gradient à partir de 100% de l&#39;eau (acide trifluoroacétique à 0,1%) à 60% d&#39;acétonitrile (de l&#39;acide trifluoroacétique à 0,1%) de plus de 30 min et maintenir le gradient pendant 4 min. Extraire les chromatogrammes à 226 et 254 nm 2,14. Remarque: puretés analytiques des composés évalués étaient&gt; 95%. </li></ol></li></ol> 3. La synthèse en phase solide pour la génération de flips 2 <ol start="1"><li> Synthèse de flips de N-capped <ol><li> Assemblez composés peptidiques N-plafonnés par des méthodes de synthèse en phase solide standard en utilisant les étapes suivantes. <ol><li> Activer 5 équivalents de l&#39;acide aminé C-terminal (Fmoc-Phe) dans 4,4 équivalents d&#39;O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; tétraméthyl-uronium-hexafluoro-phosphate (HBTU, 221,93 mg) dans 2 ml de DMF pendant 5 min. Chargez le mélange HBTU Fmoc-Phe sur la résine Rink utilisant 6 équivalents de diisopropyléthylamine (DIPEA, 103.13mg) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Éliminer le groupe protecteur Fmoc du résidu C-terminal en utilisant 20% de pipéridine dans 3 ml de DMF pendant 10 min. Couple acides aminés ultérieurs (par exemple, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC), étape par étape. A chaque étape, deux 5 équivalents de l&#39;acide aminé suivant en utilisant 6 équivalents de DIPEA (103,13 mg) et 4,4 équivalents de HBTU (221,93 mg) dans 2 ml de DMF pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Appliquer cycles de lavage (5 x 10 ml de DMF + 5 x 10 ml de DCM) après couplage d&#39;acides aminés et de déprotection Fmoc étapes décrites ci-dessus. Après l&#39;assemblage d&#39;un peptide, ou deux groupes en utilisant 6 équivalents de DIPEA (103,13 mg) et 4,4 équivalents de HBTU (221,93 mg) de N-coiffage dans 2 ml de DMF pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> À l&#39;issue de l&#39;ensemble de peptide, traiter le mélange de réaction avec 2 ml de mélange de clivage (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N pour supprimer protecteurs de chaîne latérale des groupes, et clivent flips de la résine. Triturer le produit résultant avec de l&#39;éther diéthylique froid pour précipiter et if nécessaire concentré dans un évaporateur rotatif. </li></ol></li></ol></li><li> Synthèse de flips coiffe N-C-plafonnés <ol><li> Peser et dissoudre le peptide Arg-Leu-terminal coiffé N et protégé (16,1 mg, 0,02 mmol) dans du dichlorométhane et ajouter [4- (3-chlorophénoxy) pyridin-2-yl] méthanamine (C-CAP) avec O - benzotriazole N, N, N &#39;, N&#39; tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU, 16,7 mg, 0,02 mmol) et de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol). </li><li> Agiter et surveiller la réaction à la température ambiante jusqu&#39;à ce qu&#39;une CCM / HPLC indique la consommation complète du matériau de départ. Après l&#39;achèvement de la réaction, on concentre le mélange réactionnel brut en utilisant un évaporateur rotatif, puis on sépare l&#39;acétate d&#39;éthyle et de l&#39;eau. </li><li> Séparer la phase aqueuse et la couche organique; laver la couche organique avec du NaOH 1 N, du HCl 1 N et de la saumure. Sécher la couche organique avec environ 1 g de sulfate de sodium et on concentre le produit dans un évaporateur rotatif. Finally traiter le produit O / N avec le mélange de clivage (95: 2,5: 2,5 acide trifluoroacétique / H 2 O / TIPS) pour la déprotection. </li><li> Triturer le produit résultant avec de l&#39;éther diéthylique froid et, si nécessaire, concentré dans un évaporateur rotatif jusqu&#39;à siccité complète afin d&#39;éliminer tout le solvant. En outre sécher le produit sous vide pour éliminer tous les solvants résiduels. </li></ol></li><li> Purification et la caractérisation de flips <ol><li> Purifier FLIP brut en utilisant des méthodes semi-HPLC préparative en phase inverse. Lyophiliser les FLIP purifiées et de caractériser leur masse moléculaire en utilisant la spectrométrie de masse 2,14. </li><li> Déterminer la pureté analytique des FLIP par HPLC avec un détecteur à barrettes de diodes et équipé d&#39;un C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um colonne. Utilisation d&#39;une méthode de gradient à partir de 95% de H 2 O (acide trifluoroacétique à 0,1%) / 5% d&#39;acétonitrile (acide trifluoroacétique à 0,1%) à 35% de H 2 O (acide trifluoroacétique à 0,1%) / 65% d&#39;acétonitrile (0,1% trifluoroacel&#39;acide tic) sur 30 min et détiennent le gradient pendant 4 min. Extrait chromatogrammes à 226 et 254 nm. </li></ol></li></ol> 4. polarisation de fluorescence Essai de liaison pour la détermination de la liaison compétitive 2,14 <ol start="1"><li> Effectuez le test en noir 384 puits (138 pl) plaques en utilisant la procédure suivante. </li><li> Diluer les échantillons, des peptides traceurs (4 nM) et des complexes de kinase (CDK2 / cycline A - 18 ug / ml, CDK4 / cycline D - 37 ug / ml) aux concentrations nécessaires dans le tampon de dosage (HEPES 25 mM pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% de Nonidet P-40, 1 mM de dithiothréitol (DTT). </li><li> Pour chaque puits de la plaque de 384 puits, ajouter: 5 pi de CDK4D1 ou CDK2CA (0,3 pg / puits purifiée complexe humain recombinant de kinase), solution de composé de 5 pi, 5 pi de 30 nM peptide traceur (fluorescéinyle Ahx-Pro-Val Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly-fluorescéinyle ou Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly peptide traceur). Utiliser 5 pi de chaque DMSO (6%), buffer, traceur et 5 pi de DMSO (6%), le complexe de kinase, comme traceur puits témoins </li><li> Après l&#39;addition des tous les composants, centrifuger la plaque à 500 tours par minute pendant 1 min (41.16 XG) à température ambiante et ensuite incuber la plaque avec agitation pendant 45 min à température ambiante. En utilisant un lecteur de plaque multimode et un détecteur équipé 485 nm / 535 nm excitation / filtres d&#39;émission et un miroir dichroïque lire l&#39;intensité fluorescéine de chaque puits de la plaque. </li><li> Calculer la polarisation moyenne relative (mp) pour tous les échantillons d&#39;essai en utilisant l&#39;équation ci-dessous montre. Déterminer les valeurs IC50 par régression logarithmique en corrélant les députés et les tests relatifs concentrations. </li></ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

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P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+and+drug+discovery+for+protein-protein+interactions.">Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions.</a> Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).</li><li>Cannon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaceutics+and+drug+delivery+aspects+of+heme+and+porphyrin+therapy.">Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy.</a> J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

Dans cet article, une étude de l&#39;application de la REPLACE (remplacement par des alternatives ligand partielle à l&#39;aide de calcul enrichissement) stratégie visant à convertir des inhibiteurs peptidiques de interactions protéine-protéine en plus de molécules pharmaceutiquement pertinents cas est décrit 1-3. Bien que les IPP représentent une source de cibles potentielles de médicaments, mais sous-exploité riche, méthodologies existantes sont largement insuffisants pour faire de ces largement accessible. Les stratégies actuelles, y compris fragment conception basée sur 4, criblage à haut débit 5 et 6 peptides agrafées ont apporté des progrès, mais ceux-ci sont dans de nombreux cas inefficaces. En conséquence, davantage de progrès et des approches plus efficaces sont nécessaires. REPLACE a été entièrement validée dans le développement d&#39;inhibiteurs de kinases qui ont des propriétés améliorées de drug-like et qui ont un potentiel de développement en tant qu&#39;agents thérapeutiques anti-tumorales. Cette stratégie est illustrée dans le développement d&#39;inhibiteurs non-ATP de cellulesCDK de cycle et implique comme suit: 1) l&#39;obtention d&#39;informations structurelles 3D sur les interactions de HAKRRLIF / RRLIF sillon de liaison avec la cycline; 2) déterminer les déterminants de liaison importants pour l&#39;interaction peptidique; 3) la troncature du peptide N-terminale contenant un ou plusieurs déterminants de liaison; 4) l&#39;identification de calcul de potentiels de petites molécules variantes alternatives (ligands partiels, PLA) pour la partie tronquée du peptide et qui conservent les interactions clés du peptide parent; 5) la synthèse ou l&#39;approvisionnement commercial de PLA prédits se lier avidement avec le sous-site précédemment occupée par le résidu (s) peptidique est supprimé; 6) synthèse de feuillette ligature des meilleurs PLA au peptide tronqué en utilisant une synthèse en phase solide; 7) Les essais de culbutes dans un liant in vitro ou un dosage fonctionnel (polarisation de fluorescence dans le contexte / cycline CDK), suivie d&#39;une caractérisation plus poussée dans un essai de viabilité des cellules. Une représentation schématique de REMPLACER stratégy est montré dans la figure 1. Dans cet article, itérations de la stratégie REPLACE sont discutés et l&#39;application de CDK2 / cycline A décrit en détail. CDK sont soupçonnés d&#39;être directement ou indirectement déréglementé dans la majorité des tumeurs et sont donc considérés cancer appropriée cibles médicamenteuses 7. CDK nécessite association avec cyclines pour l&#39;activation complète et phosphorylent ensuite protéines clés impliquées dans la régulation du cycle cellulaire 8. Les deux principaux groupes de CDK sont les isotypes et qui éliminent les points de contrôle du cycle cellulaire [G1 / S (CDK4 / cycline D, CDK6 / cycline D et CDK4 / cycline E), la phase S (CDK2 / cycline A) et G2 / M (CDK1 / cycline B)] et les régulateurs de l&#39;ARN polymérase par phosphorylation (CDK7 / cycline H, CDK8 / cycline C, CDK9 / cycline T). Une étape clé dans la progression de la phase S se produit lorsque le facteur de transcription E2F1 forme un complexe avec la protéine DP qui se lie ensuite à l&#39;ADN et initie la transcription du gène. CDK2 / cycline A est nécessaire pour neutraliser la transcription E2F1activité à travers la phosphorylation conduisant ainsi à libérer du complexe E2F1-DP et sa dégradation ultérieure. L&#39;inhibition de CDK2 / cycline A est censé maintenir E2F1 dans son état ADN lié à l&#39;activation persistante conduisant. Le niveau résultant de l&#39;E2F-1 l&#39;activité dépassera le seuil nécessaire pour induire l&#39;apoptose p53 indépendante suggérant donc une stratégie thérapeutique. En raison de p53 et dérégulé voies pRb, des niveaux élevés de l&#39;E2F-1 se produisent fréquemment dans les cellules cancéreuses et l&#39;inhibition de la CDK2 / cycline A doit conduire à l&#39;apoptose sélective dans les tumeurs et peut être considéré comme une cible de cancer validée 7. Cliniquement inhibiteurs de CDK étudiés ciblent le site hautement conservée ATP liaison menant à traverser la réactivité parmi les plus de 500 protéines kinases dans le kinome humaine et qui pourrait donner lieu à des effets et de la toxicité 9 Side. Une autre approche est non-ATP inhibition compétitive en ciblant le recrutement de substrat à travers la CBGprésent sur ​​la cycline sous-unité régulatrice positive et qui est donc distincte et distante de l&#39;ATP site de liaison 10,11. Le CBG est principalement hydrophobe présente une rainure dans la cycline A, la cycline D et la cycline E et a été montré pour reconnaître une séquence consensus trouvée dans les substrats et des suppresseurs de tumeurs. Comme un peptide isolé, le motif de liaison de la cycline (CBM) se lie à la CBG et a été montré pour inhiber l&#39;activité de kinase de CDK du cycle cellulaire. Le CBM a été optimisé pour un octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / cycline A IC 50 de 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 de 0,88 ± 0,34 M) et, en outre tronquée à un pentapeptide qui représente un bon compromis entre le poids moléculaire de la drogue la ressemblance et de la puissance (RRLIF, CDK2 / cycline A IC 50 de 1,01 ± 0,17 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. Les GBC composent d&#39;une grande primaire et secondaire plus petite poche hydrophobe qui sont comblé par une acidic région (comprend Glu220, Glu224 et Asp283). Les déterminants de liaison clés de HAKRRLIF comprennent l&#39;interaction de Ala2 avec les liaisons poche hydrophobe secondaire, appariement d&#39;ions et d&#39;hydrogène de Lys3, Arg 4 et arg5 avec la région acide et un degré élevé de complémentarité de Leu6 et Phe8 avec le site lipophile primaire. En outre, de nombreuses liaisons hydrogène sont contribué au squelette du peptide tandis Ile7 agit comme un résidu d&#39;écartement permettant un contact optimal avec la poche primaire. Le mode de fixation et les interactions des HAKRRLIF avec CBG est montré dans la figure 2. Cibler le CBM / CBG interaction protéine-protéine inhibe l&#39;activité kinase de CDK2 de / cycline A, CDK2 / cycline E et CDK4 / cycline D, ce qui devrait déclencher l&#39;apoptose à médiation par E2F1 des cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales 7. Bien que CBM peptides dérivés sont des inhibiteurs efficaces de CDK du cycle cellulaire, il est peu probable qu&#39;ils soient utiles comme médicaments en raison de leur métabolismel&#39;instabilité et le manque général de la perméabilité cellulaire. À cette fin, nous avons appliqué la stratégie REPLACE afin de convertir ces inhibiteurs peptidiques puissants dans plusieurs composés de drogues pour la poursuite du développement de produits thérapeutiques anti-tumorales exploitant E2F1 déréglementé travers CDK2 / cycline A inhibition. Le protocole suivant résume travail qui a été accompli dans l&#39;application de REPLACE à la gorge de la cycline. Dans le premier cas, le remplacement des groupes de plafonnement des drogues pour le tétrapeptide N-terminale de HAKRRLIF ont été identifiés. En outre des améliorations dans ces groupes ont été étudiés dans une étude de validation supplémentaire pour REPLACE. Les résultats représentatifs de ces études sont également présentés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computational Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Optiplex Workstations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Organic Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5&#956;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Polarization Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 micro well plates, ,&#160; Micro pipets,&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-one</td>
			<td>110256602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td>
			<td>BPS Bio Sciences</td>
			<td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 nM HEPES</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>375368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector&#160; fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, &#160;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,&#160; MTT reagent,</td>
			<td colspan="2">Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Heamocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo electron corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4-8C</td>
			<td>Isotemp Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

REPLACE est une stratégie unique développé pour cibler plus efficacement les interactions protéine-protéine (IPP). Il vise à élargir l&#39;espace disponible de médicament cible en fournissant une meilleure méthodologie pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de ces sites de liaison et qui représentent la majorité des cibles potentielles de médicaments. L&#39;objectif principal de ce document est de fournir un aperçu de la méthodologie de l&#39;utilisation et l&#39;application de la stratégie REMPLACER qui implique des approches de calculs de chimie et synthétiques. REPLACE est illustré par son application au développement de kinases cycline non-ATP concurrentiel dépendantes (CDK) inhibiteurs comme agents thérapeutiques anti-tumorales. CDK sont souvent déréglementés dans le cancer et sont donc considérés comme des cibles importantes pour le développement de médicaments. L&#39;inhibition de la CDK2 / cycline A dans la phase S a été rapporté à favoriser l&#39;apoptose sélective des cellules cancéreuses de manière indépendante de p53 par la voie de E2F1. Le ciblage interaction protéine-protéine à la cycline binding rainure (GBC) est une approche qui permettra à l&#39;inhibition spécifique du cycle cellulaire sur CDK transcription. La CBG est reconnu par une séquence consensus dérivée à partir de substrats de CDK et des protéines suppresseurs de tumeur appelé le motif de liaison (CBM) cycline. Le CBM a déjà été optimisé pour un octapeptide de p21Waf (HAKRRIF), puis encore tronqué à un pentapeptide conservant une activité suffisante (RRLIF). Peptides en général ne sont pas cellule perméable, sont métaboliquement instable et donc la REPLACE (remplacement partiel avec Ligand Alternatives travers Computational enrichissement) stratégie a été appliquée afin de générer plusieurs inhibiteurs de drug-like. La stratégie commence avec la conception du fragment ligaturé peptides inhibiteurs (de flips) qui inhibent sélectivement cycle cellulaire des complexes CDK / cycline. FLIP ont été générés par le remplacement itérative résidus de HAKRRLIF / RRLIF avec le fragment comme de petites molécules (groupes de recouvrement), à partir de l&#39;extrémité N-terminale (Ncaps), suivis par le remplacement surl&#39;extrémité C-terminale. Ces composés sont des points de départ pour la production d&#39;inhibiteurs de CDK non compétitifs de l&#39;ATP comme agents thérapeutiques anti-tumorales.

Les interactions de HAKRRLIF avec la rainure de la cycline sont présentés sur la figure 2. Les résidus peptidiques qui représentent les principaux déterminants de liaison comprennent Ala2, Arg4, Leu6 et Phe8 par d&#39;autres résidus de fournir des contributions de plus petites 12,13,18. Dans cette étude de cas la stratégie REPLACE a été utilisée dans le but de trouver des alternatives fragments pour les résidus dans le tétrapeptide N-terminale de HAKRRLIF, imitan...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Développement d&#39;inhibiteurs de interactions protéine-protéine REMPLACER travers: Application à la conception et les inhibiteurs de CDK concurrentiel développement non-ATP

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K vues.  University of South Carolina. We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Vidéo: Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

L&#39;utilisation de SC1 (Pluripotin) pour soutenir MESC autorenouvellement en l&#39;absence de LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Recherche

Biologie

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imagerie interactions protéine-protéine In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Conception et développement d&#39;aptamères-or à base de nanoparticules colorimétriques Assays pour In-the-champ Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Enlèvement des matériaux exogènes de la partie extérieure des surgelés Cores d&#39;enquêter sur l&#39;Ancien Communautés biologiques nourrissais intérieur

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat accumulation (steatosis) and inflammation leading to fibrosis. Preclinical models closely recapitulating human NASH/NAFLD are essential in drug development. While liver biopsy is currently the gold standard for measuring NAFLD/NASH progression and diagnosis in the clinic, in the preclinical space, either collection of whole liver samples at multiple timepoints during a study or biopsy of liver is needed for histological analysis to assess the disease stage.
Conducting a liver biopsy mid-study is an invasive and labor-intensive procedure, and collecting liver samples to assess disease level increases the number of research animals needed for a study. Thus, there is a need for a reliable, translatable, non-invasive imaging biomarker to detect NASH/NAFLD in these preclinical models. Non-invasive ultrasound-based B-mode images and Shear Wave Elastography (SWE) can be used to measure steatosis as well as liver fibrosis. To assess the utility of SWE in preclinical rodent models of NASH, animals were placed on a pro-NASH diet&#160;and underwent non-invasive ultrasound B-mode and shear wave elastography imaging to measure hepatorenal (HR) index and liver elasticity, measuring progression of both liver fat accumulation and tissue stiffness, respectively, at multiple time points over the course of a given NAFLD/NASH study.
The HR index and elasticity numbers were compared to histological markers of steatosis and fibrosis. The results showed strong correlation between the HR index and percentage of Oil Red O (ORO) staining, as well as between elasticity and Picro-Sirius Red (PSR) staining of livers. The strong correlation between classic ex vivo methods and in vivo imaging results provides evidence that shear wave elastography/ultrasound-based imaging can be used to assess disease phenotype and progression in a preclinical model of NAFLD/NASH.

This protocol describes the use of an enhanced ultrasound technique to non-invasively observe and quantify liver tissue changes in rodent models of nonalcoholic fatty liver disease.

Application de l’échographie et de l’imagerie par élastographie par ondes de cisaillement dans un modèle de rat de NAFLD / NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...