This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

NOTE: Toutes les procédures dans ce protocole ont été menées selon l&#39;Institut national de lignes directrices de la santé pour le traitement et le soin éthiques des animaux, et selon un IACUC protocole d&#39;utilisation d&#39;animaux approuvé. Ligne 1. maintenance des cellules <ol><li> Culture des cellules BAF3 dans du milieu RPMI-1640 complété avec 10% de sérum bovin fœtal et de la pénicilline / streptomycine (100 unités / ml et 100 pg / ml) et le milieu de culture usé de cellules WEHI. Cultiver les cellules HEK293T dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et de la pénicilline / streptomycine (100 unités / ml et 100 pg / ml). Maintenir les cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. </li></ol> 2. Construction du plasmide <ol><li> Cloner la souris JAK2 et son oncogénique isoforme JAK2 V617F dans-pMSCV-puro-GW par LR clonase en utilisant la procédure de clonage recombinaison standard. </li><li> Pour la construction du vecteur d&#39;expression de la luciférase (Luc-pMSCV-Cherry-GW) utilisé dans l&#39;en-viimagerie de vo, amplifier la luciférase de pLVX-Tet-ON vecteur par PCR utilisant des amorces (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG et LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) suivi avec le clonage dans pENTR-SD-TOPO pour générer pENTR-Luc, qui est utilisé pour transférer le gène de la luciférase dans le vecteur rétroviral, pMSCV-Cherry-GW clonage par recombinaison médiée utilisant LR clonase. </li></ol> 3. Préparation de Random Mutation Bibliothèque, le dépistage et l&#39;identification des mutations 3.1) mutagenèse aléatoire <ol><li> Pleine longueur clone de JAK2 sauvage et la mutation V617F dans vecteur rétroviral pMSCV-puro-GW en utilisant une technologie de recombinaison de clonage commercial. </li><li> Utiliser 1 ug d&#39;ADN de plasmide JAK2 V617F-à transformer ou XL-1 Rouge, E. cellules de E. coli, qui est défectueux dans les mécanismes de réparation de l&#39;ADN leur permettant ainsi d&#39;intégrer des mutations aléatoires lors de la réplication. Plus précisément, mélanger de 50 à 100 ng d&#39;ADN (plus de 100 ng d&#39;ADN diminue l&#39;efficacité de transformation) avec 100 pi de cellules compétentes dans un tube en polypropylène pré-réfrigérés et incubé sur de la glace pendant 30 minutes, remuant doucement toutes les 5 min. Pour une bonne couverture de la bibliothèque, utilisez quatre à six tubes de cellules compétentes. NOTE: Plus de 100 ng d&#39;ADN diminue l&#39;efficacité de la transformation </li><li> Plonger le tube dans un bain d&#39;eau à 42 ° C pour un choc thermique de 45 secondes et incuber sur de la glace pendant 2 min. Ensuite, ajouter 1 ml de milieu SOC (2,0% de tryptone, 0,5% d&#39;extrait de levure, 0,05% de NaCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM MgSO4 et 0,4% de D-glucose). Incuber le tube à 37 ° C tout en agitant à 225 à 250 tours par minute pendant 90 min. </li><li> cellules de la plaque de chaque tube sur quatre 10 cm plaques d&#39;agar-LB contenant 100 ug / ml d&#39;ampicilline. Incuber les plaques pour 16 à 24 heures à 37 ° C. </li><li> Après colonies visibles, les recueillir en grattant les plaques avec une plaque racleur stérile. Piscine cellules de chaque ADN plasmidique isolat plaque et en utilisant un kit d&#39;extraction de plasmide commercial. NOTE: Habituellement colonies sont plus petits et prennent 18 à 24 h pour êtrevisible parce que ce sont des souches bactériennes à croissance lente. A ce stade, d&#39;évaluer l&#39;hétérogénéité des mutations dans la bibliothèque par digestion de restriction avec un réducteur classique tel que Sau 3A1 ou Taq1 ou séquençage. </li></ol> 3.2) Production de surnageants rétroviraux et la transduction <ol><li> Un jour avant la transfection, la plaque 4 x 10 6 cellules HEK 293T dans 100 cm plats dans du DMEM contenant 10% de FCS, de la pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Le lendemain, remplacer le milieu et la transfection des cellules avec une mutagenèse bibliothèque pMSCV-JAK2 V617F-. Pour chaque plaque de 10 cm, mélange 10 pg de l&#39;ADN (5 ug de la banque de plasmides et de 5 ug de plasmide retroviral emballage, pCLEco) avec 40 ul de FuGENE à un volume total de 400 ul en utilisant du sérum de milieu DMEM libre. Incuber le mélange d&#39;ADN et de lipide pendant 20 min à température ambiante. Après 20 minutes ajouter la baisse complexe ADN-lipides sage au-dessus des cellules HEK293T. </li><li> Après six heures, changer le milieu de transfection wie milieu frais et incuber les plaques pendant 48 heures à 37 ° C pour la production de virus. Après 48 h d&#39;incubation, on collecte les surnageants viraux filtrés à travers un filtre Acrodisc de 0,45 pm. </li></ol> 3.3) Sélection des clones résistants in vitro <ol><li> Pour les mutants JAK2 V617F-résistantes médicaments, la transduction de cellules BAF3 100 000 000 avec 100 ml de surnageants de virus ayant un titre viral de 0,5 à 1 x 10 6. Plus précisément, mélanger 10 8 cellules avec 100 ml de surnageant de virus à un volume total de 300 ml en utilisant du milieu RPMI contenant 10% de sérum et 24 ug / ml de concentration finale (polyberene de ployberene est 8 ug / ml). Distribuer ces mélangeurs de cellules dans de multiples plaques six puits (4-5 ml par puits). </li><li> Centrifuger les plaques à 1250 g pendant 90 min à 25 ° C. Après centrifugation, les plaques incuber à 37 ° C pendant 24 heures. </li><li> Le lendemain, en commun les cellules ensemble et mélanger avec ruxolitinib et milieu contenant de l&#39;agar mou et étalées dans SIx plaques à puits. Pour chaque concentration de médicament, mélanger 10 ml de cellules BAF3 transduites (10-20 millions de cellules) avec la quantité appropriée de ruxolitinib dans un tube de 50 ml. Compléter le volume à 40 ml en utilisant RPMI contenant 20% de sérum. Ajouter 10 ml de gélose à 1,2% des cellules, et la plaque mixcarefully dans six plaques à puits. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C pendant deux semaines. Choisissez les colonies résistantes à l&#39;aide de 0,2 ml embouts de pipette et sous-culture individuellement dans 24 plaques à puits pour 3-4 jours. </li><li> Récolter les cellules BAF3 résistantes par centrifugation à 450 g pendant cinq minutes à la température ambiante. Isoler l&#39;ADN génomique en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ADN génomique commercial. Amplifier par PCR pleine longueur JAK2 ADNc à partir de 100 ng d&#39;ADN génomique en utilisant des amorces (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG et mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) et à long-template élargir les systèmes de PCR haute fidélité. </li><li> Séparer les produits de PCR par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Exciser les 3,4 kb de bande d&#39;ADN représentant JAK2 trame de codage et d&#39;isoler l&#39;ADNen utilisant un kit d&#39;extraction de gel commercial. Séquence toute la longueur de l&#39;ADNc en utilisant des amorces internes 8 (P1 - P8) couvrant la séquence codante et analyser des séquences en utilisant un logiciel commercial. </li></ol> 4. Validation in vitro de mutations résistantes De nombreux clones de cellules portent plus d&#39;une mutation, Pour tester la contribution de chaque mutation dans phénotype de résistance, de générer des variantes sélectionnées par mutagenèse dirigée en utilisant pMSCV-JAK2V-617F plasmide comme matrice. <ol><li> Effectuer mutagenèse dirigée sur pMSCV-JAK2 V617F-plasmide en utilisant un kit et oligonucléotides conçus pour créer des mutations ponctuelles mutagenèse commerciale. Confirmer l&#39;identité des clones mutants par séquençage. </li><li> Transduction de cellules BAF3 avec rétrovirus fait en utilisant des plasmides mutants suivies avec sélection à l&#39;aide puromycine au 1 pg / ml. </li><li> Planche 10 4 cellules BAF3-JAK2 V617F (50-pi de RPMI avec 10% de FCS) dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits. Séparély ajouter 50 ul du milieu de ruxolitinib contenant les puits à travers la plaque (concentration finale: 0, 1, 3, 5, 10 et 20 uM), et incuber les plaques pendant 60 heures à 37 ° C. </li><li> Évaluer la viabilité des cellules en ajoutant 10 pi de réactif WST-1 à chaque puits, suivi par une incubation à 37 ° C pendant 2-4 h. absorbance A450 record à l&#39;aide d&#39;un lecteur de plaque. Effectuer tous les essais en triple exemplaire et complot en moyenne absorbance contre INCB018424 concentrations. Effectuer une courbe sigmoïde meilleur ajustement en utilisant un algorithme d&#39;ajustement de courbe non linéaire. Note la concentration de médicament entraînant 50% de viabilité cellulaire comme la CI50 cellulaire. </li><li> Ensuite, la plaque BAF3 six millions de cellules exprimant des variantes de JAK2 dans six plaques à puits dans du milieu RPMI contenant 10% de sérum avec des concentrations croissantes de ruxolitinib et incubées pendant 4-6 heures à 37 ° C. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation à 450 g pendant cinq minutes à 4 ° C. Laver les cellules une fois avec du PBS, et lyse dans 20 mM de Tris-Cl (pH 7,5), 50mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM, 1 mM de fluorure de sodium, le vanadate de sodium 2 mM, glycerol à 5% et complétée par des inhibiteurs de l&#39;inhibiteur de protease et de phosphatase de cocktail. Soniquer la suspension de cellules pendant 1 min suivie de l&#39;addition de 5x tampon de chargement de gel (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], mM de DTT 500, 15% de SDS, mM benzamidine 10 mM, EDTA 5 mM, EGTA 5, 5 mM Sodium Vanadate , Protease cocktail, 50% de glycerol et 0,001% Bleu de bromophénol) et dénaturation à 70 ° C pendant 5 à 10 min. </li><li> Résoudre les protéines sur un gel à 8% de SDS-polyacrylamide dans des conditions dénaturantes. Effectuer immunoblot avec un anticorps monoclonal de souris anti-phopsho STAT5. Dépouiller les taches et sondé avec un anticorps anti-SATA5 polyclonaux de lapin. Visualiser les bandes en utilisant des réactifs ECL selon les recommandations du fournisseur. </li></ol> 5. Validation in vivo <ol><li> Transduction de cellules BaF3 exprimant la luciférase et de cerise (transduites avec rétrovirus fabriqués à partir de pMSCV-Luc-cherry GW) avec des virus exprimant JAK2 V617F-et variants résistants. Sélectionner les cellules qui survivent la sélection à la puromycine à l&#39;expression de JAK2 et ses variantes de résistance. </li><li> Injecter de deux millions en croissance active BAF3-Luc cellules / cerises portant JAK2 V617F-et ses variants résistants dans 200 pi de PBS à six souris Balb / C par injection de queue veineuse. </li><li> Après trois jours de la transplantation de cellules, injecter la souris avec ruxolitinib (100 mg / kg) deux fois par jour pendant deux semaines. </li><li> Effectuer bioluminescence imagerie à base de luciférase avec un système d&#39;imagerie. . <ol><li> En bref, préparer une solution de luciférine en dissolvant 300 mg à 25 ml d&#39;eau déminéralisée stérile, aliquote en plus petits volumes et magasin. REMARQUE: luciférine Conserver à -80 ° C et protéger de la lumière jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Injecter 250 ul à chaque souris par IP pour atteindre 125 mg / kg dans chaque souris. Anesthésier les souris de même groupe ensemble en utilisant l&#39;isoflurane inhalation (1,5% -2,0%) dans une boîte scellée. Appliquer vétérinaire onguent sur ee oeil à prévenir la sécheresse. NOTE: Le temps pris pour dormir souris (10-15 min) a permis activité luciférine à crête. Gardez le temps cohérente entre les groupes pour éviter variation. </li></ol></li><li> Transférer la souris immédiatement à l&#39;étape de la chambre de l&#39;imagerie et maintenir une anesthésie à 1,5-2% isofluorane pendant les procédures d&#39;imagerie. souris d&#39;image avec séquentielle de 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60 et 300 de l&#39;exposition sec. Capturez des images et quantifier l&#39;intensité de la bioluminescence en utilisant acquisition d&#39;image et logiciel d&#39;analyse. Après imagerie revenir les souris à sa cage. </li><li> Pour, in vivo récolte de chimérisme cellules bonemarrow totales. Euthanasier les souris avec du CO 2 pendant 5 min, puis à la dislocation cervicale. Récolter les os et écraser dans 4 ml de PBS froid pour recueillir la moelle osseuse. Analyser les cellules positives pour cent cerise microscope à fluorescence et de quantifier en utilisant FACS. Recueillir vingt mille événements de chaque échantillon. </li></ol>

<ol>
	<li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases--the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).</li><li>Dancey, J., Sausville, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+and+progress+with+protein+kinase+inhibitors+for+cancer+treatment.">Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).</li><li>Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors:+insights+into+drug+design+from+structure.">Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure.</a> Science. 303, 1800-1805 (2004).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nat Med. 2, 561-566 (1996).</li><li>Gorre, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+resistance+to+STI-571+cancer+therapy+caused+by+BCR-ABL+gene+mutation+or+amplification.">Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.</a> Science. 293, 876-880 (2001).</li><li>Shah, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+confer+polyclonal+resistance+to+the+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+(STI571)+in+chronic+phase+and+blast+crisis+chronic+myeloid+leukemia.">Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).</li><li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR/ABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+(STI571)+resistance.">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li><li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571/imatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL.">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR/ABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance.">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance.">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li><li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine.">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li><li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia.">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li><li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms.">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li><li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy.">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li><li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor.">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437 (2012).</li><li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition.">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503.">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Le succès clinique de l&#39;imatinib dans le traitement de la LMC a démontré non seulement le potentiel de cibler les kinases de rouge par les inhibiteurs de petites molécules, mais également les limites à découvert de thérapie ciblée: rechute clinique et l&#39;émergence de mutations de résistance aux médicaments dans le gène cible. Identification de mutations de résistance contribue à une meilleure prise en charge clinique et le développement d&#39;inhibiteurs de la prochaine génération. Ce protocole ...

Les protéines kinases sont des enzymes intracellulaires réglementaires clés de voies de transduction du signal qui modulent apparemment tous la fonction cellulaire. Un contrôle approprié de médiation par la kinase de signalisation est essentielle à l&#39;homéostasie et le développement, qui repose essentiellement sur une bonne régulation des kinases, des phosphatases et sa dégradation par UPS (système de protéasome ubiquitine). Kinases régulées sont au centre de la scène de nombreux cancers et l&#39;hôte impliqués dans des maladies humaines 1. Génome humain code pour plus de 500 protéines kinases qui ont été liés, directement ou indirectement, à ~ 400 maladies humaines 2. Ces observations ont appuyé le concept de ciblage thérapeutique de kinases par les inhibiteurs à petites molécules 5.3. La démonstration d&#39;inhibiteurs de la kinase ABL, tels que l&#39;imatinib dans le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) à condition que la preuve de concept de cette approche 6,7. Cette observation a non seulement révolutionné la fourmii-kinase thérapie mais aussi forcées l&#39;idée d&#39;identifier les lésions génétiques dans d&#39;autres maladies néoplasiques pour ciblage thérapeutique, qui conduisent à la découverte de mutations oncogéniques dans le JAK2 de polyglobulie de Vaquez (PV) et les patients avec des syndromes myéloprolifératifs (NPP). Cette découverte a suscité un grand intérêt dans le traitement MPN en ciblant JAK2 avec de petites molécules inhibiteurs de kinases. Maintenant, près d&#39;une douzaine d&#39;inhibiteurs de JAK2 sont dans les essais cliniques et l&#39;un d&#39;eux a été récemment approuvé pour le traitement de la myélofibrose. Bien que le ciblage spécifique de kinases oncogènes par des inhibiteurs à petites molécules dans les cancers apporter résultat prometteur, il souffre également de développer une résistance au traitement. En fait, jusqu&#39;à présent, les patients traités avec des inhibiteurs de kinase, tels que l&#39;imatinib, gefitinib, erlotinib et le dasatinib développées mutations de résistance principalement en acquérant des mutations dans le domaine kinase de médicament qui cible 10/8. Résistance à la suite de la mutation génique met en évidence les limitations of monothérapie contre les kinases oncogènes ciblé, et représente le prochain défi dans le développement de la chimiothérapie du cancer de plus en plus de succès. Conséquences mécanistiques et fonctionnelles de la résistance aux médicaments devraient fournir une justification pour la sélection et la conception de composés gratuits pour le développement de médicaments. Mutations identifiées via des écrans in vitro, ont montré un haut degré de corrélation avec celles trouvées chez les patients. Par conséquent, dépistage in vitro de mutations qui confèrent la résistance aux médicaments pendant donnés paires de cibles de médicaments dans passes de développement clinique ou préclinique à identifier les profils de résistance qui sont susceptibles de provoquer une rechute clinique. L&#39;identification de ces formes mutantes ne est pas seulement utile dans la surveillance des patients pour la réponse aux médicaments et à la rechute mais également essentiel pour la conception d&#39;inhibiteurs plus robustes de la prochaine génération. Par exemple, le développement de la prochaine génération des inhibiteurs BCR / ABL, nilotinib et Ponatinib, ont été rendus possibles en raison d&#39;une plus grande meccompréhensions hanistic gagné de mutagenèse, de structure, et des études fonctionnelles. Plus tôt, nous avons présenté les résultats de notre écran à l&#39;aide mutagenèse aléatoire de la BCR / ABL pour révéler le spectre des mutations conférant une résistance aux inhibiteurs comme l&#39;imatinib 11,12, 12 PD 166326 et AP24163 13. Les résultats non seulement identifié les mutations conférant une résistance et la maladie rechute clinique, mais aussi à condition que la compréhension des mécanismes de résistance et de principes régissant la fonction kinase 11,14 drogue. Ici, nous donnons des détails méthodologiques supplémentaires, en utilisant ruxolitinib et JAK2 comme une paire de cibles pharmaceutiques, afin de permettre une application plus large de cette stratégie de dépistage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">name of Materials/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:453px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell and Tissue culture&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaF3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td>
			<td>A gift from Ross Levine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-V617F-Cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-Luciferase-puro.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td>5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trapan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INCB018424 (Ruxolitinib)</td>
			<td>ChemieTeK</td>
			<td>941678-49-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL-1 red E.Coli cells</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>100mg/ml stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood&#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Expand long template PCR system</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1168134001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Sv gel and PCR clean up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Yield plasmid mini prep system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &#38; OmniMAX 2 Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12535029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#160; LR Clonase Enzyme mix&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td colspan="2">60316 and 60317</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

La découverte de BCR / ABL comme un oncogène du pilote dans la leucémie myéloïde chronique (LMC) ont abouti à l&#39;élaboration d&#39;Imatinib, ce qui, en fait, a démontré le potentiel de cibler la kinase dans les cancers en traitant efficacement les patients atteints de LMC. Cette observation a révolutionné le développement de médicaments afin de cibler les kinases oncogènes impliqués dans diverses autres tumeurs malignes, telles que, EGFR, B-RAF, KIT et PDGFR. Cependant, un inconvénient majeur des thérapies anti-kinase est l&#39;émergence de mutations de résistance aux médicaments rendant la cible pour avoir réduit ou perdu affinité pour le médicament. Comprendre les mécanismes employés par variants résistants non seulement aide à développer les inhibiteurs de la prochaine génération, mais donne aussi une impulsion à la gestion clinique utilisant la médecine personnalisée. Nous avons signalé une stratégie rétroviral de vecteur à base de dépistage pour identifier le spectre de résistance conférant mutations dans BCR / ABL, qui a aidé à développer la prochaine génération BCR / ABL inhibiteurs. Utilisation Ruxolitinib et JAK2 comme une paire de cibles pharmaceutiques, ici nous décrivent des méthodes de dépistage in vitro qui utilise les cellules BaF3 de la souris exprimant la bibliothèque de mutation aléatoire de kinase JAK2.

Émergence de mutations génétiques pose grand défi pour la thérapie de kinase lutte ciblée. Des études mutationnelles, en plus de fournir un aperçu mécanistes et fonctionnelles qui jouent un rôle dans la sélection et la conception de développement de médicaments de nouvelle génération, permet également une meilleure prise en charge clinique et peuvent à l&#39;avenir être plus utile pour le traitement personnalisé. Dans cette expérience, nous montrons le dépistage de mutations de résistance à ruxoli...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors at JoVE.com

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Emergence de la résistance génétique contre la thérapie d&#39;inhibiteur de kinase pose défi important pour la thérapie efficace contre le cancer. Identification et caractérisation des mutations de résistance contre un médicament nouvellement développé contribue à une meilleure gestion clinique et la conception de médicaments de la prochaine génération. Ici, nous décrivons notre protocole pour le dépistage in vitro et la validation de mutations résistantes.

Un procédé de criblage et de validation des mutations de résistance aux inhibiteurs de kinase

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K vues.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center.  Emergence de la résistance génétique contre la thérapie d'inhibiteur de kinase pose défi important pour la thérapie efficace contre le cancer. Identification et caractérisation des mutations de résistance contre un médicament nouvellement développé contribue à une meilleure gestion clinique et la conception de médicaments de la prochaine génération. Ici, nous décrivons notre protocole pour le dépistage in vitro et la validation de mutations résistan...

Vidéo: A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

Injection d&#39;un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Recherche

Biologie

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Application d&#39;une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and preventing new infections.  Furthermore, the emergence of multidrug resistant tuberculosis (MDRTB) means that detection of drug resistance is necessary for stopping the spread of drug-resistant strains.  The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of TB and MDRTB.  The MODS assay is based on three principles: 1) mycobacterium tuberculosis (MTB) grows faster in liquid media than on solid media 2) microscopic MTB growth can be detected earlier in liquid media than waiting for the macroscopic appearance of colonies on solid media, and that growth is characteristic of MTB, allowing it to be distinguished from atypical mycobacteria or fungal or bacterial contamination 3) the drugs isoniazid and rifampicin can be incorporated into the MODS assay to allow for simultaneous direct detection of MDRTB, obviating the need for subculture to perform an indirect drug susceptibility test. Competing current diagnostics are hampered by low sensitivity with sputum smear, long delays until diagnosis with solid media culture, prohibitively high cost with existing liquid media culture methods, and the need to do subculture for indirect drug susceptibility testing to detect MDRTB.  In contrast, the non-proprietary MODS method has a high sensitivity for TB and MDRTB, is a relatively rapid culture method, provides simultaneous drug susceptibility testing for MDRTB, and is accessible to resource-limited settings at just under $3 for testing for TB and MDRTB.

The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis (TB) and multidrug-resistant tuberculosis (MDRTB). This video describes the MODS liquid media culture method.

La méthode MODS pour le diagnostic de la tuberculose et la tuberculose multirésistante

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Conversion d&#39;un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d&#39;anticorps Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

ARN catalyseur en tant que reporter pour le criblage de médicaments contre l&#39;ARN Édition dans trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

Une méthode étape par étape pour détecter les anticorps neutralisants contre l’AAV à l’aide d’un test colorimétrique à base de cellules

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...