We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

l&#39;entretien des animaux et des protocoles expérimentaux ont été approuvés par les soins et l&#39;utilisation des comités institutionnels animales de l&#39;Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, et répondent à toutes les exigences de l&#39;Office NIH de laboratoire bien-être animal et de l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des animaux de laboratoire Care International. NOTE: Pour obtenir des larves pour l&#39;analyse ERG, publié protocoles pour l&#39;élevage du poisson zèbre standard et l&#39;entretien ont été employées 18. Les larves sont obtenus grâce à la sélection naturelle et logé sous un / 10 h cycle d&#39;obscurité 14 heures de lumière. Ce protocole a été optimisé pour les larves à 5-7 jours après la fécondation (DPF), mais pourrait idéalement être effectuées sur les poissons plus âgés avec de petites modifications de la procédure. Ici, utilisez la souche TL de type sauvage larves de poisson zèbre à 5 dpf. 1. Micropipette production <ol><li> Tirez plusieurs micropipettes utilisant 1,5 x 0,86 mm (diamètre extérieur par diamètre intérieur) capillaires en verre borosilicate poli-feu avecfilament (température de fusion, 821 ° C) et un P-97 Flaming / Brown Micropipette Extracteur équipé filament boîte de chaleur. Utilisez le programme pour façonner micropipettes décrits dans le tableau 1. </li><li> Vérifiez chaque micropipette sous un microscope avec un dirigeant du réticule appropriée pour assurer que les pourboires sont de 10 à 15 m de diamètre et a un embout lisse ouverture (ie, sans bords dentelés). </li><li> Stocker soigneusement micropipettes pour prévenir les dommages de la pointe et l&#39;exposition à la poussière. Les options de stockage comprennent des boîtes de Pétri avec du ruban de laboratoire, boîtes de mousse bordée, ou disponibles dans le commerce des conteneurs de stockage de micropipette. NOTE: D&#39;autres extracteurs de micropipette et de verre capillaires peuvent être utilisés aussi longtemps que le diamètre correct de la micropipette et une pointe de haute qualité est atteint. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pression </td><td> Chaleur </td><td> Tirer </td><td> Vitesse </td&gt; <td> Temps </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Programme pour la production de micro-pipettes l&#39;aide d&#39;un P-97 Flaming / marron Micropipette Extracteur équipé d&#39;un filament boîte de chaleur Micropipettes sont faites en utilisant 1,5 x 1,0 mm 2 (diamètre extérieur par diamètre intérieur) capillaires en verre borosilicate poli-feu avec filament. (température de fusion, 821 ° C). 2. Tampon Préparation <ol><li> Utilisation filtré, le tampon de Ringer oxygénée poisson rouge 19 dans le capillaire de micro-électrodes et pour saturer l&#39;éponge alcool polyvinylique (PVA), sur lequel les larves sont placés pour les expériences. Vous pouvez également utiliser l&#39;E3<html> médias d&#39;embryons ou solution saline équilibrée de Hank. </li><li> Préparer la solution de Ringer 10x poissons rouges comme décrit dans le tableau 2. ajuster le pH à 7,8 et stériliser l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,22 um et stocker le 10x stock à 4 ° C. </li><li> Créer une solution de travail le jour de l&#39;expérience en diluant la solution de Ringer à 1x 10x avec de l&#39;eau distillée déminéralisée. Filtrer au moyen d&#39;un système de filtre de 0,22 um. Oxygéner par barbotage avec 95% O 2/5% CO 2 gazeux pendant 10 minutes. Couvercle de la cuvette par la suite pour se assurer que la solution reste oxygéné. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1,25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glucose </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content »&gt; Tableau 2: Préparation de la solution de Ringer 10x poissons rouges. 3. Plateforme Électrorétinogramme <ol><li> Réaliser des expériences ERG sur une table anti-vibration à l&#39;intérieur d&#39;une cage de Faraday pour améliorer le rapport signal sur bruit. Fixez une plate-forme en acier personnalisé à la table anti-vibrations en utilisant les écrous hexagonaux. Placez une plate-forme en plastique mobile avec un polymère d&#39;uréthane amortisseur viscoélastique fond sur la table sous la source de lumière. </li><li> Placez la caméra avec un stand aimanté, visant vers le bas à la plate-forme en plastique mobile. Placez le micromanipulateur (qui tiendra la microélectrode d&#39;enregistrement) avec une deuxième cage aimantée à la droite de la plate-forme en plastique mobile. Assurez-vous que la caméra et micromanipulateur ne seront pas perturbés par le mouvement des autres équipements et qu&#39;ils ne bloquent pas l&#39;éclairage de la source lumineuse. </li><li> Branchez l&#39;appareil photo à un moniteur vidéo et le positionner pour voir l&#39;œil de lalarve pour placer l&#39;électrode dans la position correcte. </li><li> Assurez-vous que l&#39;installation est correctement mise à la terre avec du fil de cuivre. Pour vérifier le bruit, placer l&#39;électrode de référence et la pointe de la microélectrode d&#39;enregistrement dans une boîte de Pétri 35 mm rempli de la solution de Ringer. Vérifiez les niveaux de bruit électrique de l&#39;installation avec un oscilloscope ou d&#39;une fonctionnalité intégrée de l&#39;appareil ERG. Les niveaux de bruit ne devraient pas être plus de ± 10 mV par rapport au départ. </li></ol> 4. Préparation éponge <ol><li> Coupez un petit rectangle d&#39;éponge de PVA sec qui se ajuste bien dans un plat de 35 mm de Pétri. L&#39;épaisseur de l&#39;éponge ne doit pas être supérieure à la profondeur de la cuvette. Utilisez un couteau avec une lame de rasoir propre pour couper. </li><li> Faire une coupe supplémentaire dans l&#39;éponge pour accueillir l&#39;électrode de référence (soit une coupe peu profonde de la longueur sur le fond de l&#39;éponge ou un papillon couper verticalement à travers l&#39;une des extrémités plus petites). </li><li> Utilisez un marqueur résistant aux produits chimiquespour marquer un petit point sur l&#39;éponge (où la larve sera placé) qui peut être utilisé pour positionner la caméra vidéo. </li><li> Tremper l&#39;éponge PVA dans la solution de Ringer jusqu&#39;à saturation. Retirer et éponger rapidement sur une serviette de papier 2-3 fois. Placez l&#39;éponge dans un endroit propre 35 mm boîte de Petri. </li><li> Positionner la boîte de Pétri contenant de l&#39;éponge sur la plate-forme de matière plastique de telle sorte que la marque peut être visualisée par la caméra. </li></ol> 5. Préparation de l&#39;électrode REMARQUE: L&#39;installation se compose d&#39;un poisson zèbre électrode de référence en contact avec une solution saturée de PVA éponge de Ringer et une électrode d&#39;enregistrement en contact avec la cornée. L&#39;électrode de référence est constituée d&#39;une pastille Ag / AgCl. L&#39;électrode d&#39;enregistrement est une micro-pipette de verre tiré rempli de la solution de Ringer et détenus par un détenteur de microélectrodes contenant un fil Ag. <ol><li> Chlorure électrodes en les trempant dans 9.6% d&#39;hypochlorite de sodium (eau de Javel) pendant 5 minutes (le micr d&#39;enregistrementoelectrode fils) ou 15 min (l&#39;électrode de référence). Sécher à l&#39;air sur une Kimwipe pendant 5 min. <ol><li> Selon le style de coupe faite à l&#39;étape 4.2, placez le culot Ag / AgCl de l&#39;électrode de référence dans (pour la coupe papillon vertical) ou moins (pour la coupe peu profonde de la longueur sur le fond) l&#39;éponge. Attacher le fil d&#39;électrode de référence au système d&#39;enregistrement. </li><li> Alternativement, si la configuration ERG a des contraintes d&#39;espace ou il sont particulièrement fortes artefacts photovoltaïques de l&#39;électrode Ag / AgCl, connectez l&#39;électrode de référence à l&#39;éponge par un pont de sel et d&#39;agar pour déplacer l&#39;électrode sur le chemin de lumière. </li></ol></li><li> Fixez ~ 40 cm de tube de taille appropriée à une 5 ml non luer lock seringues. Remplir la seringue avec la solution de Ringer. titulaires de microélectrodes possédant ports de pression sont généralement livrés avec des adaptateurs pour accueillir des tubes avec des diamètres intérieurs de 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;ou 5/32&quot;. </li><li> Remplissez un 1 ml non luer lock seringue avecLa solution de Ringer et, en utilisant un micro-fil, remplissez soigneusement le titulaire de microélectrodes. Éviter la formation de bulles. </li><li> Fixer la seringue de 5 ml à l&#39;orifice de pression du support de microélectrodes avec des tubes et l&#39;utiliser pour faire en sorte que le support de micro-électrodes est rempli de la solution de Ringer. Utilisation de la Micro-fil et de 1 ml seringue remplie de solution de Ringer, remplir le verre de micropipette de la pointe et de se assurer qu&#39;aucune bulle sont présents. </li><li> Fixez la micropipette de verre pour le titulaire de microélectrodes, en faisant attention de garder la ligne droite de fil d&#39;électrode. Une fois fixé, utilisez la seringue de 5 ml pour forcer attentivement la solution de Ringer à travers le micro-électrodes jusqu&#39;à ce qu&#39;une petite quantité de solution est visible sur la pointe. Occasionnelle de pression à la seringue (lorsqu&#39;il ne est pas appliqué à la cornée) permettra d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air, ainsi que des occlusions dues à la poussière ou l&#39;accumulation de sels, dans la pointe de la micropipette. <ol><li> Si la solution apparaît comme un flux, remplacer le gmicropipette lass, que l&#39;ouverture de la pointe est trop grand ou est endommagée. </li></ol></li><li> Placez délicatement la microélectrode d&#39;enregistrement dans le micromanipulateur et fixer le fil au système d&#39;enregistrement. </li></ol> 6. Analyse Électrorétinogramme NOTE: En raison de la dominance de cône de la rétine larvaire, les résultats ERG de haute qualité peuvent être obtenus lorsque les préparatifs pour l&#39;enregistrement sont effectuées sous de faibles niveaux de lumière blanche indirecte (&lt;1 lux) ou avec de courtes périodes (&lt;1 min) d&#39;intensité supérieure ( ≤250 lux) lumière de travail. Une courte période d&#39;adaptation sombre est toujours nécessaire avant l&#39;enregistrement (voir l&#39;étape 6.7). Cependant, les expériences peuvent être effectuées sous une lumière rouge ou infrarouge dim aide d&#39;une caméra sensible à l&#39;infrarouge. Toutes les expériences ont été réalisées dans (0,22 um) de l&#39;eau du système de filtration stérilisé de la Facilité UNC poisson zèbre AquaCulture mais les médias d&#39;embryons alternatives peuvent être utilisées. <ol><li> Couper des carrés de serviettes en papier mesurant environ 1cm 2. </li><li> Si la mesure de potentiel isolée du récepteur de la masse de cône, incuber 3-5 larves dans de l&#39;eau du système avec 500 pM (±) -2-4-phosphonobutyrique-amino acides (APB) pendant 5 min. REMARQUE: Pendant APB est un mélange racémique de l&#39;actif (L) et inactifs (R) formes de AP4, il est aussi efficace que la L-AP4 et est moins coûteux. </li><li> Anesthetize 3-5 larves dans de l&#39;eau du système à 0,02% (p / v) jusqu&#39;à ce que tricaïne répond pas, environ 1-2 min. </li><li> Utilisez une pipette et pipette Pasteur pompe pour transférer attentivement larves individuelle sur des carrés de serviettes en papier sous un stéréoscope dissection en utilisant un éclairage minimal (≤250 lux pour &lt;1 min). Vérifiez la position de chaque larve et choisir un candidat qui est dorsale vers le haut avec un oeil non occlus. <ol><li> Pour les enregistrements étendus (&gt; 30 min), garder la larve humide en vitrage le corps jusqu&#39;à mais ne incluant pas la tête avec 3% de méthylcellulose l&#39;aide d&#39;un pinceau fin en poils de chameau. </li></ol></li><li> En utilisant des pinces, transférer le squar de serviette en papiere avec la larve à l&#39;éponge PVA humide. <ol><li> Pour les enregistrements étendus (&gt; 30 min), appliquer un flux continu d&#39;saturé d&#39;eau 100% O 2 gaz sur la larve par barbotage du gaz à travers un airstone dans un flacon bras latéral contenant de l&#39;eau distillée. Placez le tuyau sortant du flacon bras latéral qui transporte l&#39;oxygène humidifié près de la tête de la larve. REMARQUE: L&#39;étape 6.4.1 et 6.5.1 seront pas prolonger la vie du poisson 16. </li></ol></li><li> Sous un éclairage minimal, utiliser le micromanipulateur et la caméra de positionner la pointe de microélectrodes au milieu entre le nez et extrémités caudales de l&#39;œil et appuyez doucement sur la limite dorsale de la cornée. NOTE: Le mauvais positionnement de la pointe de l&#39;électrode aux zones distales loin de la cornée peut entraîner des formes d&#39;onde ERG de polarité inversée. </li><li> Laisser larve foncé adapter pendant 5-10 min. </li><li> Enregistrez le flash de test réponses à la lumière fournie par une source de lumière LED ou stimulateur optique utilisant le avaimatériel de stimulation et l&#39;enregistrement étiquette. Réglez les paramètres de protocole tels que l&#39;intensité du flash, flash longueur, la couleur flash, l&#39;intensité de fond et couleur et les réglages de filtre pour se adapter à l&#39;expérience. </li><li> Lorsque vous avez terminé avec l&#39;expérience, euthanasier larves selon les directives de l&#39;AVMA / IACUC. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans ce protocole, une procédure simple pour les enregistrements ERG de poisson zèbre larvaire est détaillé. Cette procédure permet une analyse rapide et complète de Visual function.There sont plusieurs étapes critiques tout au long de la procédure qui doit être gardé à l&#39;esprit. Les larves de poisson zèbre doit être en bonne santé avant l&#39;expérience pour éviter la mort au cours des traitements potentiels de la drogue et de se assurer des moyens de subsistance prolongée pendant les enregistremen...

L&#39;électrorétinogramme (ERG) est une méthode électrophysiologique non invasive qui a été largement utilisé en clinique pour déterminer la fonction de la rétine chez les humains. L&#39;activité électrique en réponse à un stimulus lumineux est mesuré en plaçant des électrodes d&#39;enregistrement sur la surface externe de la cornée. Les caractéristiques du modèle de stimulus et la forme d&#39;onde de réponse définissent les neurones rétiniens qui contribuent à la réponse. Cette méthode a été adaptée pour une utilisation avec un certain nombre de modèles animaux, y compris les souris et le poisson zèbre. La réponse ERG vertébrés typique a quatre composantes principales: l&#39;une d&#39;onde, qui est un potentiel de cornée négatif provenant de l&#39;activité des cellules photoréceptrices; la b-ondes, un potentiel de cornée positif dérivé de l&#39;ON cellules bipolaires; le d-ondes, un potentiel de cornée positif interprété comme l&#39;activité des cellules bipolaires OFF; et c-ondes, qui se produit quelques secondes après le b-ondes et reflète l&#39;activité dans la glie Müller et retInal épithélium pigmentaire 1-4. Références supplémentaires pour comprendre l&#39;histoire et les principes de l&#39;analyse ERG chez les humains et les animaux modèles sont le manuel en ligne, WebVision, de l&#39;Université de l&#39;Utah et des textes tels que les Principes et pratique de électrophysiologie clinique de Vision 4, 5. Danio rerio (poisson zèbre) a longtemps été privilégiée comme un modèle pour le développement des vertébrés, en raison de sa maturation et la transparence rapide, ce qui permet pour l&#39;analyse morphologique non invasive de systèmes d&#39;organes, les tests comportementaux et les deux avant et arrière écrans génétiques (pour revue, voir Fadool et Dowling 6). Larves de poisson zèbre sont prêtent très bien à la manipulation génétique et pharmacologique, qui, lorsqu&#39;il est couplé avec leur taux de fécondité élevé, en font un modèle animal excellente pour les analyses biologiques à haut débit. Le ratio plus élevé de cônes à des tiges chez le poisson zèbre larves - environ 1: 1 par rapport à des souris (~ 3% cônes) - rendent particulièrement utile pour l&#39;étude de la fonction de cône 7-9. Dans la rétine de vertébrés, cônes se développent avant 10 tiges. Fait intéressant, les cônes de poisson zèbre sont opérationnels dès 4 dpf, permettant une analyse électrophysiologique sélective des cônes à ce stade 6, 11,12. En revanche, les réponses ERG en tiges apparaissent entre 11 et 21 dpf 13. Par conséquent, larves de poisson zèbre à 4-7 servir dpf fonctionnellement comme une rétine tout-cône. Cependant, la réponse ERG photopique natif de 4-7 larves de DPF est dominée par la b-ondes. Application des agents pharmacologiques, tels que la L - (+) - 2-amino-4-phosphono-butyrique (L-AP4), un agoniste de glutamate métabotropique (mGluR6) récepteur exprimé par les cellules conductrices bipolaires, bloque efficacement la génération de la b-ondes et révèle le potentiel de masse isolée de cône du récepteur, (la «une vague») 14-17. Nous décrivons ici un simple et reliablméthode de e pour l&#39;analyse ERG en utilisant l&#39;équipement disponible dans le commerce ERG conçu pour une utilisation avec des souris qui ont été conçus pour être utilisés avec des larves de poisson zèbre. Ce système peut être utilisé sur des larves de poisson zèbre divers milieux génétiques, ainsi que ceux traités avec des agents pharmacologiques, pour aider les chercheurs à l&#39;identification des voies qui contribuent à la sensibilité visuelle et adaptation à la lumière 16 signalisation. Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole guideront les enquêteurs dans l&#39;utilisation de l&#39;analyse ERG pour répondre à une variété de questions biologiques relatives à la vision, et de démontrer la construction d&#39;une configuration souple ERG.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2170">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1504px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Faraday cage</td>
			<td>80/20 Inc</td>
			<td>custom</td>
			<td>Custom designed aluminum &#34;Industrial Erector Set&#34; for Cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVA sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000ZOWG1C</td>
			<td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 ml Sterile Filter systems</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Espion E2</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Colordome</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td>Holding and positioning the recording microelectrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic ring stand</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-025-MB</td>
			<td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lead extensions</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>F-LX</td>
			<td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:333px;">Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>DF-215/10</td>
			<td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Window screen frame (metal) and spline</td>
			<td>Lowes or Home Depot</td>
			<td>various</td>
			<td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steriflip 50 ml filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC adaptor</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>4127</td>
			<td>Connecting camera to BNC cable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC cable</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>626</td>
			<td>Connecting camera to video adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1582232</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera coupler</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1501149</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td>
			<td>Sewell</td>
			<td>SW-29297-PRO</td>
			<td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APB</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1910</td>
			<td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF-150-86-10</td>
			<td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&#176;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P97 Flaming/Brown puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>For pulling glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorbothane sheet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SB12A</td>
			<td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>B2436F</td>
			<td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Passive Isolation Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PWA074</td>
			<td>Provides vibration isolation to breadboard</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper mesh</td>
			<td>TWP</td>
			<td>022X022C0150W36T</td>
			<td>To line Faraday Cage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera</td>
			<td>Watec</td>
			<td>WAT-902B</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-fil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH2SW15</td>
			<td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DRIREF-5SH</td>
			<td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode (alternative)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-noise cable for Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>13620</td>
			<td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

L&#39;électrorétinogramme (ERG) est une méthode non invasive électrophysiologique pour déterminer la fonction rétinienne. Grâce à la mise en place d&#39;une électrode sur la surface de la cornée, l&#39;activité électrique généré en réponse à la lumière peut être mesurée et utilisée pour évaluer l&#39;activité des cellules rétiniennes in vivo. Ce manuscrit décrit l&#39;utilisation de l&#39;ERG pour mesurer la fonction visuelle chez le poisson zèbre. Poisson zèbre ont longtemps été utilisé comme un modèle pour le développement des vertébrés raison de la facilité de la suppression de gènes par des oligonucléotides morpholino et la manipulation pharmacologique. A 5-10 dpf, seuls les cônes sont fonctionnelles dans la rétine des larves. Par conséquent, le poisson zèbre, la différence d&#39;autres animaux, est un puissant système modèle pour l&#39;étude de la fonction visuelle cône in vivo. Ce protocole utilise l&#39;anesthésie standard, micromanipulation et protocoles stéréomicroscopie qui sont communs dans les laboratoires qui effectuent des recherches de poisson zèbre. Les méthodes décrites font usage de l&#39;équation d&#39;électrophysiologie normeATION et une caméra basse lumière pour guider le placement du micro-électrodes d&#39;enregistrement sur la cornée larvaire. Enfin, nous démontrons comment un ERG stimulateur / enregistreur disponible dans le commerce à l&#39;origine conçu pour une utilisation avec des souris peut facilement être adapté pour une utilisation avec le poisson zèbre. ERG de poisson zèbre larves fournit une excellente méthode de dosage cône fonction visuelle chez les animaux qui ont été modifiés par injection d&#39;oligonucléotides morpholino ainsi que des techniques d&#39;ingénierie des génomes plus récents tels que Zinc Finger nucléases (ZFN), Transcription Activator-Like effecteur nucléases (TALENs), et cluster régulièrement espacées courtes répétitions palindromiques (CRISPR) / Cas9, qui ont tous fortement augmenté l&#39;efficacité et l&#39;efficacité du ciblage de gène chez le poisson zèbre. En outre, nous profitons de la capacité des agents pharmacologiques pour pénétrer larves de poisson zèbre pour évaluer les composants moléculaires qui contribuent à la photoréponse. Ce protocole décrit une configuration qui peut être modifié et utilisé par les chercheursavec différents objectifs expérimentaux.

Typiquement, ERG sont enregistrées à partir de larves de poisson zèbre à 5 dpf, depuis un certain nombre d&#39;études ont publié des enregistrements ERG à ce stade neuf, 16,20. Réponses larvaires ont été mesurés dans des conditions adaptés à l&#39;obscurité sans éclairage de fond en utilisant un stimulus 20 msec de lumière LED blanche. Nous avons utilisé un système ERG disponible dans le commerce constitué d&#39;un stimulateur de lumière Ganzfeld et l&#39;ordinateur contrôleur / enregistr...

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Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Électrorétinogramme Analyse de la réponse visuelle chez le poisson zèbre larves

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K vues.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Vidéo: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Recherche

Neurosciences

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbation de l&#39;activité neuronale avec illumination laser à semi-intactes<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Analyses comportementales automatisés à haut débit dans les embryons de poisson zèbre

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

La réponse optocinétique comme une mesure quantitative de l&#39;acuité visuelle chez le poisson zèbre

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Utilisation de la Électrorétinogramme pour évaluer la fonction dans le Retina rongeurs et les effets protecteurs de la distance préconditionnement ischémique Limb

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

Utilisant la tomographie par cohérence optique et réponse optocinétique comme lectures structurale et fonctionnelle de système visuel chez les souris et les Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

Utilisation des larves de Zébrafish pour étudier les conséquences pathologiques de l’AVC hémorragique

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

Imagerie in vivo de tissu cérébral entièrement actif chez des larves et des juvéniles de poissons-zèbres éveillés par enlèvement du crâne et de la peau

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...