This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. Ion sélectif auto-référencement microélectrodes Préparation <ol><li> Préparation de micro-électrodes à sélectivité ionique <ol><li> Chaleur tirer minces capillaires de borosilicate paroi sans filament (diamètre extérieur de 1,5 mm, 1,12 mm de diamètre interne) à l&#39;aide d&#39;un extracteur de microélectrodes. Remarque: Cela donne des conseils 3-4 m de diamètre. Les petites pointes ont une résistance plus élevée qui le rend plus sensible aux micro-électrodes bruit électronique et est également associée à une réponse plus lente à un changement de concentration d&#39;ions. Des informations utiles peuvent être trouvées dans le document publié par Smith et al. 26. </li><li> Silaniser les électrodes pour rendre la surface hydrophobe interne pour faciliter la rétention de l&#39;ionophore cocktail lipophile. Placez les microélectrodes dans un support en métal et la chaleur O / N dans un four à&gt; 100 ° C pour les sécher. Le rack est une plaque de métal avec des trous de 2 mm de diamètre foré partie du chemin à travers. Placer les électrodes dans les trous bascule vers le haut avec un 250 ml gbécher lass sur eux. </li><li> Dans la matinée, éteindre le four et, tout en portant des gants isolants, retirez avec précaution le support en métal avec les électrodes et bécher en place. Fermez la porte du four pour conserver la chaleur. </li><li> Porter des gants en latex ou en nitrile, blouse de laboratoire et une protection oculaire. Avec une pipette Pasteur en plastique, placer une goutte de solution de silanisation I à la base de chaque électrode (garder le bécher en place; utiliser le bec verseur pour l&#39;accès de la pipette). La solution de silanisation est vaporisé par la plaque chauffante et silanizes l&#39;intérieur des électrodes. Utilisez une hotte d&#39;extraction chimique pour cette étape. Placer la grille / bécher / électrodes de retour dans le four chaud pendant quelques heures pour permettre à toute solution de silanisation restant à évaporer. Remarque: Pour des raisons de sécurité, ne mettez pas le four en marche. Placer une étiquette sur le four qui indique qu&#39;il ne doit pas être mis sous tension car elle peut contenir de la vapeur nocifs et inflammables. </li><li> Après refroidissement, stocker les microélectrodes dans un bocal insi de stockage de microélectrodesdé un dessiccateur en verre avec 400 g d&#39;agent déshydratant. Microélectrodes peuvent être stockées ainsi pendant plusieurs semaines. Note: Une méthode de silanisation alternatif est décrit dans Smith et al 26. </li><li> Retour-remplir la microélectrode de 50 à 100 pi (une longueur d&#39;environ 1 cm) d&#39;une solution contenant 100 mM de l&#39;ion à mesurer (voir tableau 1 et figure 1B). Utilisez un plastique jetable pipette Pasteur chaleur tiré dans un brûleur Bunsen d&#39;une amende filament. Rincer la pipette dans dH 2 O tard pour empêcher le blocage. Remarque: En variante, ajuster la concentration en ions de la solution de remblayage pour correspondre à la concentration de l&#39;ion dans la solution externe 27. </li><li> Observer la microélectrode sous un microscope à dissection pour assurer l&#39;absence de bulles d&#39;air. <ol><li> Si des bulles sont présentes robinet la microélectrode légèrement avec un ongle tout en maintenant l&#39;électrode verticalement (pointe vers le bas) et / ou pousser la bulles à la pointe en appliquant une contre-pression à l&#39;aide d&#39;une seringue modifié avec un tube de silicone de remplacer l&#39;aiguille. </li></ol></li><li> Tip-remplir la microélectrode de 15 à 20 nl (une longueur de 30-50 um) de spécifique-ion ionophore cocktail (voir le tableau 1). Placer une petite goutte de ionophore cocktail sur le bord court d&#39;une lame de microscope. Observez la pointe de microélectrodes sous un microscope de dissection et le déplacer vers la lame de microscope jusqu&#39;à ce que la pointe de microélectrodes touche le cocktail ionophore pour seulement environ un demi-sec. Dessinez le cocktail ionophore dans le microélectrodes par la pression capillaire. Note: Eviter une longue colonne de ionophore cocktail car cela augmente la résistance électrique de la sonde qui peut le rendre sensible aux interférences électroniques (bruit) et ralentit également le temps de réponse. </li><li> Montez le microélectrodes dans un support de microélectrodes droite avec un 1 mm connecteur mâle de l&#39;or et AgCl (Ag +) fil (figure 1B). &lt;/ Li&gt; <li> Fixer le support de micro-électrodes à l&#39;étage de tête monté sur un micropositionneur électronique tridimensionnel commandé par ordinateur (figure 1A). </li><li> Placez la pointe de microélectrodes dans la mesure de solution appropriée pour l&#39;échantillon à mesurer (sérum physiologique, milieu de culture, etc.) pour permettre la microélectrode se stabiliser pendant une heure ou deux, ou même la nuit. </li></ol></li><li> Préparation de l&#39;électrode de référence <ol><li> Les électrodes de référence (Figure 1C) sont les mêmes que ci-dessus capillaires. Couper le capillaire avec un crayon de diamant en 5 cm de longueur et le feu-brillant à chaque extrémité pour 1-2 sec dans un bec Bunsen. </li><li> Remplir avec ces électrodes ~ 200 ul d&#39;une solution 3 M de NaCl, CH 3 CO 2 K (acétate de potassium) ou de KCl avec 2% d&#39;agarose. Choisissez la solution en fonction de l&#39;ion à mesurer (l&#39;électrode de référence ne doit pas contenir l&#39;ion mesuré; voir le tableau 1). Mélangerl&#39;agarose et la solution et on chauffe à l&#39;ébullition presque dans un micro-ondes. Remuez pour dissoudre la gélose (la solution va clair). </li><li> Fixez l&#39;électrode de référence à une pipette Pasteur en plastique et tirer la solution chaude dans le capillaire. </li><li> Déposer l&#39;électrode dans le froid 3 M de NaCl, CH 3 CO 2 K ou d&#39;une solution de KCl et le ranger dans cette solution 3 M dans des tubes scellés avant de les utiliser. Jeter les électrodes de référence avec des bulles d&#39;air. </li><li> Monter l&#39;électrode de référence dans un support de microélectrodes droite culot (pré-remplie avec une solution 3 M) avec un AgCl (Ag +) à l&#39;intérieur et une médaille d&#39;or de 2 mm connecteur mâle (figure 1C) et fixer l&#39;électrode et porte sur un micro-positionneur manuel monté sur un support magnétique. </li></ol></li></ol> 2. Ion sélectif auto-référencement microélectrodes Calibration <ol><li> Préparation des solutions d&#39;étalonnage contenant l&#39;ion d&#39;intérêt que dans la solution de référence; voir le tableau 1 </strong&gt;. SUPPORT la concentration qui est dans la solution de l&#39;échantillon sera (par exemple de milieux de culture, le sérum physiologique). Autrement dit, une solution d&#39;étalonnage doit contenir une concentration plus faible de l&#39;ion que dans la solution de mesure, et l&#39;un plus élevé. <ol><li> Par exemple, utiliser une solution saline qui contient 1 mM de K +. Au support de cette concentration, on dissout la poudre dans de l&#39;eau désionisée de KCl à une concentration de 10, 1 et 0,1 mM dans des dilutions en série. Utilisez ces solutions d&#39;étalonnage. Sinon, utilisez au moins deux de ces solutions. </li></ol></li><li> Plonger la microélectrodes sélectives d&#39;ions et l&#39;électrode de référence dans chaque solution d&#39;étalonnage et laissez la valeur de tension se stabiliser pendant 1 à 3 min avant d&#39;enregistrer la tension correspondante en utilisant le logiciel dédié (voir le tableau 1). </li><li> Comme le logiciel enregistre les données (de sortie de l&#39;amplificateur) comme un fichier txt, copier les données dans un fichier tableur. Tracer la sortie de micro-électrodes (mV) en fonction du logarithme dela concentration molaire d&#39;ions (Figure 2A). </li><li> Appliquer une régression linéaire et calculer la pente de Nernst, intercepter et R valeur 2. Accepter la microélectrode si la pente de Nernst est de 58 ± 11 mV / décade pour les ions monovalents et 29 ± 11 mV / décade pour les ions bivalents (pour les cations, la pente de Nernst est positif, pour les anions elle est négative). De plus, les bons micro-électrodes doivent avoir une forte corrélation linéaire (R 2&gt; 0,9; Figure 2B). Remarque: La sortie mV de l&#39;amplificateur utilisé ici donne lecture mV avec un gain de dix. Les valeurs doivent être divisée par un facteur de dix. </li><li> Utilisation de la formule de régression linéaire pour convertir la sortie mV brut de la microélectrode en concentration d&#39;ions réelle (figure 2B). </li></ol> 3. Validation de la technique de microélectrodes Ion sélectif <ol><li> Préparation d&#39;une source artificielle <ol><li> Capillaires sources artificielles sont les mêmes que les capillairesci-dessus. Chaleur tirer le capillaire à l&#39;aide d&#39;un extracteur de microélectrodes comme à l&#39;étape 1.1.1. </li><li> Remblai ces capillaires avec 200 ul d&#39;une solution de NaCl, KCl 1 M, CaCl2 2 H 2 O ou un pH de 4 tampons. Choisir la solution de source artificielle en fonction de l&#39;ion à mesurer (voir le tableau 1). Remarque: vous pouvez tirer électrodes avec un plus grand diamètre pointe (~ 20 um) et pointe remplir avec les mêmes solutions, mais contenant 0,5-1% agarose (agarose permettra d&#39;éviter tout écoulement masse de la solution). </li><li> Montez le capillaire de source artificielle sur un micromanipulateur et la plonger dans la solution utilisée pour mesurer le flux de l&#39;ion dans les échantillons. Laisser la source artificielle dans la solution pendant 30 min à 1 h pour permettre la stabilisation de la pente. </li></ol></li><li> Validation de la micro-électrode sélective d&#39;ions <ol><li> Immerger la microélectrode sélective d&#39;ions d&#39;environ un centimètre de distance à partir de la source artificielle capillaire dans la solution utilisée pour mesure le flux d&#39;ions sur les échantillons et fermer le circuit avec l&#39;électrode de référence comme avant. Soit la valeur de la tension à stabiliser pendant 1 à 3 minutes avant l&#39;enregistrement de la tension correspondant à l&#39;aide du logiciel dédié pendant 1 à 2 min. Cette valeur correspond à la valeur de la mémoire tampon (dans la littérature a également évoqué comme référence, de fond ou de la valeur à blanc). </li><li> Déplacer la microélectrode sélective d&#39;ions à environ 5 um à partir de la source artificielle et soit la valeur de tension pour stabiliser 1 à 3 minutes avant l&#39;enregistrement de la tension correspondant à l&#39;aide du logiciel pendant 1 à 2 min. </li><li> Répéter la procédure ci-dessus en plaçant l&#39;ion sélectif microélectrode à 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 et 1 280 um à une distance capillaire de la source artificielle. </li><li> Extraire les données dans un fichier txt et copier les valeurs dans une feuille de calcul. </li></ol></li><li> Calculer la concentration en ions correspondant aux valeurs mV de la même façon que pour les valeurs de calibrage. Tracer la valeur. Nonte: Si un flux d&#39;ions est présente, la microélectrode détecte une différence de concentration d&#39;ions entre les deux positions (figure 3B). Si la source artificielle contient plus d&#39;ions de l&#39;espèce mesurée de la solution, la concentration doit être supérieure à proximité de la source de loin, la validation de la capacité du micro-électrode sélective d&#39;ions à détecter correctement la direction d&#39;un flux d&#39;ions (dans ce cas, efflux; pour un évier artificielle, avec la concentration d&#39;ions spécifique inférieur milieu de mesure, il devrait être afflux). <ol><li> Calculer le flux d&#39;ions en utilisant la loi de diffusion de Fick: J = c μ (dc / dx) où c est la concentration d&#39;ions dans la solution (mol cm -3), μ est la mobilité d&#39;ions (mole cm N -1 s -1) et dc est la différence de concentration au-dessus de distance dx (cm) (figure 2C). Les données de flux d&#39;ions sont habituellement présentés en pmol cm -2 s-1 Cm -2 ou nmol sec -1. Remarque:.. Une autre méthode de calcul de flux d&#39;ions décrite par Smith et al 26 peut être utilisé. Les différences comprennent l&#39;utilisation du coefficient de diffusion au lieu de la mobilité des ions et la soustraction de l&#39;arrière-plan du flux d&#39;ions (aussi dériver tension ou le facteur de correction) calculé à partir de la mesure du flux d&#39;ions dans une solution saline sans échantillon. </li><li> Tracer la moyenne des flux d&#39;ions de chaque étape sur la distance de la source (figure 2D). Se déplacer loin de la source, d&#39;observer une décroissance exponentielle de la valeur du flux validation de la capacité du micro-électrode à sélectivité ionique pour détecter grandeur différente de flux d&#39;ions. </li><li> Faites la validation de la source artificielle une fois pour chaque ion spécifique destinée à être enregistrée afin de valider ses sens et l&#39;ampleur des mesures correctes avec un grand n signal-ratio d&#39;oise. Note: Ion mesure de flux de la mémoire tampon sans échantillons indique le niveau ou bruit de fond. Typiquement, la mesure de la mémoire tampon montre pas de fluctuation claire de la concentration d&#39;ions conduisant à très faible flux qui affiche des directions variables. </li></ol></li></ol> 4. Préparation de la Chambre de mesure Remarque: Avant d&#39;expériences, envisager l&#39;échantillon à mesurer et comment l&#39;échantillon doit être monté et immobilisé pour des mesures de microélectrodes. <ol><li> Pour Xenopus laevis mesures d&#39;ovocytes couper un carré de 1 cm d&#39;une maille de 800 um de nylon (Nitex mesh) et le coller dans une boîte de Petri en plastique (figure 1E). </li></ol> 5. Flux mesure Ion <ol><li> Mesurer la concentration d&#39;ions présents dans le tampon utilisé pour effectuer les mesures sur l&#39;échantillon de la même manière que pour la solution d&#39;étalonnage. X. laevis ovocytes exigent Ringer modification de Mark (ROR). RÉissolve NaCl, KCl, CaCl, et HEPES MgCl dans de l&#39;eau désionisée pour atteindre une concentration finale de (mM): NaCl 100, KCl 2, CaCl 2, MgCl 1 et 5 HEPES. Ajuster le pH du tampon à 7,5 en utilisant du NaOH. </li><li> Placer l&#39;échantillon dans la chambre de mesure et pour apporter le micro-électrode sélective d&#39;ions à proximité de l&#39;échantillon (environ 10 pm environ) en utilisant le micropositionneur pour définir la position proche de la microélectrode (figure 3A). </li><li> Lancer l&#39;excursion basse fréquence (0,3 Hz) (100 um) de la micro-électrode entre la position rapprochée et une position éloignée de l&#39;échantillon (à distance) à l&#39;aide du logiciel dédié. Assurez-vous que le mouvement de la microélectrode est perpendiculaire à la surface de l&#39;échantillon. Remarque: L&#39;excursion de la microélectrode peut être réglé sur le logiciel. Grand excursion augmente le gradient de lecture permettant une détection plus facile des petites flux pendant le temps de mesure allonge l&#39;intervalle d&#39;échantillonnage et diminue la résolution temporelle. Voir <strong&gt; Figure 3A pour un exemple. </li><li> Lancer l&#39;enregistrement à l&#39;aide du logiciel. La microélectrode fait une pause au niveau de chaque position et le potentiel électrique en mV est enregistré sur l&#39;ordinateur. Obtenir des mesures pendant au moins 2 min, ce qui permet la stabilisation de signal. Pour les courtes expériences time-lapse, fiche variations potentielles à la position de l&#39;intérêt pour l&#39;ensemble du cours du temps. </li><li> Extraire les données dans un fichier txt et copier les valeurs dans une feuille de calcul. </li><li> Calculer la concentration en ions correspondant aux valeurs mV de la même façon que pour les valeurs de calibrage. Tracer la valeur. Remarque: si un flux d&#39;ions est présente, la microélectrode détecte une différence de concentration d&#39;ions entre les deux positions (figure 3B). </li><li> Calculer le flux d&#39;ions en utilisant la loi de diffusion de Fick que précédemment (étape 3.3.1). </li><li> Répéter la mesure de la mémoire tampon avant de mesurer un nouvel échantillon et répéter la procédure de mesure de flux et de calcul pour chaque nouveauéchantillon. </li></ol> 6. Analyse statistique et présentation des données <ol><li> Testez les effets indépendants de la position et / ou du temps sur les flux d&#39;ions sous la condition de commande en utilisant un modèle d&#39;analyse de covariance avec des effets mixtes 28. Remarque: L&#39;analyse de covariance (ANCOVA) est un modèle linéaire général qui mêle régulière ANOVA et de régression en permettant des mesures à la fois qualitatives et continues à être utilisés comme variables indépendantes. En outre, en présence d&#39;erreurs corrélées induits par des mesures répétées par des effets imbriqués individuels et éventuels, les modèles à effets mixtes sont utilisés pour modéliser des estimations précises des deux effets fixes et aléatoires. </li><li> Calculer les comparaisons par paires à l&#39;aide de t -test des étudiants entre les niveaux de groupe avec correction de Bonferroni pour les tests multiples 28. </li><li> Générer des boîtes à moustaches pour résumer mesures de flux ionique selon la position et l&#39;heure. Inclure les valeurs de p de la paire de Student décritci-dessus (Figure 3D) et indiquer les niveaux de p valeurs de signification comme suit: *: p &lt;0,05; **: P &lt;0,01; ***: P &lt;0,001 29 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Les étapes les plus critiques pour la mesure réussie de flux ioniques extracellulaires in vivo sont les suivants: la réduction du bruit, la fabrication correcte du microélectrodes référence et électrode à sélectivité ionique, et le positionnement de l&#39;échantillon et les deux électrodes. Afin de minimiser le bruit, le système d&#39;enregistrement doit être mis à la terre dans un (terre) de préférence cage de Faraday avec un (isolation des vibrations) surmonté ta...

<html> Toutes les cellules animales sont entourées d&#39;une membrane de bicouche lipidique, qui sépare le cytoplasme de l&#39;environnement extérieur. La cellule maintient un potentiel de membrane électrique, négative à l&#39;intérieur, par transport actif des ions 1. Le potentiel de membrane est une source d&#39;énergie stockée qui peut utiliser la cellule pour faire fonctionner divers dispositifs moléculaires dans la membrane 2. Les neurones et les autres cellules excitables ont de grands potentiels de membrane. Ouverture rapide des canaux sodiques potentiel effondre la membrane (dépolarisation) et produit le potentiel d&#39;action qui est transporté le long de la longueur du neurone 2. En plus de ces changements rapides électriques, de nombreux tissus et organes et à maintenir génèrent des potentiels électriques significatifs à long terme. Par exemple, la peau et la cornée épithélium génèrent et entretiennent potentiels trans-épithéliales et des courants électriques extracellulaires par le pompage des ions directionnelle (principalement de sodium et de chlorure) 3. tente &quot;&gt; Bien que les mesures de courant électrique extracellulaire endogène en utilisant la sonde vibrante 6/4 et des mesures de la membrane ou trans-épithéliales potentiels à l&#39;aide du système de micro-électrodes 7-10 permettre la mesure des paramètres électriques des membranes cellulaires et des couches de cellules épithéliales, ils ne donnent pas de indication de l&#39;espèce d&#39;ions concernés. Microélectrodes avec ionophore sélectif peuvent mesurer la concentration d&#39;ions en solution spécifique. Gradients d&#39;ions ou de flux peuvent être mesurés avec deux ou plusieurs électrodes à différentes positions. Cependant, la variation de la tension intrinsèque de chaque sonde serait différent, causant des mesures inexactes ou même la détection d&#39;un gradient qui était absent. Une électrode unique est utilisé en mode &quot;auto-référencement&quot; grâce à quoi il se déplace à basse fréquence entre deux points permet de résoudre ce problème. Maintenant, le flux d&#39;ions peut être vu dans le contexte d&#39;une dérive du signal relativement lent et stable (voir la figure 3B). </p&gt; Le système de mesure sensible aux ions utilise microélectrodes auto-référence à sélectivité ionique pour détecter de petits flux extracellulaires des ions près des tissus ou des cellules individuelles. Le système est constitué d&#39;un amplificateur qui traite le signal de la microélectrode et un micro-moteur pas à pas et le pilote pour commander le mouvement de la microélectrode. Le micro-électrodes à sélectivité ionique et l&#39;électrode de référence qui ferment le circuit sont connectées à l&#39;amplificateur par l&#39;intermédiaire d&#39;un pré-amplificateur headstage (figure 1A). Logiciels détermine les paramètres du mouvement de micro-électrodes (fréquence, distance) et enregistre également la sortie de l&#39;amplificateur. Le moteur pas à pas commande le mouvement de micro-électrodes par l&#39;intermédiaire d&#39;un micropositionneur tridimensionnel. Une faible fréquence de vibration microélectrodes sélectives d&#39;ions a été développé en 1990 pour mesurer le flux de calcium spécifique 11. Ainsi que du calcium, des cocktails ionophores commercialement accessibles sont maintenant disponibles pour faire MICRoelectrodes sensible au sodium, chlorure, potassium, l&#39;hydrogène, le magnésium, le nitrate d&#39;ammonium, le fluorure de lithium, ou du mercure. Fondamentalement, la technique de micro-électrodes à sélectivité ionique auto-référencement convertit l&#39;activité d&#39;un ion spécifique dissous dans une solution à un potentiel électrique, qui peut être mesurée par un voltmètre. Le cocktail d&#39;ionophore est un liquide non miscible (, organique lipophile) de phase ayant des propriétés d&#39;échange d&#39;ions. L&#39;ionophore forme un complexe se lie sélectivement (ions spécifiques) et les transfère de façon réversible entre la solution aqueuse contenue dans la micro-électrode (électrolyte) et la solution aqueuse dans laquelle est immergée la microélectrode (Figure 1D). Ce transfert d&#39;ions conduit à un équilibre électrochimique et une variation du potentiel électrique entre la micro-électrode et l&#39;électrode de référence est mesurée par le voltmètre. La tension est proportionnelle au logarithme de l&#39;activité spécifique d&#39;ions selon la Nernst equation permettant le calcul de la concentration d&#39;ions (Figure 2A et B). À l&#39;heure actuelle, plusieurs systèmes permettent la mesure du flux d&#39;ions en utilisant un concept ou un principe similaire. Par exemple, l&#39;électrode Technique Scanning Ion sélectif (SIET) 12,13 ou le (MIFE) technique microélectrodes Ion Flux Estimation développé par Newman et Shabala 14-16 sont disponibles dans le commerce et largement utilisé par la communauté de recherche afin de déterminer ion spécifique fondants se produisant à la membrane cellulaire et tissulaire à travers une variété d&#39;animaux, de plantes et de modèles cellulaires de vie simples. Microélectrodes ioniques sélectives ont été utilisées pour mesurer l&#39;hydrogène, le potassium et le flux de calcium dans les racines des plantes 17, le chlorure de flux dans rat artères cérébrales 18 et dans les tubes polliniques 19, flux d&#39;hydrogène dans des cellules rétiniennes patin 20, le flux de calcium dans les os de la souris 21, divers ions flux dans hyphes 22 et dans rà 23 cornée, et enfin le flux de calcium pendant la plaie d&#39;une cellule unique de guérison 12,24. Voir aussi le commentaire pour plus d&#39;informations sur l&#39;auto-référencement microélectrodes sélectives d&#39;ions 25. L&#39;article suivant décrit en détail la façon de préparer et d&#39;effectuer la mesure des flux d&#39;ions extracellulaires endogènes en utilisant la technique de micro-électrodes ion-sélective auto-référencement au niveau de la cellule unique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IonAmp&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonAmp32&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage pre-amplifier</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>INA116</td>
			<td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroStep Driver</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micropositioner&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>Model KITE-R</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Model M10</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table&#160;&#160;</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model VW-3036-OPT-023040</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&#176;, slotted faces</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model 360-90</td>
			<td>Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>460PD-X</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td>
			<td>Newport Inc.</td>
			<td>460A-XY</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>&#160;PC-10</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal rack</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>none</td>
			<td>Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>QL</td>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85126</td>
			<td>Hazardous, handle as recommended by provider&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish; Pyrex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode/micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>E215</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-595E</td>
			<td>Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597722</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S97329</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QSW-A15P</td>
			<td>with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3S</td>
			<td>with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60872-306</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh</td>
			<td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td>
			<td>NTX750</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue; Loctite epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500043-451</td>
			<td>Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>99053</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>none</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique

Les cellules provenant d&#39;animaux, des plantes et des cellules individuelles sont entourées par une barrière dite de la membrane cellulaire qui sépare le cytoplasme de l&#39;extérieur. des couches de cellules telles que les épithéliums forment également une barrière qui sépare l&#39;intérieur ou de l&#39;extérieur des compartiments différents d&#39;organismes multicellulaires. Une caractéristique clé de ces obstacles est la répartition différentielle des ions à travers les membranes cellulaires ou des couches de cellules. Deux propriétés permettent cette distribution: 1) les membranes et les épithéliums afficher perméabilité sélective aux ions spécifiques; 2) les ions sont transportés à travers des pompes à travers les membranes cellulaires et les couches de cellules. Ces propriétés jouent un rôle crucial dans le maintien de la physiologie des tissus et agissent comme des signaux de signalisation après les dommages, lors de la réparation, ou sous condition pathologique. L&#39;auto-microélectrode référence à sélectivité ionique permet la mesure de flux spécifiques des ions tels que calcium, de potassium ou de sodium à des niveaux de cellules et de tissus simples. Le microélectrodes contient un cocktail de ionophore qui estsélectivement perméable à un ion particulier. La solution de remplissage interne contient une concentration d&#39;ensemble de l&#39;ion d&#39;intérêt. Le potentiel électrique de la micro-électrode est déterminée par la concentration à l&#39;extérieur de l&#39;ion. Comme la concentration en ions varie, le potentiel de la micro-électrode varie en fonction du logarithme de l&#39;activité des ions. En cas de déplacement d&#39;avant en arrière près d&#39;une source ou un puits de l&#39;ion (par exemple dans un gradient de concentration en raison de flux d&#39;ions) le potentiel de microélectrodes fluctue à une amplitude proportionnel au flux d&#39;ions / gradient. L&#39;amplificateur amplifie le signal de micro-électrodes et dont la sortie est enregistré sur l&#39;ordinateur. Le flux ionique peut alors être calculée par la loi de diffusion de Fick en utilisant l&#39;électrode de potentiel de fluctuation, l&#39;excursion de micro-électrodes, et d&#39;autres paramètres tels que la mobilité d&#39;ions spécifique. Dans cet article, nous décrivons en détail la méthodologie pour mesurer les flux d&#39;ions extracellulaires en utilisant l&#39;auto-référencement microélectrodes un sélective d&#39;ionsD présenter quelques résultats représentatifs.

Nous avons précédemment montré que l&#39;afflux de calcium apparaît après une seule cellule 24 blessés. Nous avons donc demandé si d&#39;autres flux d&#39;ions se produisent lors d&#39;une lésion d&#39;une cellule unique. Nous avons utilisé le X. laevis ovocytes, un modèle bien établi pour la cellule cicatrisation seule 30-34 et l&#39;enregistrement électrophysiologique 24,35-39. Fait intéressant, les ions potassium sont plus concentrées à l&#39;intérieur de ...

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Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Mesure de extracellulaire Ion flux Utilisation de l&#39;Ion sélectif microélectrodes Technique d&#39;auto-référencement

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

measurement-extracellular-ion-fluxes-using-ion-selective-self

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K vues.  University of California, Davis. Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Vidéo: Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recherche

Biologie

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

Rappel d&#39;une courbe Ion Channel IV Utilisation des composants de fréquence

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Mesurer les flux de calcium dans les cardiomyocytes rapide

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caractérisation fonctionnelle de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Echangeurs de intracellulaire Compartiments utilisant la sélection Proton-tuant les exprimer à la membrane plasmique

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Techniques pour l&#39;analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour Déterminer glycolytique Taux

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Détermination de la surface de la cellule relative et d&#39;expression totale de Recombinant Canaux ioniques par cytométrie en flux

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...