This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. 이온 선택적 자체 참조 바께 미세 준비 <ol><li> 이온 선택성 미소 전극의 제조 <ol><li> 열은 미세 풀러를 사용하여 필라멘트 (1.5 mm 외경 1.12 mm 내경)없이 얇은 벽으로 둘러싸인 붕규산 모세 혈관을 당깁니다. 참고 :이 팁을 직경 3-4 μm의를 제공합니다. 작은 팁 전자 노이즈에 미소 전극이 더 민감하게하고 또한 이온 농도의 변화에​​ 더 느리게 응답과 연관된 더 높은 저항을 갖는다. 유용한 정보는 스미스 외. (26)에 의해 발표 된 논문에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 친 지성 이온 운반체 칵테일의 유지를 돕기 위해 내면 소수성을 렌더링하는 전극 silanization합니다. 를 건조&gt; 100 ℃의 오븐에서 금속 랙 및 열 O / N에 미소 전극을 배치합니다. 랙은 2mm 직경의 구멍과 금속판을 통해 방법의 일부를 천공한다. ml의 G 구멍에 전극 (250) 위쪽 팁 배치그들에 아가씨 커. </li><li> 아침에, 오븐을 끄고 절연 장갑을 착용하고있는 동안, 조심스럽게 자리에 전극과 비커와 금속 선반을 제거합니다. 열을 유지하기 위해 오븐 문을 닫습니다. </li><li> 라텍스 또는 니트릴 장갑, 실험실 코트와 눈 보호구를 착용 할 것. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로, 각 전극의 기지에서 실란 화 솔루션 나는 한 방울을 배치 (장소에 비커를 유지, 피펫 액세스를위한 붓는 입술을 사용한다). 실란 화 용액을 핫 플레이트에 의해 기화 전극 내부 silanizes된다. 이 단계에 대한 화학 추출기 흄 후드를 사용합니다. 몇 시간이 남아있는 실란 화 솔루션이 증발 할 수 있도록하는 뜨거운 오븐에서 랙 / 비커 / 전극을 다시 배치합니다. 참고 : 안전을 위해, 다시 오븐을 끄지 마십시오. 이 유해 및 가연성 증기를 포함 할 수 있습니다로는에 전환 할 수 없습니다 나타내는 오븐에 레이블을 배치합니다. </li><li> 냉각 후, 미세 저장 항아리 INSI에 미소 전극을 저장400g의 건조제와 유리 데시 드. 미소 전극 많은 주 동안 이렇게 저장할 수 있습니다. 참고 : 다른 실란 화 방법은 스미스 등에 설명되어 있습니다 (26). </li><li> 측정 될 100mM의 이온을 함유하는 용액을 50 내지 100 μL (약 1cm의 길이) (표 1 및도 1b)로 미세 전극을 백 채운다. 미세 필라멘트에 분젠 버너에서 뽑아 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫의 열을 사용합니다. 막힘을 방지하기 위해 이후 DH 2 O의 피펫을 씻어. 주 : 대안 적으로, 외부 용액 (27)의 이온 농도에 맞게 백필 용액의 이온 농도를 조절한다. </li><li> 기포의 유무를 확인하기 위해 해부 현미경 하에서 미세 전극을 관찰한다. <ol><li> 수직으로 전극을 누른 상태에서 거품이 손톱으로 가볍게 미세 현재 탭 경우 (아래 팁) 및 / 또는 거품을 밀어바늘을 교체 실리콘 튜브 변성 주사기를 사용하여 배압을인가함으로써 팁을이야. </li></ol></li><li> 이온 특정 이온 운반체 칵테일 15-20 NL (30-50 ㎛의 길이)로 미세 전극 팁을 채우기 (표 1 참조). 현미경 슬라이드의 짧은 가장자리에 이온 운반체 칵테일의 작은 방울을 배치합니다. 해부 현미경 하에서 미세 팁을 관찰하고 미세 팁이 약 절반 초 동안 이온 운반체 칵테일에 닿을 때까지 현미경 슬라이드를 향해 이동합니다. 모세관 압력에 의해 미세 전극에 이온 운반체 칵테일을 그립니다. 참고 :이 전자 간섭 (노이즈)에이 취약 할 수 프로브의 전기 저항을 증가시키고 또한 응답 시간을 둔화 이온 운반체 칵테일의 긴 열을 피하십시오. </li><li> 금 1mm 남성 커넥터와 AgCl을은 (Ag +) 선 (그림 1B)와 직선 미세 홀더에 미세 전극을 마운트합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 입체 컴퓨터 제어 전자 micropositioner (그림 1A)에 장착 된 헤드 단계로 미세 전극 홀더를 연결합니다. </li><li> 샘플이 측정 될 때까지 용액을 측정하기에 적합한 미세 전극 팁을 배치 (생리 식염수는, 배양액 등) 미세 전극은 HR 또는 둘, 또는 밤새 안정 될 수 있도록. </li></ol></li><li> 기준 전극의 제조 <ol><li> 기준 전극 (도 1C)는 상기와 동일한 모세관이다. 5cm 길이로 다이아몬드 연필로 모세관을 잘라 분젠 화염에 1-2 초 동안 각 끝 부분에 불이 연마. </li><li> 염화나트륨의 3 M 용액 ~ 200 μL와 이들 전극 채우기 2 % 아가 로스 CH 3 CO 2 K (칼륨 아세테이트) 또는 KCl을. 이온 액에 따라 측정 할 선택 (기준 전극은 측정되는 이온을 함유하지 않아야 표 1 참조). 혼합아가로 오스 거의 전자 레인지에 끓는에 대한 해결책 및 열. 아가 로스를 교반하여 용해 (용액은 맑은 간다). </li><li> 플라스틱 파스퇴르 피펫에 기준 전극을 부착하고 모세 혈관에 뜨거운 용액을 그립니다. </li><li> 사용하기 전에 밀봉 된 관이 3 M 용액에 찬 3 M의 NaCl, CH 3 CO 2 K 또는 KCl을 솔루션 및 저장소에 전극을 삭제합니다. 공기 방울 어떤 기준 전극을 폐기하십시오. </li><li> 직선 미세 전극 홀더 기준 전극 내부 (프리 필드 3 M 용액으로) AgCl을은 (Ag +)과 펠렛과 금 2mm 남성 커넥터 (그림 1C)를 장착하고 수동 마이크로 포지셔너에 전극 홀더를 부착 자기 스탠드에 장착. </li></ol></li></ol> 2. 이온 선택적 자체 참조 바께 미세 교정 <ol><li> 상기 기준 용액과 관심 이온을 함유하는 용액을 교정 준비하는 단계; 표 1 참조 </str&gt; 옹. 솔루션 샘플이 될 것이다 (예를 들어 문화 미디어, 생리 식염수)에 농도를 브래킷. 즉, 하나의 교정 액을 상기 측정 용액에 비해 이온의 낮은 농도를 포함하는, 하나 이상 있어야한다. <ol><li> 예를 들어, K + 1 mm의 포함 식염수를 사용합니다. 이 농도를 브래킷에, 연속 희석 10, 1 및 0.1 mM의 농도로 탈 이온수에서의 KCl 분말을 용해. 이러한 교정 솔루션을 사용합니다. 대안 적으로, 이러한 솔루션들 중 적어도 두 개를 사용한다. </li></ol></li><li> 이온 선택 미세 각 보정 용액에 기준 전극을 담그고 전압 값이 전용 소프트웨어를 사용하여 전압을 기록하기 전에 1 분 내지 3에 대해 안정되도록 (표 1 참조). </li><li> 소프트웨어 TXT 파일 등 데이터 (증폭기 출력)로서 저장, 스프레드 시트 파일로 데이터를 복사한다. 의 대수에 대해 미세 출력 (MV)을 플롯몰 이온 농도 (도 2A). </li><li> 선형 회귀를 적용하고 네른스트의 기울기, 절편 및 R 2 값을 계산합니다. 네른스트 슬로프 가의 이온이 58 ± 11 MV / 10 년 2 가의 이온이 29 ± 11 MV / 10 년이면 미세 전극을 그대로 (양이온, 네른스트 슬로프 음이온이 음수, 양수). 또한, 좋은 미소 전극 강한 선형 상관 관계 (도 2B R 2&gt; 0.9)이 있어야합니다. 참고 : 여기에 사용되는 증폭기의 MV 출력 (MV)이 10 배 증가와 함께 읽고 있습니다. 값은 10의 계수로 나눌 수있다. </li><li> 실제 이온 농도 (그림 2B)로 미세 전극의 원시 MV 출력을 변환하는 선형 회귀 공식을 사용합니다. </li></ol> 이온 선택 미세 전극 기법 3. 검증 <ol><li> 인공 소스를 준비 <ol><li> 인공 소스 모세 혈관 같은 모세 혈관과 같다위. 열 단계 1.1.1에서와 같이 미세 풀러를 사용하여 모세관을 당깁니다. </li><li> 염화나트륨,의 KCl 1 M 용액 200 μL, CaCl2를 H 2 O 2 또는 4의 pH 완충액이 모세관 백필. 선택에 따라, 이온 소스 인공 용액 (표 1 참조)을 측정한다. 참고 : 또는 더 큰 팁 직경 (~ 20 μm의)와 함께 전극을 끌어 동일한 솔루션 팁을 작성하지만, 0.5 % 아가로 오스를 포함 (아가로 오스 솔루션의 대량 흐름을 방지 할 수 있습니다). </li><li> 미세 조작기에 인공광 모​​세관 마운트 시료에서의 이온 플럭스를 측정하기 위해 사용되는 용액에 담궈. 구배의 안정화를 허용하도록 1 시간 30 분 동안 용액에 인공광 남기기. </li></ol></li><li> 이온 선택성 미소 전극의 검증 <ol><li> measu하는데 사용 용액 인공광 모​​세관으로부터 약 일cm 떨어진 이온 선택 미세 전극을 담그고샘플에서의 이온 플럭스 Re 및 이전과 기준 전극으로 회로를 닫는다. 전압 값은 1 내지 2 분 동안 전용 소프트웨어를 사용하여 전압을 기록하기 전에 1 분 내지 3에 대해 안정되도록. 이 값은 (또한 참조, 배경 또는 빈 값으로 참조 문헌에) 버퍼 값에 해당합니다. </li><li> 인공 광원으로부터 약 5 ㎛, 이온 선택 미세 전극을 이동시키고 1 내지 2 분 동안 소프트웨어를 사용하여 전압을 기록하기 전에 전압 값이 1 분 내지 3에 대해 안정되도록. </li><li> 인공 소스 모세관으로부터 멀리 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 및 1280 μm의 이온 선택성에 미세 전극을 배치하여 상기 절차를 반복한다. </li><li> txt 파일 등의 데이터를 추출하고 스프레드 시트 파일로 값을 복사합니다. </li></ol></li><li> 캘리브레이션 값과 동일한 방식으로 MV 값에 대응하는 이온의 농도를 계산한다. 값을 플롯. 아니TE : 이온 플럭스가 존재하는 경우, 미세 전극이 두 위치 (도 3b) 사이의 이온 농도의 차이를 검출한다. 인공 소스 용액보다 측정 종 이상의 이온을 포함하는 경우, 농도가 제대로 (이 경우 이온 플럭스의 방향을 검출하는 이온 선택성 미세 전극의 기능을 검증 멀리보다 소스에 더 가까워 야 유출, 인공 싱크, 매체를 측정보다 낮은 특정 이온 농도, 그것은) 유입되어야한다. <ol><li> 픽 (Fick)의 확산 법칙을 이용하여 이온 플럭스를 계산 : J = C μ C는 용액 중의 이온 농도 (몰 cm -3)이며, μ 이온 이동도를이다 (DC / DX) (몰 cm의 N -1 초 -1) , 및 직류 거리 DX (cm) (도 2c)을 통해 농도 차이이다. 이온 플럭스 데이터는 대개 pmol의 cm -2 (S)로 표시되는-1 또는 nmol의 센티미터 -2 초 -1. 주 :.. 스미스 등 26에 의해 설명 이온 플럭스 계산의 다른 방법이 사용될 수있다. 주요 차이점은 확산 계수의 사용 대신에, 이온의 이동성과 샘플없이 식염수에서 이온 플럭스의 측정으로부터 계산 된 배경 이온 플럭스 (또한 드리프트 또는 보정 팩터 전압)의 감산을 포함한다. </li><li> 소스 (도 2D)로부터의 거리에 대해 각 단계의 이온 플럭스의 평균 플롯. 광원으로부터 멀리 이동하는 이온 플럭스의 다른 크기를 감지 이온 선택 미세 전극의 기능을 검증하는 자속 값의 지수 감소를 관찰한다. </li><li> 큰 신호 대 N으로 올바른 방향 및 크기 측정 값의 유효성을 검증하기 위해 기록되는 것은 각각의 특정 이온에 대해 한 번 인공광 유효성 검사를 수행하여OISE 비율. 참고 : 시료없이 완충액의 이온 플럭스 측정 백그라운드 레벨 또는 잡음을 나타낸다. 일반적으로, 버퍼 측정 변수의 방향을 표시합니다 아주 작은 플럭스로 이어지는 이온 농도의 뚜렷한 변동을 보여줍니다. </li></ol></li></ol> 상공 회의소 측정 4. 준비 주 : 실험 전에 샘플을 측정 할 것을 고려하고 샘플이 얼마나 장착 미세 측정에 고정화된다. <ol><li> Xenopus의 난자는 측정이 800 μm의 나일론 메쉬 (nitex 메쉬)의 1cm 사각형을 잘라 플라스틱 페트리 접시 (그림 1E)로 접착제 laevis의하십시오. </li></ol> 5. 이온 플럭스 측정 <ol><li> 보정 용액과 동일한 방법으로 샘플을 측정을 수행하기 위해 사용되는 버퍼에 존재하는 이온의 농도를 측정한다. X. laevis의 난자는 마크의 수정 된 벨소리 (MMR)이 필요합니다. 디100의 NaCl, 2의 KCl, 2 염화칼슘은, 하나의 MgCl 5 HEPES : issolve의 NaCl, KCl을, 염화칼슘, 및 탈 이온수의 MgCl로는 HEPES (MM)의 최종 농도에 도달한다. NaOH를 사용하여 7.5로 버퍼의 pH를 조정합니다. </li><li> 측정 챔버에 샘플을 놓고 미세 전극 (도 3a)의 근접 위치를 정의하는 micropositioner 사용 (약 10 μm의 거리)에 가까운 샘플 이온 선택 미세 전극을 가지고. </li><li> 전용 소프트웨어를 사용하여 가까운 위치와 거리 (먼) 샘플에서 위치 사이의 미세 전극의 낮은 주파수 (0.3 Hz에서) 여행 (100 ㎛)를 시작합니다. 미세 전극의 이동은 시료의 표면에 수직 인 것으로 확인. 참고 : 미세 전극의 여행이 소프트웨어를 설정할 수 있습니다. 대형 여행은 측정 동안 동안 작은 플럭스 쉽게 검출 가능 판독 구배 샘플링 간격을 길게하고 시간 해상도를 감소 증가시킨다. 참조 <st룽&gt; 예를 들어 그림 3A. </li><li> 소프트웨어를 이용하여 기록을 시작한다. 미세 전극은 각각의 위치에서 일시 정지 MV에 전위를 컴퓨터 상에 기록된다. 신호의 안정화를 허용, 최소 2 분 동안 측정을 얻습니다. 짧은 시간 경과 실험, 전체 시간 경과에 대한 관심의 위치에서 기록 잠재적 인 변화를. </li><li> txt 파일 등의 데이터를 추출하고 스프레드 시트 파일로 값을 복사합니다. </li><li> 캘리브레이션 값과 동일한 방식으로 MV 값에 대응하는 이온의 농도를 계산한다. 값을 플롯. 주 : 이온 플럭스가 존재하는 경우, 미세 전극이 두 위치 (도 3b) 사이의 이온 농도의 차이를 검출한다. </li><li> (단계 3.3.1) 이전처럼 확산 픽의 법칙을 이용하여 이온 플럭스를 계산한다. </li><li> 새로운 샘플을 측정하기 전에 버퍼 측정을 반복하고 모든 새를 위해 플럭스 측정 및 계산의 절차를 반복샘플. </li></ol> 6. 통계 분석 및 데이터 프레 젠 테이션 <ol><li> 및 / 또는 혼합 효과 28 ANCOVA 모델을 이용하여 상기 제어 조건 하에서 이온 플럭스에 시간의 위치의 영향을 독립적으로 테스트한다. 주 : 공분산 분석 (ANCOVA)은 두 범주 연속 대책 독립 변수로서 이용 될 수 있도록하여 일반 ANOVA 및 회귀 혼합 일반 선형 모델이다. 또한, 개인 및 최종 중첩 효과 당 반복 측정에 의한 상관 된 오류의 존재하에 혼합 효과 모델은 모두 고정 랜덤 효과 정확한 추정치를 모델링하는데 사용된다. </li><li> 여러 테스트를 28 페로 니 보정과 그룹 레벨 사이의 학생 T의 -test를 사용하여 쌍으로 비교를 계산합니다. </li><li> 박스 플롯은 위치와 시간에 따라 이온 플럭스 측정을 요약하기 위해 생성한다. 기술 페어 학생 T에서 P 값을 포함(도 3d) 다음과 같이 상기 P 값의 유의 수준을 나타낸다 : * : p &lt;0.05; ** : P &lt;0.01; *** : P &lt;0.001 (29) </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

생체 내에서 세포 외 이온 플럭스의 성공적인 측정을위한 가장 중요한 단계는 : 소음의 감소, 이온 선택성 미소 전극과 기준 전극의 정확한 제조 한 샘플과 두 전극의 위치. 잡음을 최소화하기 위해, 기록 방식이 바람직 또한 접지되어 금속 얹어 (제진) 테이블과 접지 된 패러데이에 있어야한다. 또한, 현미경 섀시는 또한 접지되어야한다. 전기 노이즈의 소스는 광원을 ...

<html> 모든 동물 세포는 외부 환경으로부터 세포질을 분리 지질 이중층 막에 의해 둘러싸여있다. 셀 이온 (1)의 능동 수송에 의해, 내부 전기 막 잠재력, 음을 유지합니다. 막 전위는 셀이 막 (2)에 다양한 분자 장치를 조작하기 위해 활용할 수있는 저장된 에너지 원이다. 뉴런과 다른 흥분성 세포는 큰 막 잠재력을 가지고있다. 나트륨 채널의 신속한 개폐는 막 전위 (탈분극)을 축소하고 신경 세포 (2)의 길이를 따라 이송되는 활동 전위를 생성한다. 이외에도 이러한 급격한 전기 변화에서, 많은 조직과 장기 생성하고 중요한 장기 전기 잠재력을 유지한다. 예를 들어, 피부 및 각막 상피 생성 및 이온의 펌핑 방향 (주로 나트륨 및 염화물) (3)에 의해 트랜스 - 상피 세포 외 전위 및 전류를 유지한다. 내인성 세포 외 전류의 측정은 진동 프로브 4-6과 세포막과 상피 세포층의 전기 파라미터의 측정을 허용 미세 전극 시스템 7-10를 사용하여 막 또는 트랜스 - 상피 전위의 측정을 사용하는 동안 십t &quot;&gt; 이들은 아무 수득 관련된 이온 종의 표시. 선택적 이온 운반체와 미소 전극은 용액에서 특정 이온 농도를 측정 할 수 있습니다. 이온 구배 또는 플럭스는 서로 다른 위치에 둘 이상의 전극을 이용하여 측정 될 수있다. 그러나, 각 프로브의 극한 전압 드리프트가 달라도 측정 부정확 또는 존재하지 않았다 구배에도 검출을 일으키는 것이다. 이 두 점 사이의 낮은 주파수로 이동된다 &quot;자체 참조&quot;모드에서 사용되는 단일 전극이 문제를 해결한다. 이제 이온 플럭스가 비교적 느린 안정된 신호 드리프트의 배경에 대해 알 수있다 (도 3b 참조). </P&gt; 이온 성 측정 시스템은 단일 조직 또는 세포에 가까운 작은 세포 외 이온의 플럭스를 검출하는 이온 선택성 자체 참조 미소 전극을 사용한다. 시스템은 미세 전극의 움직임을 제어하기위한 미세 전극 및 마이크로 스테퍼 모터 드라이버로부터의 신호를 처리하여 증폭기로 구성된다. 회로를 닫을 이온 선택 미세 전극 및 기준 전극은 headstage 프리 앰프 (도 1a)를 통해 증폭기에 접속된다. 컴퓨터 소프트웨어 미세 운동 (주파수, 거리)의 파라미터를 결정하고, 또한 상기 증폭기의 출력을 기록한다. 스테퍼 모터는 입체 micropositioner 통해 미세 이동을 제어한다. 이온 선택 미세 진동 저주파 1 특정 칼슘 플럭스 (11)를 측정하기 위해 1990 년에 개발되었다. 뿐만 아니라 칼슘, 상업적으로 접근 이온 운반체 칵테일 지금 MICR을 할 수 있습니다oelectrodes 나트륨, 염화 칼륨, 수소, 마그네슘, 질산 암모늄, 불화 리튬, 또는 수은 민감. 기본적으로, 자기 - 참조 이온 선택 미세 기술은 전압계에 의해 측정 될 수 전위로 용액에 용해 특정 이온의 활성을 변환한다. 이온 운반체 칵테일 혼합되지 않는 액체 이온 교환 특성 (유기, 친 유성) 단계입니다. 선택적 이온 운반체 (귀속) 특정 이온을 가역적 및 미세 전극 (전해액)에 함유 수용액 및 미세 전극을 침지시킨 수용액 (도 1d) 간의 전송들을 복합체. 이 이온 이동은 전기 화학 평형에 이르게하고 미세 전극과 기준 전극 사이의 전위의 변화는 전압계에 의해 측정된다. 전압은 네른스트 E에 따라 특정 이온 활성의 대수에 비례이온 농도 (도 2A와 B)의 계산을 허용 quation. 현재, 몇몇 시스템들은 유사한 개념 또는 원리를 이용하여 이온 플럭스의 측정을 허용한다. 예를 들어, 및 뉴만 Shabala 14-16 의해 개발 스캐닝 이온 선택 전극 기법 (SIET) (12, 13) 또는 미세 전극 이온 플럭스 추정 (MIFE) 기술이 널리 시판 특정 이온을 결정하기 위해 연구 커뮤니티에서 사용하는 동물, 식물 및 단일 생존 세포 모델에 걸쳐 다양한 세포막 및 조직에서 발생하는 플럭스. 이온 선택 미소 전극은 뇌동맥 쥐 18 꽃가루 튜브 19 스케이트 망막 세포 20 수소 유속, 마우스 뼈 (21), 각종 이온 칼슘 플럭스를 수소 칼륨 및 칼슘 플럭스 식물 뿌리 (17)에 걸쳐, 염화물 플럭스를 측정하기 위해 사용되어왔다 곰팡이 균사 (22)과 R의 플럭스단일 세포 중에 각막 창상 23, 그리고 마지막으로 칼슘 플럭스 12, 24에서 치유. 또한 이온 선택적 자체 참조 미소 전극 (25)에 대한 자세한 내용은 다음 리뷰를 참조하십시오. 다음 문서를 준비하고 단일 세포 수준에서의 이온 선택 자체 참조 미세 전극 기술을 이용 내인성 세포 외 이온 플럭스의 측정을 수행하는 방법을 상세히 설명한다.

<table><tbody><tr><td>IonAmp&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>none</td><td>amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &amp;ldquo;XBL function matters&amp;rdquo; (http://www.xuyue.org/) or from &amp;ldquo;YoungerUSA&amp;rdquo; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>IonAmp32&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>none</td><td>software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &amp;ldquo;XBL function matters&amp;rdquo; (http://www.xuyue.org/) or from &amp;ldquo;YoungerUSA&amp;rdquo; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Headstage pre-amplifier</td><td>&amp;nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>INA116</td><td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &amp;ldquo;XBL function matters&amp;rdquo; (http://www.xuyue.org/) or from &amp;ldquo;YoungerUSA&amp;rdquo; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>MicroStep Driver</td><td>&amp;nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>none</td><td>three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &amp;ldquo;XBL function matters&amp;rdquo; (http://www.xuyue.org/) or from &amp;ldquo;YoungerUSA&amp;rdquo; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Manual micropositioner&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>Model KITE-R</td><td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Magnetic stand&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>Model M10</td><td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Vibration isolation table&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Newport Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Model VW-3036-OPT-023040</td><td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&amp;deg;, slotted faces</td><td>Newport Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Model 360-90</td><td>Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table</td></tr><tr><td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td><td>Newport Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>460PD-X</td><td>none</td></tr><tr><td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td><td>Newport Inc.</td><td>460A-XY</td><td>none</td></tr><tr><td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>TW150-4</td><td>none</td></tr><tr><td>Electrode puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>&amp;nbsp;PC-10</td><td>none</td></tr><tr><td>Metal rack</td><td>Made in-house</td><td>none</td><td>Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel</td></tr><tr><td>Oven</td><td>QL</td><td>Model 10 Lab Oven</td><td>none</td></tr><tr><td>Silanization solution I&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85126</td><td>Hazardous, handle as recommended by provider&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass Petri dish; Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>316060</td><td>none</td></tr><tr><td>Electrode/micropipette storage jar</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>E215</td><td>none</td></tr><tr><td>Glass dessicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-595E</td><td>Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.</td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597722</td><td>none</td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>S97329</td><td>none</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>none</td></tr><tr><td>Straight microelectrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-A15P</td><td>with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire</td></tr><tr><td>Straight microelectrode holder&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3S</td><td>with a AgCl(Ag&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;)pellet inside and a gold 2 mm male connector&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6 cm Petri dish</td><td>VWR</td><td>60872-306</td><td>none</td></tr><tr><td>Nitex mesh</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX750</td><td>none</td></tr><tr><td>Glue; Loctite epoxy</td><td>VWR</td><td>500043-451</td><td>Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing</td></tr><tr><td>Deionized water&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>99053</td><td>none</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>none</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>none</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>none</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>none</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>none</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>none</td></tr><tr><td>Potassium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190</td><td>none</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>none</td></tr></tbody></table>

measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique

동물, 식물 및 단일 세포로부터 세포 외부로부터 세포질을 분리 세포막라는 장벽에 의해 밀폐된다. 이러한 상피 세포층로서 또한 외부 또는 다세포 유기​​체의 다른 구획에서 내부를 분리 장벽을 형성한다. 이러한 장벽의 주요 기능은 세포막 또는 세포 층에 걸쳐 이온의 미분 분포이다. 두 속성이 배포 허용 : 1) 막과 상피 특정 이온에 선택적 투과성을 표시; 2) 이온은 세포막 및 세포 층에 걸쳐 펌프를 통해 운반된다. 이러한 속성은 조직의 생리를 유지하는 중요한 역할을 수리하는 동안, 손상 후 신호를 신호로 작동, 또는 병적 인 상태에서. 이온 선택적 자체 참조 미세 전극은 단일 세포와 조직 수준의 칼슘, 칼륨, 나트륨 등의 이온의 특정 플럭스를 측정 할 수 있습니다. 미세 전극은 이온 운반체 칵테일을 포함특정 이온에 선택적으로 투과. 내부 도금액 관심 이온 농도 세트를 포함한다. 미세 전극의 전위는 이온의 외측 농도에 의해 결정된다. 이온 농도의 변화에​​ 따라, 미세 전극의 전위는 이온 활성의 로그 함수로서 변화시킨다. (인해 이온 플럭스 농도 구배 예) 앞뒤로 이온의 소스 또는 싱크 가까이 이동할 때 미세 전극 전위는 이온 플럭스 / 구배에 비례하는 진폭 변동한다. 증폭기는 미세 신호를 증폭하고 출력은 컴퓨터 상에 기록된다. 이온 플럭스는 그러한 특정 이온 이동성 전극 전위 변동, 미세 전극의 편위 및 다른 파라미터를 이용하여 픽의 확산 법칙에 의해 계산 될 수있다. 본 논문에서는, 우리는 이온 선택적 자체 참조 미세 전극을 사용하여 세포 외 이온 플럭스를 측정하는 방법 상세 설명몇 가지 대표적인 결과를 제시 거라고.

우리는 이전에 칼슘 유입이 하나의 셀 (24) 부상 후 나타나는 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 다른 이온 플럭스는 단일 세포 상처에 발생 여부를 물었다. 우리는 X를 사용 난자, 단일 셀 상처 치유 30-34과 전기 생리 기록 24,35-39에 대한 잘 확립 된 모델을 laevis의. 흥미롭게도, 칼륨 이온은 X. 내부 더 농축하여 laevis의 것은 난자 (약 110 mM)을 (MMR 1...

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Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.9K 조회수.  University of California, Davis. Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

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Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

연구

신경과학

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

나의 기능적 특성<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

생물학

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

램지 분석의 사용은 유체 분비 및 이온 플럭스 요금을 측정하는<em&gt; 초파리</em&gt; Malpighian하는 Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the foundation to develop novel strategies for pest control. Here, a series of methods are described that are routinely utilized to determine the functional roles of neuropeptides and other neuronal factors (i.e., biogenic amines) on the excretory system of the mosquito, Aedes aegypti. The Malpighian tubules (MTs), responsible for primary urine formation, can continue functioning for hours when removed from the mosquito, allowing for fluid secretion measurements following hormone treatments. As such, the Ramsay assay is a useful technique to measure secretion rates from isolated MTs. Ion-selective microelectrodes (ISME) can sequentially be used to measure ion concentrations (i.e., Na+ and K+) in the secreted fluid. This assay allows for the measurement of several MTs at a given time, determining the effects of various hormones and drugs. The Scanning Ion-selective Electrode Technique uses ISME to measure voltage representative of ionic activity in the unstirred layer adjacent to the surface of ion transporting organs to determine transepithelial transport of ions in near real time. This method can be used to understand the role of hormones and other regulators on ion absorption or secretion across epithelia. Hindgut contraction assays are also a useful tool to characterize myoactive neuropeptides, that may enhance or reduce the ability of this organ to remove excess fluid and waste. Collectively, these methods provide insight into how the excretory system is regulated in adult mosquitoes. This is important because functional coordination of the excretory organs is crucial in overcoming challenges such as desiccation stress after eclosion and before finding a suitable vertebrate host to obtain a bloodmeal.

This protocol outlines methodologies behind the Ramsay assay, ion-selective microelectrodes, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) and in vitro contraction assays, applied to study the adult mosquito excretory system, comprised of the Malpighian tubules and hindgut, to collectively measure ion and fluid secretion rates, contractile activity, and transepithelial ion transport.

성인 모기에 있는 배설 시스템의 Neuropeptides 및 그밖 규제기관의 활동을 공부하기

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

Source: Hlozkova K. et al. <a href="https://www.jove.com/t/58426">Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

Source: Hlozkova K. et al. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구학

Leukemia

In vitro techniques & assays

Optogenetic Electrophysiology Recording of Cells with Light-Dependent Ion Channels

Source: Grimm, C., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55497">Whole-cell patch-clamp recordings for electrophysiological determination of ion selectivity in channelrhodopsins.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, embryonic kidney cell cultures expressing light-dependent ion channel proteins fused with a fluorescent reporter demonstrate the effect of light on ion movement. Whole-cell patch clamp is used to monitor the movement of ions.

1. Setup Prior to Recordings

	Prepare the recording solutions with ion concentrations as indicated in Table 1.&#8203;
	
		Prepare 15 mL of 2 M stock ...

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

요약

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