L&#39;imagerie a été effectuée sur un Leica SP5 microscope confocal verticale situé dans le centre de FILM de l&#39;Imperial College de Londres, dirigé par le Dr Martin Spitaler. Le porte-échantillon et le casque a été fait en collaboration avec le département de génie chimique de l&#39;Imperial College de Londres, avec les conseils de Samuel Jones et le Dr Simon Schultz. Nicola Ruivo, Francisco Diaz et personnel de la SCS à l&#39;Imperial College ont contribué pour leur aide et des conseils sur l&#39;élevage de la souris. Mark Scott est financé par le programme au et FILM, Olufolake Akinduro par CRUK et Cristina Lo Celso par CRUK, KKLF, BBSRC et PSFH.

Toutes les procédures impliquant l&#39;utilisation d&#39;animaux sont effectués conformément à la législation locale. Notre travail est approuvé par le Home Office britannique, ainsi que le comité d&#39;examen éthique de l&#39;Imperial College. Les procédures autorisées sont décrites dans la documentation de licence de projet et suivent les lignes directrices qui assurent le bien-être de l&#39;animal en tout temps. Assurez-vous de respecter la législation sur l&#39;expérimentation animale du pays où le travail est effectué. 1. étiquetage et l&#39;injection de HSPCs: <ol><li> Récupération des cellules telles que décrites par Lo Celso 14-15. </li><li> Préparer les cellules à une concentration de 10 6 cellules / ml dans du PBS. REMARQUE: Utilisez un hématimètre ou les informations fournies par le trieur de cellules à compter les cellules; le nombre de cellules à étiqueter et injectée varie en fonction du type de cellule (par exemple la tache 10000 - 20000 CSH, 100,000 - 300 000 CPS); si l&#39;on travaille avec moins de 10 5 cellules, de remettre en suspension dans 100 ul de PBS; il est important d&#39;avoir des cellules dans du PBS sans sérum, comme le sérum inhibe la coloration. </li><li> Ajoutez DiD de la suspension cellulaire à une concentration finale de 5 uM et vortex la suspension immédiatement pour assurer le colorant ne précipite pas la solution et ne pas étiqueter les cellules. </li><li> Incuber pendant 10 min à 37 ° C puis laver par centrifugation à 500 g pendant 5 min, décanter le liquide et remettre en suspension le culot dans un volume approprié pour injection IV (~ 100 - 150 pi) </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS et de recueillir dans une seringue à insuline. REMARQUE: une seringue à insuline est recommandée sur une seringue conventionnelle car il n&#39;a pas l&#39;aiguille espace mort et permet l&#39;administration de la totalité de la suspension cellulaire à la souris donc. </li><li> Injecter des cellules dans une souris mortellement irradiées par injection dans la veine caudale. NOTE: L&#39;irradiation a connu, un impact considérable sur le microenvironnement de la moelle osseuse (deux hématopoïétiques et stromales composants), qui se développe sur timoi. Il est donc très important de maintenir le calendrier cohérent pour l&#39;irradiation, l&#39;injection de cellules (4 à 24 heures de l&#39;irradiation pour une meilleure prise de greffe) et l&#39;imagerie. Voici irradiation est effectuée 6 heures avant l&#39;injection et de l&#39;imagerie est effectuée 20 heures après l&#39;injection. <ol><li> Placez la souris dans une chambre chaude (37 ° C) jusqu&#39;à ce que la veine de la queue semble vasodilated. </li><li> Déplacez la souris dans le dispositif de retenue et faites glisser doucement l&#39;aiguille dans la veine de la queue. </li><li> Injecter les cellules dans la veine - pas de résistance à l&#39;injection devrait être rencontré. </li><li> Laisser la souris O / N afin de permettre aux cellules de migrer vers les espaces de la moelle osseuse. </li></ol></li></ol> 2 Préparation de la souris pour l&#39;imagerie <ol><li> Autoclave une paire de pinces fines et une paire de ciseaux fins ainsi que d&#39;un casque avant de l&#39;utiliser et de stocker dans un environnement stérile. </li><li> Faire un anesthésique aussi frais que possible, (0,38 ml 0,25 ml kétamine + Médétomidine + 4,47 ml d&#39;eau). REMARQUE: otses anesthésiques approuvés, y compris l&#39;isoflurane et d&#39;autres injectable, seront efficaces aussi. Le cocktail décrit doit être administrée par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel, avec des recharges de 30 - 50 pi administrés toutes les 45 min à 1 h. </li><li> Allumez le laser à deux photons si nécessaire puis démarrez le microscope et le logiciel, l&#39;étalonnage de la scène lorsque vous êtes invité. Changer sur les lasers et leur permettre de se réchauffer et se stabiliser tout en préparant la souris pour l&#39;imagerie. </li><li> Anesthésier la souris en utilisant le mélange anesthésique préparée (étape 2.2) pour l&#39;anesthésie choisi par injection intrapéritonéale. Surveiller l&#39;apparition de l&#39;anesthésie profonde avec une pédale réflexe maintenant et à intervalles réguliers tout au long du protocole. REMARQUE: la souris doit être surveillée attentivement tout au long de la procédure et si l&#39;anesthésie semble être la foudre (généralement après 45 - 60 min), puis administrer une dose complémentaire (comme indiqué à la section 2.2). Attendez-vous à une certaine variation entre les souris de différents âges et le sexe. Il est importante pour discuter du protocole d&#39;anesthésie avec votre agent vétérinaire local pour assurer les précautions nécessaires sont prises pour assurer le bien-être de la souris. </li><li> Nettoyer la partie supérieure du cuir chevelu avec 70% d&#39;éthanol sur un mouchoir en papier, garantissant de ne pas obtenir de l&#39;éthanol dans les yeux de souris. </li><li> En utilisant des pinces et ciseaux stériles, retirer délicatement la partie centrale du cuir chevelu pour exposer la zone de la voûte crânienne à imager: faire une petite incision à l&#39;arrière de la tête entre les oreilles en soulevant la peau avec des pinces. Tout en maintenant la peau vers le haut, faites glisser les ciseaux sous la peau et délicatement couper le long de l&#39;extérieur de la zone d&#39;imagerie souhaitée. </li><li> Essuyez l&#39;os exposé avec coton-tige stérile humidifié avec du PBS stérile pour le garder humide. </li><li> Fixer la pièce de tête métallique sur le crâne de la souris prêt pour l&#39;imagerie. <ol><li> Mélanger une quantité suffisante de ciment dentaire dans un bateau peser jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne une pâte et appliquer rapidement à la surface inférieure de la pièce de tête qui se joindre à la sKull. </li><li> Avant la prise du ciment, placez le casque sur le crâne de la souris, en veillant à ne pas mettre du ciment dentaire sur la zone d&#39;imagerie, puis attendre pour fixation. </li><li> Appliquez une petite quantité de Intrasite hydrogel qui maintient le crâne humide. </li></ol></li><li> Fixez le casque à la porte et fixer à l&#39;aide de la vis, en veillant à ce que les rainures s&#39;insèrent dans les encoches de maintien. </li><li> Retirer l&#39;hydrogel du crâne avec des cotons-tiges stériles et propres avec du PBS stérile avant de les transférer sur le microscope. </li><li> Insérez le support dans la platine du microscope, placez le tapis chauffant sous la souris, insérez la sonde du thermomètre rectal et fixez le tout en place sur la scène avec du ruban adhésif. </li><li> Placer une petite goutte de pommade ophtalmique sur les yeux de la souris afin de s&#39;assurer qu&#39;ils ne se dessèchent pas sous anesthésie. REMARQUE: la souris ne doit pas être laissé sans surveillance à tout moment pendant le processus d&#39;imagerie sous anesthésie. </li></ol>in vivo &quot;jove_title&quot;: piles à haute résolution et d&#39;acquisition Time-lapse <ol><li> Focus sur le crâne par les pièces de l&#39;oeil. <ol><li> Remplir la fenêtre de formation d&#39;image avec de l&#39;eau purifiée stérile et en utilisant un objectif à immersion, l&#39;abaisser jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche la gouttelette d&#39;eau. </li><li> Focus sur le sommet du crâne à l&#39;aide des oculaires du microscope, en utilisant une lampe externe comme source de lumière. </li><li> Positionner la zone de formation d&#39;image sur la suture et se déplacer vers le centre de l&#39;arrière de la tête pour trouver la suture coronale en tant que position de départ. </li></ol></li><li> Régler le microscope de manière à permettre l&#39;excitation et la détection efficace des fluorophores pertinentes indiquées dans le tableau d&#39;excitation et d&#39;émission. NOTE: si une confocal Leica SP5 verticale avec une tête de balayage de galvanomètre classique exécutant la plate-forme logicielle LAS-AF est utilisé ici, la procédure peut être facilement reproduit dans d&#39;autres plates-formes microscope / logiciels. L&#39;objectif utilisé ici est le Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA blentilles équivalentes ut d&#39;autres fabricants sont disponibles avec un grossissement adapté et de haute NA <ol><li> Placez le logiciel dans un mode de capturer deux images XY ainsi que d&#39;un Z-stack 3D et régler la vitesse d&#39;imagerie à 400 Hz et une résolution de 512 x 512 pixels. REMARQUE: l&#39;installation et le matériel ici le résultat dans un champ de vision de 620 um et cela peut varier sur d&#39;autres plates-formes. </li><li> Configurer le logiciel de sorte que plusieurs canaux / pistes sont capables d&#39;être capturé, ainsi que veiller à ce que la méthode de collecte est en train de changer les réglages entre les piles si possible ou entre les images à tout le moins. Mettre en place trois réglages indépendants de capture, la coupure de l&#39;éclairage laser à la fin de l&#39;acquisition de chaque pile. REMARQUE: trois canaux seront requis pour cette procédure pour réduire la diaphonie entre les canaux. </li><li> Configurer les paramètres de la première analyse séquentielle pour le signal de l&#39;os SHG à deux photons (840 nm d&#39;excitation; 400-440 nm émission); ouvrir l&#39;obturateur pour le laser MP et assurer MP gain et de décalage sont correctement configuré, la puissance du laser est de 12,5 - 25% de et le laser est activé. Sélectionnez un PMT approprié que le seul détecteur et changer la couleur de blanc. Remarque: les détecteurs NDD avec des filtres appropriés devraient être utilisés pour la détection de l&#39;os lorsqu&#39;il est disponible pour obtenir un signal plus profond brillant. </li><li> Répétez la procédure de configuration du canal utilisé pour le canal de la GFP pour une auto-fluorescence combinée (543 nm d&#39;excitation; 560 - 600 nm émission) et DiD (excitation à 633 nm; 650-720 nm émission) au titre des deuxième paramètres de numérisation, en utilisant deux PMT appropriées. Changez la couleur de canal au vert pour le autofluorescence et rouge pour le DiD. Remarque: l&#39;utilisation vert comme le canal auto-fluorescence permet la détection facile de cellules positives n&#39;ai lorsque les deux canaux sont recouvertes - cellules autofluorescentes apparaissent comme jaune / orange en raison d&#39;être à la fois les chaînes en DiD cellules apparaissent uniquement en rouge car ils n&#39;apparaissent que dans la canal DiD. Le canal auto-fluorescenceest utilisé uniquement pour la comparaison et ne sont pas utilisées dans l&#39;analyse finale, si l&#39;utilisateur le souhaite, il peut être changé en une couleur différente à des fins d&#39;affichage pour éviter toute confusion avec le canal de la GFP. </li><li> Enfin, la configuration la troisième et dernière analyse pour la GFP (excitation à 488 nm; 500-530 nm émission); assurez-vous que l&#39;obturateur est ouvert, si nécessaire, puis régler la puissance de laser de la ligne de laser de 488 nm à environ 15% ou un niveau approprié pour le laser utilisé, sélectionnez un PMT approprié que le seul détecteur active et changer son pseudo-vert. </li><li> Activer un mode d&#39;imagerie &#39;Live&#39; pour commencer un aperçu de numérisation de la chaîne sélectionnée et régler le détecteur de gain et de décalage pour une exposition optimale. Répétez cette opération pour chaque balayage dans la fenêtre séquentiel. </li><li> Enregistrer les paramètres de ces analyses multi-canaux pour une réutilisation facile. REMARQUE: cela permet à l&#39;utilisateur de recharger les paramètres lors de sessions ultérieures. </li></ol></li><li> Activer multi-capture de position, dénommé «Marquer unTrouver ème &#39;dans le logiciel démontré, et de réinitialiser les points de coordonnées. </li><li> Balayer la zone d&#39;imagerie osseuse, à partir de l&#39;intersection entre la suture coronale et centrale, analyser la profondeur de la zone de la moelle osseuse en utilisant à la fois auto-fluorescence (pseudo de couleur verte) et DiD (pseudo-couleur rouge) avec une vue composite. REMARQUE: les cellules autofluorescentes seront présents dans les deux canaux et une couleur orange / jaune dans l&#39;image composite alors que n&#39;avons cellules marquées apparaissent en rouge-seules les cellules de l&#39;image composite. </li><li> Quand une cellule est détectée, marquer cela comme une nouvelle position de coordonnées (x, y et z) dans le «Mark et Trouver &#39;outil en cliquant sur la fenêtre&quot; Ajouter une nouvelle icône de votre position sur le côté gauche de la &quot;Mark et Trouver&quot; . </li><li> Lorsque le champ de vision actuel a été examiné, déplacer la scène de la distance d&#39;un champ de vision soit à gauche / droite / haut / bas. Répétez ce processus pour chaque champ de vue, un travail progressif autour de l&#39;ensemble de la zone de la fenêtre d&#39;imagerie à la gauche de ee suture centrale, se déplaçant vers le nez de la souris. Une fois la suture bifurcation centrale est en vue, se déplacer sur le côté droit de la suture et répétez la procédure balayer le côté gauche dans le sens inverse (c&#39;est à dire, vers la suture coronale). Marquer les coordonnées de toutes les nouvelles cellules d&#39;intérêt en utilisant le «Mark et Trouver &#39;outil. </li><li> Une fois la numérisation de la fenêtre d&#39;imagerie est terminée, utilisez le «Mark et Trouver &#39;outil pour étudier les points (sélectionner le point désiré et examiner chaque point individuellement). Réglez le haut et le bas d&#39;un Z-stack autour de chaque cellule pour chaque position, (beaucoup de plates-formes logicielles vous permettent d&#39;effectuer des z-piles indépendants pour chaque poste, ce qui réduit la capture espace vide). Pour chaque point, l&#39;accent de haut en bas et mettre en positions supérieure et inférieure Z pour 3D z-stack capture et mettre à jour le point individu dans le «Mark et Trouver. Réglez l&#39;intervalle Z-Stack à 5 um et moyenne pour chaque canal de balayage séquentiel à une qualité appropriée: o Ligner moyenne de trame. REMARQUE: L&#39;augmentation du nombre de scans en moyenne augmente la longueur de temps d&#39;acquisition. </li><li> Acquérir une pile de référence de haute qualité pour chaque point d&#39;intérêt en lançant la procédure de numérisation ensemble (souvent dénommé «Démarrer» plutôt que «Capture»). NOTE: cette analyse peut servir de référence pour l&#39;avenir de l&#39;imagerie à grande vitesse. </li><li> Une fois que vous avez terminé avec le balayage de haute qualité, d&#39;activer un réglage time-lapse pour la capture. </li><li> Dans les paramètres time-lapse, définir l&#39;intervalle de temps de 5 min et le temps total de course à la longueur désirée (par exemple, 5 h). «Appliquer» ces paramètres pour l&#39;analyse globale. REMARQUE: afin de réduire ce temps de cycle pour permettre un intervalle de temps écoulé 5 min, on devra peut-être réduire le nombre de balayages utilisés pour calculer la moyenne, limiter la résolution de 512 x 512 pixels, convertir le balayage à bidirectionnel (avec correction de phase nécessaire pour aligner les deux sens de balayage), et / ou d&#39;augmenter la vitesse de balayage de 600 Hz ou plus (plus de 600Hz provoquera un zoom de la zone de formation d&#39;image pour la plate-forme logicielle montré). Il est également important de noter que si un mode d&#39;imagerie séquentielle a été utilisé pour acquérir une image pile de haute qualité d&#39;abord, l&#39;acquisition simultanée est utilisée pour augmenter la vitesse lors de l&#39;imagerie time-lapse - il peut en résulter une légère diaphonie entre les canaux qui place supplémentaire importance sur la capture initiale des piles de référence séparées avec précision. </li><li> Commencer l&#39;imagerie (comme avant en cliquant sur le bouton &quot;Démarrer&quot; dans le logiciel démontré). REMARQUE: assurez-vous de maintenir le niveau approprié de l&#39;anesthésie en administrant en outre, des doses plus faibles en cas de besoin, en faisant attention de ne pas surdoser la souris, régulièrement recharger l&#39;eau pour assurer l&#39;objectif ne se dessèche pas et surveiller les signes vitaux et de la température de chauffage pad tout au long. </li><li> Lorsque vous avez terminé, soulever la lentille du support, puis retirez le support de la platine du microscope, s&#39;assurer que les fils de la sonde dans le rectum hmanger tapis ne sont pas endommagés. </li><li> Dévissez le casque du titulaire de la scène et retirez soigneusement la souris. Abattre la souris par dislocation cervicale et retirer la tête-pièce de métal en l&#39;enclenchant hors du crâne. Enregistrer des données sur le disque et transférer au serveur pour une analyse ultérieure. REMARQUE: La pièce de tête est parfaitement nettoyée par immersion dans de l&#39;acétone pendant quelques heures et, enfin, le ciment de frottement résiduel. </li></ol>

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There is nothing to disclose.

Qu&#39;est-ce qui a été accompli? Le protocole utilise l&#39;imagerie multidimensionnelle time-lapse de suivre la migration des FACS purifié, ex vivo étiquetés, HSPCs transplantées chez la souris crânienne moelle osseuse. Identification des cellules transplantées simples ont été réalisés et ceux-ci ont été suivis pendant des périodes prolongées (h) avec une grande précision. La respiration des artefacts de mouvement induits ont été minimisés et les cellules ont été reimaged plusieurs reprises sur une période prolongée plats. Quelles sont les orientations futures? Développement de la technique pourrait progresser vers des expériences de récupération pour permettre l&#39;imagerie sur plusieurs jours, au cours d&#39;une semaine ou plus et l&#39;utilisation d&#39;anesthésiques gazeux tels que l&#39;isoflurane pour raccourcir et simplifier le processus de récupération de la souris (Remarque: des expériences de récupération doit impérativement conditions de chirurgie stériles et l&#39;administration d&#39;analgésiques approprié). Developpement d&#39;une plus grande palette de couleurs de colorants in vivo ainsi que l&#39;étiquetage génétique efficace des cellules hématopoïétiques facilitera également les expériences multi-étiquetage, permettront de mieux comprendre les interactions cellule-cellule au sein de la moelle osseuse et autoriser des expériences plus complexes à l&#39;avenir. En outre, l&#39;étiquetage simultanée de plusieurs structures de la moelle osseuse et les composants du stroma fournira un tableau plus complet des événements qui se déroulent dans des niches CSPS. la stabilité de l&#39;image des films en accéléré pourrait être améliorée pré-acquisition en stabilisant le microscope autre ainsi que de minimiser les gradients de température dans l&#39;échantillon et postacquisition en utilisant des algorithmes d&#39;enregistrement de l&#39;image. Limitations: La technique décrite présente certaines limitations. La survie des souris après l&#39;administration d&#39;anesthésiques injectables est imprévisible et il est très facile de complications de l&#39;expérience en fonction de la réponse individuelle de l&#39;anesthésique. Généralement, plus une session d&#39;imagerie, le plus difficile est pour la souris pour récupérer de l&#39;anesthésie et il est donc important de planifier soigneusement si la souris doit être récupéré, ce qui limite la durée idéale de la déchéance imagerie en temps. L&#39;utilisation d&#39;anesthésiques injectables limite la durée de chaque séance d&#39;imagerie peut durer. Alors qu&#39;il est possible de prolonger l&#39;anesthésie par réadministrer une dose plus faible d&#39;anesthésique, il est difficile effectuer cette précision et un surdosage de la souris est une des causes les plus fréquentes de la fin prématurée de l&#39;imagerie in vivo. anesthésie au gaz est moins toxique et permet de plus d&#39;une session de formation d&#39;image initiale, mais une récupération rapide de la souris après&gt; 2 heures de temps d&#39;administration de l&#39;isoflurane est rarement couronnées de succès. Une autre limitation de la technique est la résolution limitée des images qui peuvent être obtenus au cours de plusieurs points imagerie time-lapse, en raison de la nécessité d&#39;acquérir rapidement des images. Ceci, couplé avec la dérive ou champ focal saute (disqueussed ci-dessus), peut faire le suivi des cellules difficile. Comparaison avec d&#39;autres méthodes: HSPCs sont habituellement marqués avec le colorant lipophile DiD, mais DIR et DiI colorants sont des alternatives équivalentes et d&#39;autres colorants cellulaires peuvent être utilisés aussi longtemps que suffisamment de lumière, tel que révisé en [16]. Même si avec DID a été démontré marquage ex vivo de cellules de ne pas affecter le fonctionnement à long terme de cellules souches hématopoïétiques, il a la limitation qui n&#39;a (ou tout autre colorant chimique) est dilué sur la division cellulaire. Etant donné que les CSH se multiplient pendant les premiers jours suivant la transplantation, le rapport signal sur bruit de ces cellules se détériore rapidement. Marquage endogène de cellules au moyen d&#39;une manipulation génétique et l&#39;expression de protéines fluorescentes est une méthode alternative viable, tant que les protéines fluorescentes sont exprimés à des niveaux suffisamment élevés pour produire le signal détectable à travers l&#39;os du crâne. Il existe un certain nombre d&#39;alternatives techniques disponibles pour effectuer l&#39;imagerie de HSPCs dans l&#39;espace de la moelle osseuse, chacun avec leurs propres avantages et les limites. L&#39;insertion de dispositifs d&#39;imagerie à base de fibres optiques autorisé pour l&#39;imagerie de la reconstitution de la moelle osseuse dans les os longs [8], tandis que l&#39;imagerie confocale après une exposition chirurgicale du tibia et l&#39;amincissement de l&#39;émail de l&#39;os avec un foret chirurgical [12] a produit des images détaillées de HSPCs demeurant à les zones périphériques des os longs. Cependant, ces méthodes sont beaucoup plus invasive que celle décrite ici et ne permettent donc pas de répéter les séances d&#39;imagerie portant sur la même zone de la moelle osseuse dans la même souris. En outre, il est possible que ces techniques peuvent affecter les cellules observées donné la réponse inévitable à d&#39;importants dégâts dans les tissus environnants. HSPCs ont été imagées pour de courtes périodes de temps par des lamelles placées sur excisées, fractures du fémur [11], mais l&#39;impact de cette préparation dure du tissu sur HSPCs n&#39;est pas CLEAr et de la technique a été utilisée uniquement pour obtenir simples observations ponctuelles de temps. Os fixes ont été coupés en sections de série, taché, et les images obtenues reconstruit dans un modèle 3D, offrant une excellente résolution en 3D, surtout quand moulages vasculaires sont utilisés [17], et plus récemment à balayage laser cytométrie (CTAS) a été utilisée pour obtenir quantitative mesures sur HSPCs in situ, mis en évidence par une coloration immunologique [18], mais sont incapables de fournir toute information temporelle sur le comportement des cellules. Les techniques décrites dans cette nouvelle technique fournissent une combinaison d&#39;une bonne résolution en 3D, l&#39;échantillonnage temporel suffisant pour le suivi des cellules en 4D et ils sont relativement non-invasive, par conséquent, offre une approche idéale pour réaliser un suivi à long terme de HSPCs interagir avec la moelle osseuse microenvironnement.

Malgré niches de cellules souches ayant été reconnus depuis des décennies 3 et bien caractérisés dans de nombreux tissus tels que le bulbe olfactif, la fibre musculaire, follicule pileux renflement ou CNS zone sous-ventriculaire 4-7, les interactions entre les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et microenvironnement de la moelle osseuse ( BM) sont encore mal comprise en raison de la difficulté d&#39;observer directement les cellules individuelles à travers l&#39;os ainsi que la nature extrêmement fluide du tissu lui-même. Il a été démontré, à travers un certain nombre d&#39;études fonctionnelles sur la base de l&#39;ablation ou la surexpression de gènes spécifiques que ce soit dans les CSH ou les cellules stromales de la micro lui-même, un réseau complexe de différents types de cellules et des signaux de régulation est responsable de la régulation de l&#39;équilibre délicat entre quiescence , la prolifération, l&#39;expansion et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques 1-2. La diaphonie entre les CSH et leurs niches peut être compris en profondeur que par l&#39;observation directe. C&#39;est achievable grâce à l&#39;élaboration de protocoles d&#39;imagerie de pointe, alliant la technologie disponible non seulement en termes de microscopie, mais aussi des solutions de support d&#39;échantillons et de logiciel d&#39;acquisition. La résolution de la cellule à l&#39;unité d&#39;imagerie en temps réel des cellules transplantées souches hématopoïétiques et progénitrices (hspC) dans le compartiment BM des calvaria de souris os a montré que HSPCs de greffant localiser à proximité des vaisseaux SDF-1 et VCAM-1-positives 8-9 et que les cellules plus immatures se trouvent à l&#39;intérieur de 15 - 20 microns à partir de cellules GFP-positives ostéoblastiques (lignée de souris transgénique Col2.3-GFP, dans laquelle le collagène 1α promoteur ostéoblastique restriction dirige l&#39;expression de la GFP), tandis que leur progéniture sont plus distale 10. Des observations similaires ont été obtenus à partir d&#39;os de fémur disséqués et fracturées 11 et à partir d&#39;os tibeal amincies 12. Imagerie de la moelle osseuse crânienne reste l&#39;approche la moins invasive pour obtenir une visualisation directe des HSPCs dans emicroenvironnement natif leu. Avec toute l&#39;imagerie de l&#39;échantillon en direct il ya un besoin inhérent à maintenir l&#39;échantillon aussi immobile que possible pour éviter les artefacts inutiles en raison de mouvement de l&#39;échantillon. La respiration provoque des mouvements oscillatoires de la tête de la souris, qui doivent être évités lors de l&#39;imagerie crânienne moelle osseuse. Titulaires stéréotaxiques classiques, utilisés par exemple pour l&#39;imagerie cérébrale et l&#39;électrophysiologie, ne sont pas adaptés pour l&#39;imagerie de la calotte crânienne, car ils empêchent les os frontaux. À partir d&#39;un support de la souris utilisé pour minimiser la détresse durant imagerie et d&#39;électrophysiologie études vivantes 13, un support 2 de composant a été développé, avec un petit morceau fixé à la tête de la souris pour créer une fenêtre d&#39;imagerie connecté à un grand bras assurant le maintien stable avec un plaque de base lourde qui assure fermement dans la platine du microscope. Sécurisation de la pièce sur le crâne de la souris de la tête permet une respiration libre tout en immobilisant la tête en place et éliminer de manière adéquate movements en raison de la respiration. A &#39;de verrouillage et de clé «mécanisme reliant la pièce de tête sur le corps de support permet à la taille de la fenêtre à être réduite au minimum ainsi que la plus grande précision de positionnement, ce qui simplifie donc l&#39;intervention chirurgicale, et l&#39;ajustement de la plaque de base dans l&#39;étape permet un alignement précis sur le microscope. Pour suivre avec précision les cellules mobiles, un protocole laps de temps multi-point a été conçu pour permettre le suivi des cellules au fil du temps avec des intervalles de 5 min entre les points de temps. CSH ici, avez marqués sont injectés dans col2.3GFP osteoblasitc journaliste souris 10,14 et imagés environ 20 heures plus tard. Le titulaire de la souris qui a été conçu et les paramètres d&#39;imagerie nécessaires à l&#39;exécution rapide multi-point imagerie time-lapse de la même région sur une période de plusieurs heures sont décrites en détail.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

Grâce à un équilibre délicat entre la quiescence et la prolifération, auto-renouvellement et de la production de la descendance différenciée, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de maintenir le chiffre d&#39;affaires de toutes les lignées de cellules sanguines matures. La coordination des signaux complexes qui entraînent des destins HSC spécifiques repose sur l&#39;interaction entre les CSH et le microenvironnement complexe de la moelle osseuse, qui est encore mal comprise [1-2]. Nous décrivons par la combinaison d&#39;un porte-échantillon nouvellement mis au point pour le positionnement des animaux stable avec confocal à plusieurs étapes et à deux photons dans des techniques d&#39;imagerie in vivo, il est possible d&#39;obtenir des empilements de 3D ​​à haute résolution contenant des HSPCs et leurs créneaux environnantes et de les suivre dans le temps par multi-point imagerie time-lapse. Imagerie haute définition permet la détection ex vivo de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques marqués (HSPCs) résidant dans la moelle osseuse. En outre, plusieurs points time-lapse imagerie 3D, obtained avec les paramètres d&#39;acquisition plus rapides, fournit des informations précises sur le mouvement CSPS et les interactions réciproques entre HSPCs et les cellules du stroma. Suivi de HSPCs par rapport à la GFP de cellules ostéoblastiques positif est représenté comme un exemple d&#39;application de cette méthode. Cette technique peut être utilisée pour suivre toute hématopoïétiques ou cellules stromales étiquetés de manière appropriée des intérêts dans l&#39;espace de la moelle osseuse de la calotte crânienne de la souris.

Le sur mesure, porte-souris de haute précision comprenant une fenêtre d&#39;imagerie crânienne permet imagerie prolongée de FACS, HSPCs purifiés marqués injectées dans des souris receveuses irradiées de façon létale (Figure 1A). Typiquement, après l&#39;injection comprise entre 15 à 20.000 cellules marquées, de 8 à 15 cellules sont généralement reconnaissable à l&#39;intérieur de la zone d&#39;imagerie de la moelle osseuse du crâne le lendemain. Ici, il est montré comment acquérir simples piles 3D de résolution de cellule de CSPS contenant les zones de la moelle osseuse d&#39;environ 90 à 120 um d&#39;épaisseur (figure 1B), suivie par 4D films time-lapse des HSPCs identifiés (figure 1C et cinéma). On obtient des résultats sous-optimaux si le ciment dentaire n&#39;est pas optimale préparé, par exemple, l&#39;eau peut couler à partir de zones non scellées, et même si elle peut être rechargée à partir de la partie supérieure de la porte, d&#39;une période de temps dans laquelle la lentille n&#39;est pas trempée dans l&#39;eau conduit au noir f<html> rames. Certains dérive des images est inévitable en raison de la dilatation thermique des matériaux du support de la souris, mais il peut être accentué par l&#39;adhérence du ciment sous-optimale, ce qui conduit à un décollement progressif de la souris, et par perturbation de la formation d&#39;image mis en place, ce qui conduit à des changements soudains de la mise au point lors de l&#39;imagerie time-lapse. Drift cours multi-point imagerie time-lapse peut aussi être causée par des inexactitudes dans les mouvements de la scène lors d&#39;une nouvelle positions précédemment imagées. Drift et bégaiement artefacts dans les films en accéléré peuvent être corrigées par l&#39;utilisation d&#39;algorithmes d&#39;enregistrement de l&#39;image. Tableau 1 excitation et les paramètres d&#39;émission. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> Couleur Canal </td><td style="width:213px;"> Excitation </td><td style="width:208px;"> Émission </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 nm </td><td style="width:208px;"> 500 à 530 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> Autofluorescence </td><td style="width:213px;"> 543 nm </td><td style="width:208px;"> 560 à 610 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> DiD </td><td style="width:213px;"> 633 nm </td><td style="width:208px;"> 640 à 700 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 nm (MP) </td><td style="width:208px;"> 400 à 450 nm </td></tr></tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> Figure 1: L&#39;imagerie 4D in vivo de HSPCs dans la calotte crânienne de la souris. Cellules des exemples de résultats obtenus (B) tranches 2D à partir d&#39;une pile 3D (profondeur totale est de 114 um), contenant le signal de collagène osseux (blanc), avez marqués (rouge) - (A) Schéma de l&#39;expérience (C B).. , cel autofluorescentels (jaunes) et les ostéoblastes (en vert). Les barres d&#39;échelle: 100 um tranches (C) 2D à partir d&#39;un film de temps de déchéance 4D montrant un État n&#39;ont marqué (rouge) de la migration dans la proximité des ostéoblastes (en vert).. La ligne pointillée met en évidence le déplacement de la cellule. Barres d&#39;échelle: 50 um (B) et 100 um (c). REMARQUE:. Le film obtenu à partir de l&#39;acquisition temps-lapse en (C) est montré pendant l&#39;article vidéo <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

La nature des interactions entre les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) et les niches de la moelle osseuse est mal comprise. Mesure des modifications de matériel et un protocole d&#39;acquisition en plusieurs étapes permettent l&#39;utilisation de deux photons et la microscopie confocale à l&#39;image ex vivo des HSPCs marqués hébergés dans les zones de la moelle osseuse, les interactions de suivi et mouvement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

13.7K vues.  Imperial College London.  La nature des interactions entre les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) et les niches de la moelle osseuse est mal comprise. Mesure des modifications de matériel et un protocole d'acquisition en plusieurs étapes permettent l'utilisation de deux photons et la microscopie confocale à l'image ex vivo des HSPCs marqués hébergés dans les zones de la moelle osseuse, les interactions de suivi et mouvement. 

Vidéo: In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Recherche

Biologie

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Améliorer la précision de l'évaluation cytométrique du débit du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre grâce à l'inhibition des pompes d'Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...