1. La croissance du lin dans des conditions d&#39;induction. <ol><li> 5 &quot;pots sont remplis de terre et raffermie. </li><li> Trois graines par pot sont plantés ¼ de pouce de profondeur et le sol raffermi au cours des graines. </li><li> Les pots sont ensuite arrosées avec 100ml de solutions appropriées en nutriments <ol><li> Le non-induisant de contrôle (C) des conditions d&#39;utilisation une force 1 / 10 ème Miracle-Gro chaque semaine. La condition élevée en éléments nutritifs (NPK traitement) avaient Miracle pleine force appliquée Cultivez hebdomadaire. Faible en nutriments - les plantes que l&#39;eau du robinet avait appliqué tout au long de leur croissance. (Durrant 1971, Cullis, 1980). </li></ol></li><li> Les plantes sont cultivées sous lumière naturelle durant l&#39;été. Pendant l&#39;hiver, ils sont cultivés sous les lumières de sodium avec un 16 / 8 heures cycle lumière / obscurité. </li><li> A intervalles hebdomadaires feuilles et les méristèmes sont prélevés. </li><li> Le matériel végétal est rapide congelés dans l&#39;azote liquide. </li></ol> Résultats Les trois génotypes différents croître à des taux relatifs en fonction des conditions (figure 1). Par conséquent, dans des conditions de contrôle de la ligne Pl pousse mieux avec L plus vigoureux que S (figure 1a). Sous nutriments faible (eau), S pousse mieux que ce soit L ou Pl (figure 1b). Sous élevée de nutriments (NPK) L pousse mieux que Pl qui ne pousse que légèrement mieux que S (figure 1c). Une comparaison entre chacune des lignes cultivées sous les trois traitements différents est montré dans la figure 1 D - F. Pl. pousse mieux dans des conditions de contrôle (figure 1d), la meilleure L sous nutriments élevé (figure 1e) et S de la même sous les deux nutriments élevés et des conditions de contrôle (Figure 1f). Ces données montrent que les trois lignes peuvent être différenciés en fonction de leur croissance dans les trois environnements. Il est à noter que les Pl. pousse mieux dans les conditions de contrôle tandis que L pousse mieux dans les conditions NPK (sous lequel elle a été induite). S grandit peu près le même dans tous les trois conditions, qui est, il n&#39;est pas en mesure de profiter de l&#39;amélioration des conditions de nutriments, mais est mieux en mesure de croître sous conditions de très faible en éléments nutritifs. Les paramètres de croissance qui sont pertinents pour la différenciation des plantes comprennent la hauteur de la plante (et associés à cette longueur internodale l&#39;, qui est la distance entre chaque feuille), la taille des feuilles et le degré de ramification. Pour Pl. dans des conditions de contrôle de l&#39;usine est grand avec des branches et les feuilles sont vertes grande et sombre. Sous nutriments peu la plante est très court, la distance entre chaque feuille est également très court et les feuilles sont vertes petit et léger. Les feuilles à l&#39;extrémité sont vert plus foncé que les plus bas de la tige. Sous haute nutriments de la plante ressemble beaucoup à celle des conditions de contrôle, sauf que les deux la tige principale et les pousses latérales sont plus courtes que dans les plantes témoins. Pour la grande genotroph les plantes sont très similaires à ceux de Pl, sauf que la croissance la plus vigoureuse en moins de nutriments élevés. Encore une fois sous les nutriments peu la plante est très court et a feuilles vert clair. Le genotroph S croît pareillement dans les trois environnements bien que les feuilles sont vert plus clair dans les nutriments faible. Cependant, dans les conditions pauvre en nutriments du genotroph S est beaucoup plus vigoureuse que ce soit de la PL ou des lignes L. 2. ARN et extractions d&#39;ADN à partir de méristèmes de lin et les feuilles sont faites séparément. La Roche ARN total de préparation kit a été utilisé pour les extractions d&#39;ARN et l&#39;ADN de Qiagen DNeasy usine de préparation kit a été utilisé pour l&#39;extraction d&#39;ADN. Extraction des ARN <ol><li> 3 méristèmes plus quelques feuilles environnantes sont déplacés de cryovial stockage en tube Eppendorf et placées dans l&#39;azote liquide avant d&#39;être prêt à broyer. </li><li> Sable stérile est ajoutée au tube et le tissu est broyé en utilisant un micropestle jusqu&#39;en fin. </li><li> 400 lyse ul / tampon de liaison de Roche ARN total Prep Kit est ajoutée et le tissu est broyé encore jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y touffes sont visibles. </li><li> L&#39;échantillon est vortexé pendant 15 sec à l&#39;aide de lyse puis centrifugée pendant 1 min à 13000 rpm pour recueillir du sable et des débris. </li><li> Le surnageant est ajouté à tourner la colonne et le reste des instructions ARN Prep Kit sont suivies comme indiqué. </li></ol> DNAse traitement <ol><li> 1 / 10 volume d&#39;échantillon d&#39;ARN de DNAse tampon 10X est ajouté. </li><li> 30 unités de DNAse est ajouté et la réaction est incubée à 37 ° C pendant 30 min et 70 ° C pendant 5 min. </li></ol> Reverse Transcription <ol><li> Applied Biosystems ARN pour kit d&#39;ADNc est utilisé selon les directives, la réaction incubées à 37 ° C pendant 1 heure et 95 ° C pendant 5 minutes. </li></ol> L&#39;ADNc est ensuite utilisée dans la PCR ou pour qPCR qPCR qPCR été réalisée en utilisant une étape ABI Un système. Tous les essais ont été réalisés en triple sur chaque course. Le gène de l&#39;actine a été utilisée comme un contrôle du nombre de copies quele gène de mieux ménager disponibles. <ol><li> La paire d&#39;amorces appropriée a été ajouté à chaque tube dans 1 microlitre. </li><li> L&#39;ADNc a été dilué à la concentration appropriée et 9μl ajouté à chaque tube </li><li> 10 ul de l&#39;Alimentation 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) et a été ajouté à chaque tube </li><li> Le programme d&#39;amplification du programme a été: <ul><li> 10 minutes à 95 ° C </li><li> 40 cycles de 15sec à 95 ° C, 1 min à 60 ° C </li></ul> Étape de dénaturation thermique afin de vérifier la spécificité d&#39;amplification </li><li> Les niveaux d&#39;expression relative ont été déterminées par la valeur de 2 (CTunknown - CTactin). </li></ol> Préparation de l&#39;ADN <ol><li> Tampon AP1 de Qiagen DNeasy DNA Plant Prep Kit est ajouté à 6 feuilles avec du sable stérile dans un tube de centrifugeuse. Le tissu est broyé avec micropestle jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y touffes sont visibles. </li><li> Les instructions du kit sont suivies comme indiqué. </li></ol> Résultats L&#39;amplification par PCR de l&#39;ADN isolé à partir de feuilles à différentes positions le long de la tige montre que l&#39;apparition de LIS-1 survient alors que les plantes poussent dans des conditions induisant (4). Les résultats qPCR montrent que la présence de LIS-1 (ou d&#39;autres modifications génomiques associées à l&#39;induction) affecte l&#39;expression des gènes dans le voisinage immédiat de la LIS-1 (figure 2). Les six gènes montre la figure 2 sont tous exprimés différentiellement dans Pl et S avec quatre ayant une expression plus élevée en PL (sans LIS-1) et deux ayant une expression plus élevée dans S (qui ne sont LIS-1). Panel 1 et 2 sont les deux gènes proches du point d&#39;insertion de la LIS-1. L&#39;expression de ces gènes dans le s genotroph grande (qui a connu des changements induits, mais n&#39;a pas LIS-1) et l&#39;expression sous différentes conditions de croissance seront nécessaires pour déterminer une relation causale entre le LIS-1 et les changements d&#39;expression. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Pl, L et S grandi sous trois régimes différents nutriments. Panneaux a - contrôle, b - nutriments bas et c - NPK. d - Pl., E - S, f - L. Panneaux d - f de gauche à droite: les nutriments bas, de contrôle et NPK. D - Pl, e - L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Figure 2 pouce" /> D&#39;expression génique Figure 2. Autour du point d&#39;insertion de la LIS-1. Gene 1 (inhibiteur de croissance) est immédiatement 5 &#39;du gène LIS1 et 2 (Kip liés cycline-dépendante Identifiant inhibiteur de la kinase 3 &quot;de LIS-1. Les autres gènes sont tous le long de la même échafaud (~ 500ko) construit à partir du séquence complète du génome du lin. S&#39;il vous plaît <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">cliquez ici pour voir une figure plus grande</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Amplifications par PCR d&#39;ADN extrait de feuilles de plantes individuelles de Stormont Cirrus cultivées sous des conditions de faible en éléments nutritifs. Les produits de PCR ont été séparés sur un agarose à 2%-TBE gel. Le site uninserted est montré dans un Panel, les deux extrémités du site insérés sont indiqués dans les panneaux B et C. Des échantillons de feuilles de 1 à 6 ont été isolés à des intervalles hebdomadaires avec l&#39;échantillon 1 étant la plus ancienne après le semis.

<ol>
	<li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum.">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax.">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li><li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmentally+induced+adaptive+(?)+insertion+event+in+flax.">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li></ol>

Le lin semble avoir un génome fondamentalement instable. Un certain nombre de variétés commerciales de fibre de lin rapidement devenu non-uniforme lorsqu&#39;il est cultivé pendant quelques générations. Les mêmes observations ne semblent pas vrai pour les variétés de lin huile. Par conséquent, il semble y avoir une association entre la sélection pour la qualité des fibres et de l&#39;instabilité du génome. L&#39;environnement induit des changements héréditaires dans le lin ont été initialement identifiés par l&#39;enquête sur les observations agronomiques de la croissance de la récolte de la fibre. Ces observations reproductibles des variations spécifiques phénotypiques et génomiques soulève la question de savoir comment le stress environnemental peut influencer la suite de réarrangements génomiques qui peuvent survenir. L&#39;apparition répétée de la LIS-1 en réponse à des environnements particuliers est conforme à cette mutation étant directement ou indirectement sélectionnée. La croissance des lignes induite par divers traitements indique également une amélioration des performances dans les conditions induisant pertinents. Les changements dans l&#39;expression aussi associé à la présence de SIL-1 indique à nouveau que cette insertion affecter les performances des plantes. La vidéo de présentation offre un forum pour l&#39;observation des changements phénotypiques des plantes d&#39;une manière impossible à transmettre à travers des documents imprimés traditionnels.

<ul><li> Les graines de lin de la variété initiale Stormont Cirrus notée Pl et l&#39;genotrophs L et S. </li><li> 5 «pots </li><li> terreau </li><li> Miracle-Gro </li><li> à effet de serre </li><li> Haute lampes sodium haute pression </li><li> L&#39;azote liquide </li><li> Mortier et pilon </li><li> Micropestles et microtubes de </li><li> Thermocycleur </li><li> Équipements électrophorèse sur gel d&#39;agarose </li><li> L&#39;imagerie numérique configuration </li><li> StepOne qPCR module de </li><li> Qiagen DNeasy DNA Plant de préparation kit </li><li> Applied Biosystems ARN pour kit d&#39;ADNc </li><li> Roche ARN total de préparation kit </li></ul>

environmentally induced heritable changes in flax

Certaines variétés de lin de réagir au stress en nutriments, en modifiant leur génome et ces modifications peuvent être héritées à travers de nombreuses générations. Également associés à ces changements génomiques sont héréditaires phénotypique 1,2 variations. Le lin diverses Stormont Cirrus (Pl) lorsqu&#39;il est cultivé dans trois différentes conditions nutritives peuvent soit rester inductible (dans les conditions de contrôle), ou devenir stable modifiées soit à la genotroph grande ou petite par la croissance en haute ou basse conditions nutritives respectivement. Les lignes résultant de la croissance initiale de chacun de ces conditions semblent mieux se développer lorsqu&#39;il est cultivé dans les mêmes conditions dans les générations suivantes, notamment la ligne Pl pousse mieux dans le traitement de contrôle qui indique que la culture des plantes dans les nutriments haute et basse sont sous le stress. Une des modifications génomiques qui sont associées à l&#39;induction de changements héréditaires est l&#39;apparition d&#39;un élément d&#39;insertion (LIS-1) 3, 4, tandis que les plantes sont de plus en plus sous le stress nutritif. En ce qui concerne cet événement d&#39;insertion, le lin diverses Stormont Cirrus (Pl) lorsqu&#39;il est cultivé dans trois différentes conditions nutritives peuvent soit rester inchangé (dans les conditions de contrôle), ont l&#39;insertion apparaissent dans toutes les plantes (sous nutriments faible) et ont transmis cette à la génération suivante, ou avoir de l&#39;insertion (ou de parties de celui-ci) apparaissent mais ne pas être transmis à travers les générations (de nutriments sous haute) 4. La fréquence de l&#39;apparition de cette insertion indique qu&#39;il est sous sélection positive, qui est également conforme à la réponse de croissance dans les générations suivantes. Les feuilles ou les méristèmes récoltés à divers stades de croissance sont utilisés pour l&#39;ADN et l&#39;isolement d&#39;ARN. L&#39;ARN est utilisé pour identifier des variations dans l&#39;expression associée à la croissance des environnements différents et / ou t-il la présence / absence de LIS-1. L&#39;ADN isolé est utilisé pour identifier ces plantes dans lesquelles l&#39;insertion s&#39;est produite.

Watch this Scientific Journal Video about Environmentally Induced Heritable Changes in Flax at JoVE.com

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Growing certaines variétés de lin dans les résultats du stress de nutriments dans la variation génomique au sein d&#39;un sous-ensemble du génome et de la variation phénotypique. Une insertion complexes sur un site spécifique est associée à la croissance sous les divers régimes d&#39;éléments nutritifs et à des changements dans l&#39;expression des gènes dans ce site.

Induites par l&#39;environnement changements héréditaires dans lin

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

environmentally-induced-heritable-changes-in-flax

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K vues.  Case Western Reserve University. Growing certaines variétés de lin dans les résultats du stress de nutriments dans la variation génomique au sein d'un sous-ensemble du génome et de la variation phénotypique. Une insertion complexes sur un site spécifique est associée à la croissance sous les divers régimes d'éléments nutritifs et à des changements dans l'expression des gènes dans ce site.

Vidéo: Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test pour mesurer la réactivité comportementale du poisson-zèbre à l&#39;évolution des intensités de lumière

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Recherche

Biologie

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Méthodes Single Molecule pour surveiller les changements dans les propriétés élastique bicouche

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Changements dans la morphologie glande mammaire et le risque de cancer du sein chez les rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Les changements d&#39;équilibre dans la structure de l&#39;ARN de surveillance par «peroxydation» et «oxydatif» Hydroxyl Footprinting Radical

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mesure induite glutathion-réponse d&#39;alimentation à Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip Transformation de lin (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Pour générer transgéniques descendances avec un taux de transformation élevé

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Suivi des modifications induites par la drogue dans des récepteurs post-internalisation traite par Analyse Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Méthodes d’étude des changements dans l’agrégation des protéines inhérente avec l’âge chez Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...