Cette recherche a été financée par le Programme de R &amp; D pour la Société de la National Research Foundation (NRF), financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future (Grant No. 2013M3C8A1075908).

1. extraction d&#39;ADN à partir de la FFPE standard de référence des lignées cellulaires Remarque: Pour cette procédure, l&#39;extraction d&#39;ADN a été réalisée à partir de lignées de cellules standards de référence FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 et de type sauvage (WT)) en utilisant le kit d&#39;isolement d&#39;ADN de tissu FFPE de la manière décrite dans le protocole ci-dessous. Extraction de l&#39;ADN automatisé a été réalisé en suivant les instructions du fabricant pour l&#39;isolement de l&#39;ADN total. <ol><li> En utilisant un microtome et le bloc FFPE original, préparer de nouvelles sections manuellement avant l&#39;extraction et l&#39;analyse de l&#39;ADN, selon les procédures établies. Assurez-vous que l&#39;entrée d&#39;échantillon pour la section (s) de tissu analysé ne dépasse pas une épaisseur totale combinée de 10 um et que la surface spécifique ne dépasse pas 600 mm 2 pour un seul article. </li></ol> 1.2 protocole TPS Remarque: Les volumes indiqués dans le tableau 1 correspondent au minimum requis pour traiter les 48 échantillons, et la procédureindiqué est en conformité avec les lignes directrices de TPS. Avant de commencer l&#39;expérience installer les échantillons FFPE dans l&#39;e-tubes par centrifugation à 600 xg, pour éviter la perte des échantillons durant le programme automatisé. <ol><li> Allumez l&#39;instrument et l&#39;ordinateur automatisé d&#39;isolement d&#39;ADN. Ouvrez le logiciel de commande Exécuter et insérez un plateau de chargement automatique dans la zone pont de chargement TPS. </li><li> Distribuer des réactifs dans leurs creux correspondants comme représenté sur la figure 1. <ol><li> Placez les 4 échantillons (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% et 1%) dans les racks de support de l&#39;échantillon. </li><li> Placez les boîtes de pointe dans les creux des colonnes 2 et 3 et de vérifier les conseils de la présence de plus d&#39;un filtre par la pointe, ce qui annulerait la course. </li><li> Assurer le bon mélange du tampon de lyse et tampon de lavage en les inversant 3-5 fois et de les charger dans les creux respectifs de la colonne 4 (Figure 1). </li><li> Après avoir inversé pour quelques heures ou vort légèreExing, charger le tampon d&#39;élution, des billes magnétiques, et le tampon de la FFPE dans les petits creux dans la colonne 5, en laissant 1 emplacement vide où indiquée (Figure 1, Tableau 1). </li><li> Chargez une plaque de puits profond de 2 ml (DWP) sur le support de plaque (Figure 1). </li></ol></li><li> Effectuez les dernières étapes suivantes avant de commencer une course: <ol><li> Déboucher tous les tubes et les creux de réactifs. Assurez-vous que la capacité suffisante est disponible dans la bouteille de déchets liquides. Assurez-vous que la bouteille de déchets solides est vide et munie d&#39;un sac de Biohazard. Assurez-vous que la plaque pointe d&#39;éjection est centré dans l&#39;ensemble des déchets. </li><li> Fermez le capot avant. </li></ol></li><li> Démarrez le logiciel. Ouvrez le fichier NA_Prep_Main_MLSTARlet.med. </li><li> Cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. L&#39;état de l&#39;instrument passe du ralenti à la course. </li><li> Entrez le nombre d&#39;échantillons pour cette course. Choisissez la méthode souhaitée pour cette course (ADN = 0). Entrez la position du premier vol hauteume pointe, la sélection de &quot;1&quot; si tous les bacs sont pleins. Entrez la position de la première pointe de volume standard, sélectionner &quot;1&quot; si tous les bacs sont pleins. Remarque: L&#39;instrument sera alors courir à travers étapes automatisées, sans intervention de l&#39;utilisateur. Un flux de travail détaillé est présenté à la figure 2. Une fois que l&#39;expérience est terminée, les déchets de réactif et des conseils sont injectés dans l&#39;ensemble des déchets. </li><li> Quantifier l&#39;ADN génomique purifié à l&#39;aide d&#39;un procédé fluorimétrique. Note: Des échantillons d&#39;ADN qui contiennent une concentration minimale de 3,3 ng / ul sont soumis à une analyse ddPCR (section 2). </li></ol> 2. mutation de l&#39;ADN Profilage: Protocole ddPCR Remarque: Le protocole de mutation de l&#39;ADN profilage se compose de 3 grandes étapes: 1) la génération des gouttelettes, 2) l&#39;amplification par PCR conventionnelle, 3) la lecture des gouttelettes et 4) mutation de l&#39;ADN profilage. 2.1. Génération Droplet Remarque: ddPCR supermix estrecommandé pour ddPCR, que ce mélange contient les réactifs nécessaires pour la production de gouttelettes. <ol><li> Pour éviter la contamination, suivre les précautions standard, telles que le port de gants, en utilisant une hotte propre PCR, pipettes propres, et des tubes à faible liaison aux protéines. </li><li> Assurez-vous que la concentration minimale de l&#39;échantillon d&#39;ADN génomique humain est de 3,3 ng / ul. Note: La quantité de concentration de l&#39;échantillon d&#39;ADN purifiée varie en fonction de l&#39;analyse de détection de fréquence de mutation%. </li><li> Assembler mélanges de réaction dans des plaques de PCR à 96 puits. Décongeler et équilibrer les composants de la réaction à la température ambiante. Préparer les réactions PCR en combinant 2X ddPCR supermix (10 pi) et 20 amorces (avant et arrière, 900 nM) et d&#39;une sonde (250 nM) pour chaque échantillon d&#39;ADN purifié (66ng / 2 pi) faire jusqu&#39;à 20 pi avec de l&#39;eau distillée (comme par le protocole de générateur de gouttelettes) </li><li> Vortexer le mélange soigneusement pour assurer l&#39;homogénéité et centrifuger brièvement pour rassembler le contenu au fond du tube avant la distribution. Charge &amp; # 20181; l sur la cartouche pour la formation de gouttelettes. </li><li> Le fonctionnement du générateur de gouttelettes, selon le protocole recommandé par le fabricant <ol><li> Insérer la cartouche dans le support avec l&#39;encoche de la cartouche positionnée sur le côté supérieur gauche de la porte. Ajouter 20 pi de mélange réactionnel contenant des échantillons dans le milieu, et 70 ul d&#39;huile de générateur dans les puits de fond. </li><li> Attacher le joint d&#39;étanchéité dans la partie supérieure de la cartouche. Assurez-vous que le joint soit correctement accroché sur les deux extrémités du support; Sinon, la pression suffisante pour la génération de gouttelettes ne sera pas atteint. </li><li> Ouvrez le générateur de gouttelettes en appuyant sur le bouton vert sur le dessus de l&#39;appareil et insérez la cartouche. Lorsque le titulaire est dans la bonne position, à la fois la puissance (de gauche à droite) et titulaire (au milieu à droite) voyants sont au vert. </li><li> Appuyez sur le bouton en haut sur l&#39;instrument à nouveau pour fermer la porte et d&#39;initier la génération de gouttelettes. Remarque: Après avoir appuyé sur le button, a positions multiples se sur les puits de sortie, dessin pétrole et des échantillons à travers les canaux microfluidiques, où les gouttelettes sont créés. Gouttelettes se jettent dans la gouttelette bien, où ils accumulent. L&#39;indicateur de gouttelettes de lumière (à droite) clignote en vert après 10 secondes pour indiquer que la génération de gouttelettes est en cours. </li><li> Lorsque la génération des gouttelettes est terminée, tous les 3 voyants changent au vert solide; ouvrir la porte en appuyant sur le bouton, et retirez le support de l&#39;unité. Retirez le joint du support jetable et jetez-le. Remarque: Les meilleurs puits de la cartouche contiennent des gouttelettes, et les puits moyenne et inférieure sont presque vides, avec une petite quantité d&#39;huile résiduelle. </li></ol></li></ol> 2.2. Préparation pour la PCR <ol><li> Pour chaque échantillon, pipette à 40 ul du contenu de gouttelettes à partir du haut et les cartouches dans un seul puits d&#39;une plaque à 96 puits PCR recommandé comme indiqué dans le protocole de l&#39;instrument par le fabricant. Nonte: aide d&#39;une pipette multi-canal est idéal pour transférer les gouttelettes des émulsions. Aspiration lente et douce de gouttelettes est recommandée afin de minimiser le cisaillement de gouttelettes pendant les transferts. </li><li> Sceller la plaque PCR avec du papier immédiatement après le transfert de gouttelettes pour éviter l&#39;évaporation. Utilisation perforable joints de plaques de feuille qui sont compatibles avec la plaque PCR et scellant les aiguilles dans le lecteur de gouttelettes. Suivez les instructions dans le manuel d&#39;instruction de scellant pour plaques PCR. </li><li> Régler la température de la plaque de scellement à 180 ° C et le temps de 5 sec. </li><li> Appuyez sur la flèche pour ouvrir la porte du bac. Placez le bloc de support sur le plateau avec le côté 96 puits vers le haut. Placer la plaque à 96 puits sur le bloc de support et de sorte que tous les puits de la plaque sont alignés avec le bloc de support. </li><li> Recouvrir la plaque de 96 puits avec 1 feuille de papier d&#39;aluminium percé. Une fois la plaque 96 puits est fixé sur le bloc de support et couvert avec le papier d&#39;aluminium percé, appuyez sur le bouton d&#39;étanchéité. Le plateau se refermeet la chaleur étanchéité va initier. </li><li> Lorsque le thermoscellage est terminée, la porte ouvre automatiquement; retirer la plaque du bloc thermique pour le cyclage thermique, puis retirez le bloc thermique. </li><li> Veiller à ce que tous les puits de la plaque sont scellés en vérifiant que des dépressions dans la feuille sont facilement visibles sur chaque puits. Une fois scellé, la plaque est prêt pour le cyclage thermique. </li><li> Une fois gouttelettes sont supprimés, appuyez sur les loquets sur le support de la cartouche pour l&#39;ouvrir. Retirez la cartouche vide et le jeter. </li><li> Effectuer une amplification par PCR conventionnelle en suivant les paramètres détaillés dans le tableau 2. </li></ol> 2.3 lecture Droplet (selon le protocole recommandé par le fabricant) Note: Après amplification par PCR de la cible d&#39;acide nucléique dans les gouttelettes, l&#39;appareil de lecteur de gouttelettes analyse chaque gouttelette individuellement en utilisant un système de détection 2-couleur 13. Nous généralement configuré pour détecter un FAMd VIC fluorophores rapporteurs. <ol><li> Cliquez sur &quot;système de rinçage» pour amorcer le lecteur de gouttelettes et de le rendre prêt pour l&#39;analyse ddPCR. </li><li> Chargez la plaque dans le lecteur de gouttelettes et cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. Le lecteur de gouttelettes aspire chaque échantillon, singulates les gouttelettes et les flux en file indienne devant un détecteur 2-couleur. Le détecteur lit les gouttelettes d&#39;énumérer les échantillons positifs et négatifs. </li><li> Lorsque gouttelettes lecture est terminée, ouvrez la porte et retirez le support de plaque de l&#39;unité. Retirer la plaque PCR 96 puits de la porte et le jeter. </li><li> Pour un bon entretien, remplacer l&#39;huile de lecteur de gouttelettes et vider la poubelle, au besoin. Ajouter 50 ml d&#39;eau de Javel à 10% à la bouteille de déchets pour empêcher la croissance microbienne. </li></ol> 2.4 mutation de l&#39;ADN profilage (selon le protocole recommandé par le fabricant) Remarque: gouttelettes PCR-positives et PCR-négatifs sont comptés pour fournir quantific absolueation des cibles mutations BRAF V600E ADN sous forme numérique, en utilisant un logiciel d&#39;analyse de données. <ol><li> Cliquez sur Configuration pour entrer des informations sur les échantillons, des essais et des expériences. </li><li> Dans la fenêtre de configuration, charger une plaque (filename.qlp), puis cliquez sur Analyser pour ouvrir et analyser les données. L&#39;interface d&#39;analyse de données est séparé en trois fenêtres: Résultats Tableau, le sélecteur de puits et des données traitées / affichage graphique. </li><li> Dans la fenêtre données traitées, les données de concentration pour chaque cible apparaissent dans les puits dans le plan de la plaque et sont indiquées dans le tableau des résultats. Cliquez Concentration de visualiser les données dans les parcelles de concentration. </li></ol>

<ol>
	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number.">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification.">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li><li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline,+'definetherain'.">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li><li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR.">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943 (2013).</li><li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues.">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li><li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR.">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li></ol>

Myung Ryuri Oh, Eun Kim Si, et Young Kim Deug sont des employés de ABION CRO.

Ici, nous mettons en évidence l&#39;applicabilité de ddPCR et l&#39;isolement de l&#39;ADN à partir d&#39;échantillons de lignées cellulaires standards de référence FFPE une évaluation spécifique de la mutation du gène. Dans cette étude, TPS méthode d&#39;isolement d&#39;ADN automatisé est utilisé qui peut être facilement adapté, automatisé, et peut accueillir jusqu&#39;à 48 échantillons différents simultanément, permettant de plus grandes expériences à grande échelle et une plus faible variabili...

L&#39;accumulation de mutations génétiques dans les gènes régulateurs clés modifie la programmation de la cellule normale, comme la prolifération cellulaire, la différenciation et la survie, menant au cancer 1. La voie de RAS-RAF kinase-MAP médie la réponse cellulaire aux signaux de croissance. Mutations oncogènes BRAF peuvent résulter de mutations du pilote dans le gène BRAF, qui peuvent causer l&#39;oncoprotéine BRAF pour devenir hyperactive 2. Des mutations dans le gène BRAF se traduisent également par la signalisation en aval par l&#39;intermédiaire d&#39;hyperactivité de MEK et ERK 3, qui, à son tour, conduit à une croissance cellulaire excessive et la prolifération indépendamment de la régulation de la croissance médiée par le facteur 6/4. Plusieurs outils sont disponibles pour les mutations de l&#39;ADN profilage, tels que quantitatives en temps réel des mutations BRAF V600E dans de formol, inclus en paraffine (FFPE) référence des lignes de cellules standard par ddPCR. ddPCR est une méthode basée sur la PCR pour la quantification absolue-offrant une plus grande précision par rapport à quantitative en temps réel classique de PCR (qPCR) 7,8. ddPCR fournit également une plus grande puissance et de la précision de la résolution de la détection des mutations rares dans des matrices d&#39;ADN, permettant recherche sur le cancer et le diagnostic plus informative 9. Des avantages supplémentaires de ddPCR sur qPCR conventionnelle incluent sa sensibilité accrue et la précision lors de l&#39;étude des nombres de copies bas de modèle 10-12. Ici, un protocole d&#39;extraction automatique d&#39;ADN à partir de lignées de cellules standards de référence FFPE, suivie par détermination de la présence ou de l&#39;absence de mutations BRAF V600E par ddPCR est démontrée. L&#39;utilisation du logiciel d&#39;analyse de données et une représentation graphique des résultats sont également décrits. L&#39;ensemble de la procédure est relativement simple et dépend du nombre d&#39;échantillons à être profilées et le nombre de machines PCR et ddPCR classiques disponibles totalement. Le protocole suivant décrit les procédures standard pour BR<html> Des lignées de cellules positives AF-V600E FFPE référence standards (HD598, HD593, HD617, HD273 et de type sauvage (WT)) est réalisée dans un instrument entièrement automatisé en utilisant le système de préparation tissulaire (TPS) protocole. Par la suite, des échantillons d&#39;ADN isolés sont analysés pour la présence de mutations BRAF V600E utilisant le système ddPCR. Analyse de mutation ciblée est réalisée après que tous les échantillons ont été profilée et les données ont été chargées dans le logiciel d&#39;analyse des données. Selon le nombre d&#39;échantillons / groupes étudiés, l&#39;analyse des données peut exiger d&#39;une à plusieurs heures. Le composant expérimentale de la méthode nécessite une précision dans la manipulation <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Isoler Nucleic Acids de levure, une vidéo Éducation JoVE science expliquant plus sur sur le contexte de l&#39;ARN">de l&#39;ADN</a> etrologique Pipettes et pipettes, une vidéo JoVE enseignement des sciences en expliquant plus sur sur le contexte de pipetage &quot;&gt; pipetage en plaques à 96 puits, tandis que l&#39;analyse des données est effectuée en utilisant le logiciel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

Pour notre analyse ddPCR, nous avons étudié les références mutation FFPE lignes de cellules standard V600E BRAF. Le lecteur de gouttelettes se connecte à un ordinateur portable un logiciel d&#39;analyse de données informatique de fonctionnement. Chaque gouttelette individuelle est définie sur la base de l&#39;amplitude de fluorescence comme étant soit positif ou négatif. Le logiciel fourni par le fabricant permet également à un seuil défini par l&#39;utilisateur à saisir pour définir le seuil entr...

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Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Le but de cette vidéo est de montrer comment effectuer une extraction d&#39;ADN automatisée à partir des lignes de formol paraffine (FFPE) référence standards cellulaires et gouttelettes numérique PCR (ddPCR) analyse pour détecter des mutations rares dans un cadre clinique. Détecter des mutations dans des échantillons FFPE démontre l&#39;utilité clinique de ddPCR dans les échantillons FFPE.

Employant numérique Droplet PCR pour détecter des mutations BRAF V600E dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K vues.  Seoul National University.  Le but de cette vidéo est de montrer comment effectuer une extraction d'ADN automatisée à partir des lignes de formol paraffine (FFPE) référence standards cellulaires et gouttelettes numérique PCR (ddPCR) analyse pour détecter des mutations rares dans un cadre clinique. Détecter des mutations dans des échantillons FFPE démontre l'utilité clinique de ddPCR dans les échantillons FFPE. 

Vidéo: Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

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Biologie

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extraction d&#39;ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Protéomique Préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR est une méthode sensible et rapide pour la détection de l&#39;ADN cytomégalovirus dans la formaline fixe, inclus dans la paraffine des tissus de biopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d&#39;extraction d&#39;ADN

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

Immunotransfert quantitative de lignées cellulaires comme norme pour valider l’Immunofluorescence pour quantifier les biomarqueurs des protéines dans des échantillons de tissus courants

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

Protocoles de PCR numérique en gouttelettes à transcription inverse en deux étapes pour la détection et la quantification du SRAS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...