Le génie génétique est un outil précieux permettant de modifier les génomes d’organismes modèles dans un processus appelé transgénèse. En biologie du développement, cette approche est souvent utilisée pour exprimer les gènes modifiés qui peuvent être visualisées dans les tissus vivants. Par ailleurs, le génie génétique peut être utilisé pour empêcher ou perturber l’expression de la protéine pour étudier la fonction du développement de gènes spécifiques.
Cette vidéo va résumer les principes derrière cette technologie, revoir certaines procédures de génie génétique et les moyens de mettre en évidence que ces techniques sont utilisées dans le laboratoire.
Pour commencer, nous allons explorer certains concepts importants qui sous-tendent la transgénèse. Il s’agit d’insertion d’ADN dans le génome d’un organisme modèle. Il y a un certain nombre d’approches en fonction de l’objectif de l’étude.
Tout d’abord, ajout d’un gène altéré pourrait révéler des modifications fonctionnelles ou morphologiques en raison d’une mutation. Une autre méthode consiste à mettre en des copies supplémentaires du gène sauvage intact pour étudier les effets de la surexpression, qui peut souvent être tout aussi dommageable qu’une mutation. Une autre approche consiste à insérer une protéine de fusion qui contient une balise visualizable, tels que la protéine fluorescente verte, pour suivre l’emplacement et le minutage de l’expression génique dans les animaux vivants.
Le segment d’ADN qui sera inséré dans le génome doit être soigneusement conçu pour produire les modèles d’expression souhaité et les résultats. Le promoteur, qui est un élément de la séquence qui détermine quand et où un gène s’exprime, est une composante essentielle. Certains promoteurs sont partout exprimées tout au long de presque tous les tissus, tandis que d’autres ne sont plus actifs dans des tissus spécifiques. Promoteurs inductibles, qui sont activés par administration chimique ou l’exposition à des températures élevées, peuvent également servir pour contrôler le minutage de l’expression génique.
Pour être stablement exprimée dans les tissus, un transgène doit d’abord s’intégrer dans le génome. Pour ce faire, transgènes peut inclure des séquences d’ADN qui correspondent à des zones du génome de l’organisme d’accompagnement. Cela permet le transgène pour s’intégrer à l’hôte, l’ADN, par un processus appelé recombinaison homologue. Par ailleurs, chez certaines espèces des éléments spéciaux appelés transposons peuvent rendre transgénèse plus efficace en incluant les sites de reconnaissance pour la transposase enzyme, qui catalyse l’insertion aléatoire du transgène dans le génome.
Maintenant que vous savez de quelques-unes des bases du transgène design, passons en revue comment faire un animal transgénique. Pour rendre le transgène construire, commencer en amplifiant le gène d’intérêt à l’aide de la PCR. Cette région amplifiée est ensuite clonée dans un vecteur, qui est un morceau d’ADN qui peut transporter le transgène dans les cellules. Vecteurs contiennent généralement des éléments qui permettent l’amplification transgène efficace à l’aide de bactéries, comme e. coli. Après cette étape d’amplification, le vecteur est purifié à partir de la culture bactérienne.
Animaux transgéniques sont réalisés en injectant de l’ADN purifié dans des embryons. Dans les poissons et les grenouilles, les constructions sont généralement injectées directement dans le jaune d’oeuf ou le cytoplasme des embryons au stade unicellulaire. Pour la transgénèse induite par le transposon, une transcription codant l’enzyme transposase est ajoutée au mélange injection.
Chez la souris, la transgénèse peut être accompli par la manipulation des oeufs nouvellement fécondés dans lequel les spermatozoïdes et ovules pronucléus n’ont pas encore fusionné. La construction est injectée directement dans le pronucléus plus grande, où elle peut s’intégrer dans le génome que la cellule se divise. Les oeufs doivent ensuite être transplantés dans l’utérus d’une femelle pseudo-gravides pour le développement.
Efficacité de la transgenèse varie, donc les animaux doit subir un dépistage pour identifier les descendants dont la construction a réussi à intégrer dans le génome. Cela peut être fait en recherchant une balise fluorescente qui a été insérée pour une identification facile, ou au moyen d’analyses moléculaires tels que PCR de l’ADN génomique isolé de morceaux de tissus petit.
Une deuxième approche au génie génétique se concentre sur le ciblage de gènes spécifiques visant à désorganiser la fonction du gène. Il y a plusieurs approches pour atteindre cet objectif. Une méthode relativement nouvelle, appelée génome édition, tire parti des enzymes de séquences spécifiques appelées nucléases, qui recoupent l’épine dorsale de l’ADN et causent des mutations dans les gènes que l’ADN est réparé.
Une autre méthode de ciblage implique l’utilisation de la recombinaison homologue pour remplacer un gène soit ADN étranger ou une copie du gène flanqué par des séquences de reconnaissance pour les enzymes appelées les recombinases. Lorsque les recombinases sont présents, la séquence flanquée va être excisée du génome. Ceci est connu comme un masquage conditionnel, et contrôle de l’excision de gène peut être obtenu en exprimant l’enzyme dans des tissus spécifiques ou à certains moments.
Passons en revue une procédure générale pour la génération de souris knock-out par recombinaison homologue. Ici, une construction doit être préparée dans quelle partie de l’ADN génomique séquence est remplacé par ADN étranger. Cet ADN code souvent un autre gène, telles que la résistance aux antibiotique, qui fournit un moyen de sélectionner correctement modifié des cellules dans les étapes ultérieures.
Pour commencer la procédure, les cellules souches embryonnaires proviennent de la masse cellulaire interne d’un jeune embryon de souris appelée blastocyste. La construction linéarisée est transportée dans les cellules souches par électroporation, dans lequel les impulsions électriques génèrent transitoire de pores dans la membrane cellulaire. Les cellules sont alors autorisés à incuber en présence d’un antibiotique pour éliminer les cellules sans le transgène.
Après cette étape de sélection, les cellules souches peuvent être injectés dans un autre embryon de souris au stade de blastocyste. Les embryons sont ensuite transférés dans l’utérus d’une souris femelle pour poursuivre le développement. Les chiots qui en résulte sera chimères, qui sont composées de cellules de type sauvage et knock-out. Quelques chimères auront cellules knockout dans leur lignée germinale, qui transmet le gène perturbé lorsqu’ils sont élevés, qui établira alors une nouvelle ligne de knock-out.
Vous avez appris les bases du génie génétique des modèles de développement, alors maintenant nous allons regardent quelques applications pratiques.
Études sur le développement utilisent souvent des protéines fluorescent étiquetées pour identifier les cellules et d’étudier leur développement. À l’aide de tissu-spécifiques promoteurs, organismes transgéniques peuvent être conçues pour exprimer fluorescents protéines dans des cellules spécifiques, comme la crête neurale. Utilisant des techniques d’imagerie avancées, les cellules fluorescentes peuvent être photographiées en temps réel, permettant ainsi aux chercheurs de visualiser directement les événements développementaux complexes.
Une autre utilisation importante du génie génétique est à l’étude des gènes spécifiques et leur rôle dans les phénotypes de la maladie. Ici, les mutations ciblées sont introduites dans un gène de souris spécifiques à l’aide de nucléases, tels que les TALENs. PCR indique si la souris a zéro, une ou deux copies du gène muté. Les embryons porteurs de deux exemplaires mutants peuvent maintenant être étudiés en détail pour déterminer la fonction du développement du gène.
À l’aide de masquages conditionnels, les scientifiques peuvent déterminer la fonction d’un gène au sein d’un ensemble restreint de cellules. Ici, un gène loxP funèbre a été exprimé tout au long de l’embryon entier, mais Cre a été exprimé dans les cellules endothéliales, entraînant une délétion du gène dans le cœur et les vaisseaux sanguins. Ce tissu-spécifique a entraîné un changement mesurable dans la fréquence cardiaque embryonnaire et illustre comment tester le rôle localisé d’un gène sans changer tout l’organisme.
Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la technologie transgénique. Ces techniques permettent de comprendre les bases du génie génétique, certaines des méthodes qui sont impliqués, et comment elle est appliquée en sciences de la vie quotidienne. Le génie génétique peut être largement appliqué à travers de nombreux organismes et continuera d’être un outil important pour l’étude et la compréhension du rôle de la génétique dans les maladies du développement, ainsi que celles qui apparaissent à l’âge adulte. Merci de regarder !
