The authors thank G&#252;nter Oberd&#246;rster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Pour les échantillons de tissus qui ont subi coloration histologique classique, l&#39;identification et l&#39;analyse des nanoparticules d&#39;oxyde de métal peuvent être atteints grâce à une combinaison de EDFM, cartographie HSI, et des techniques d&#39;analyse d&#39;images. Bien qu&#39;il y ait une flexibilité dans la préparation d&#39;échantillons pour l&#39;histologie ou immuno-histochimie (par exemple, en utilisant des tissus fixes ou congelés; type de tache), il est important que les échantillons sont coupés à une épaisseur de 5 à 10 um pour une visualisation optimale. Les échantillons utilisés étaient ici fixés au formol et inclus en paraffine avant la coupe avec un microtome rotatif à 6 um d&#39;épaisseur, monté sur des lames de microscope en verre, colorées à l&#39;hématoxyline et à l&#39;éosine et lamelle. Tissus de la peau porcine en provenance de l&#39;ex vivo cutanée collaboration pénétration de toxicologie ont été utilisés pour cette étude. Les tissus ont été exposés à des nanoparticules d&#39;oxyde de métal (alumine, silice, oxyde de cérium) dans des suspensions aqueuses. Détection de la région (s) d&#39;intérêt (contraste élevé elements) avec EDFM est une première étape essentielle qui facilite ultérieure cartographie et l&#39;analyse HSI. Échantillons de contrôle positifs et négatifs doivent être visualisés et analysés en premier afin de créer une bibliothèque spectrale pour référence. Les spectres collectés à partir du contrôle positif sont exportés vers une bibliothèque spectrale de contrôle positif. Ensuite, tous les spectres à partir des images de contrôle négatif est soustrait de la bibliothèque spectrale du contrôle positif afin d&#39;améliorer la spécificité (réduire les faux positifs). La bibliothèque spectral filtré résultant est considéré comme le RSL qui sert à l&#39;analyse des matériaux d&#39;intérêt. Tous les échantillons de tissus sont soumis à un même processus de formation d&#39;image sont mis en correspondance et contre la RSL. L&#39;image résultante contiendra seulement dans des zones avec des éléments d&#39;intérêt sur un fond noir. Cette image pourrait alors être analysé avec ImageJ en utilisant ses fonctions de seuil et d&#39;analyse de particules pour obtenir la zone de particules cartographiés par champ de vision. Les données numériques obtenues à partir de ImageJ peuvent être exportationed à une feuille de calcul pour une analyse ultérieure. Il est important de considérer que les échantillons biologiques sont intrinsèquement différents les uns des autres, et les méthodes de coloration peuvent affecter la visualisation par EDFM et HSI, les paramètres d&#39;exposition doivent être déterminés conformément à ce que produit la meilleure image de contraste élevé pour un type spécifique de l&#39;échantillon. Bien que la réduction des faux positifs peut être obtenue par la filtration de bibliothèques de spectres, il est crucial d&#39;obtenir des témoins négatifs fiables qui ont évité la contamination par l&#39;élément d&#39;intérêt, comme des spectres correspondant à cette contamination pourrait être filtré à partir de la bibliothèque spectrale du contrôle positif , l&#39;augmentation des taux de faux négatifs. En outre, la gamme d&#39;intensité du spectre qui est détectable avec le logiciel d&#39;imagerie hyperspectrale ne peut pas dépasser la limite du logiciel particulier (pour cette étude, qui est de 16.000 unités): zones avec un nombre élevé de particules accumulées qui produisent spectral intensités supérieures à la limite d&#39;intensité sont laissés hors de la bibliothèque spectrale, en raison du risque d&#39;augmenter le nombre de faux négatifs. Bien que le système HSI confère de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles, il ya quelques inconvénients et limitations à considérer. La première est que la grande quantité de données optiques recueillies peuvent nécessiter une puissance de calcul importante. Une autre est que HSI peut être temps-intensive, en particulier aux premiers stades lorsque les bibliothèques spectrales de référence sont en cours de création. En outre, le temps d&#39;imagerie peut nécessiter plusieurs minutes par la capture d&#39;image, ce qui rend plus lent que l&#39;imagerie à fond noir simples; cependant, il est encore plus rapide que d&#39;effectuer la préparation des échantillons et visualisation par microscopie électronique. En outre, les systèmes complexes peuvent entraîner de multiples spectres caractéristiques, qui nécessitent le développement des contrôles hautement spécialisés et font la mise en place de standards, bibliothèques de référence universelles difficiles 26. Enfin, la technologieRésultats nique en résolution inférieure à celle des techniques Probe- ou microscopie électronique, telles que la microscopie à force atomique ou microscopie électronique en transmission, qui peuvent résoudre des atomes individuels. La résolution de cette technique est limitée en raison de sa nature photonique, ce qui l&#39;empêche d&#39;être un outil de haute précision pour la mesure des tailles de particules à l&#39;échelle du nanomètre ou pour localiser précisément les matériaux à un niveau sous-micron. Bien que la technique peut être en mesure d&#39;identifier des particules au sein de certains compartiments de tissus ou organites cellulaires supérieur à 1 pm (tels que des noyaux de cellules), petits organites ou caractéristiques sont difficiles à visualiser avec précision avec cette méthode. A noter également, compte tenu de sa résolution spatiale, cette méthode ne peut pas différencier entre les nanoparticules et simples agglomérats 11. D&#39;autres considérations incluent: certains matériaux (comme les métaux nobles) ont une réflectance beaucoup plus élevé et profils spectrales distinctes, ce qui peut les rendre plus faciles à analyze et carte spectrale avec cet outil. D&#39;autres, tels que les oxydes semi-métalliques étudiés dans cette étude et des nanomatériaux à base de carbone 24, 27, peut-être plus difficile en raison de leur composition élémentaire, la forme, et en fonction de la matrice. Dans deux études d&#39;inhalation murins par Mercer et al., Un système similaire à celui utilisé dans cette étude a été utilisé afin de localiser les nanotubes de carbone dans les poumons et dans les organes secondaires en fonction de leur remarquablement élevé contraste avec les tissus environnants. Cependant, la cartographie hyperspectrale n&#39;a pas été démontrée dans deux études, probablement parce que la forme unique de fibres de carbone était un trait suffisante pour une identification. Une autre considération a trait spécifiquement aux tissus: depuis le dépôt de nanoparticules d&#39;intérêt à des organes spécifiques à travers des processus biophysiques normales est imprévisible (et souvent elle-même l&#39;objet de l&#39;étude), la détermination d&#39;un contrôle positif applicable peut être difficile et exige un examen de la façon dont la génération de la commande might affecter l&#39;état d&#39;un matériau d&#39;intérêt. Par exemple, si une bibliothèque spectrale est créée à partir de nanoparticules cristallines d&#39;intérêt, il peut être difficile de cartographier la bibliothèque pour ces mêmes nanoparticules dans les tissus ou cellules en raison de changements dans les spectres résultant de l&#39;altération de la particule (par exemple, en raison de changer le pH, la dissolution, l&#39;agglomération, la liaison aux protéines) et le micro-environnement global ou matrice. Enfin, la technique est limitée par sa nature semi-quantitative: il peut seulement être aussi quantitative que d&#39;autres techniques de microscopie à deux dimensions de la résolution semblable, ce qui signifie qu&#39;il ne peut pas être facilement utilisé pour réaliser des tâches telles que la caractérisation de la charge d&#39;organes totale d&#39;un matériau. Dans l&#39;ensemble, EDFM HSI et fournissent plusieurs avantages par rapport nanomatériau imagerie et de caractérisation des techniques classiques, telles que TEM, et HAADF DIC. EDFM / HSI permet plus rapide acquisition et d&#39;analyse d&#39;image, ce qui permet d&#39;économiser du temps et de coût par rapport aux conven plus intensivetechniques supplémentaires. En outre, la préparation de l&#39;échantillon pour EDFM / IHV est généralement à la fois minimale et non destructive, ce qui économise du temps et permet également une analyse plus souple d&#39;un échantillon donné, car il peut alors être utilisé pour d&#39;autres techniques. En outre, HSI est souple, ce qui permet l&#39;analyse des matériaux à l&#39;échelle nanométrique de nombreuses compositions et dans une variété de matrices. L&#39;équipe de recherche travaille à affiner la méthode décrite ici pour d&#39;autres matériaux et les types d&#39;échantillons, y compris une évaluation en profondeur de la spécificité de la technologie. Une prochaine étape cruciale sous enquête par l&#39;équipe de recherche est la validation de ces techniques par rapport aux normes d&#39;or traditionnelles (par exemple, Raman, TEM, SEM) pour les matériaux et les types d&#39;intérêt de tissus.

Comme nanomatériaux sont de plus en plus utilisés dans une variété d&#39;industries et d&#39;applications, il est nécessaire pour l&#39;imagerie à l&#39;échelle nanométrique et de caractérisation des méthodes qui sont plus rapide, abordable et pratique que les modalités traditionnelles, telles que la microscopie électronique. Pour visualiser nanoparticules (NP) interactions avec les cellules, les tissus et les systèmes vivants, de nombreuses techniques optiques ont été employées, y compris contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) microscopie 1 et les approches de terrain évanescentes, tels que la réflexion totale interne (TIR) ​​ou quasi- microscopie à balayage de champ optique (SNOM) 2,3. Cependant, ce sont les approches analytiques haut de gamme, hors de portée de la plupart des laboratoires non spécialisés 4. La microscopie électronique, notamment la microscopie électronique à transmission (TEM), a également été utilisée pour étudier l&#39;interaction des cellules avec NP 5,6,7,8. Haut-angle fond noir annulaire (HAADF) microscopie électronique à transmission à balayage a été utilisée pour étudier l&#39;interaction des IP9 par des virus. La microscopie confocale est une autre technique populaire utilisé pour étudier les interactions cellulaires NP-10. Au cours des dernières années, l&#39;imagerie hyperspectrale (HSI) techniques basées sur fond noir-ont été utilisés comme un outil analytique prometteuse pour l&#39;étude des PN dans les matrices biologiques 11. HSI systèmes génèrent une représentation tridimensionnelle de données spatiales et spectrales, connu comme un hypercube ou Datacube 12. La carte spatiale de variation spectrale est utilisé pour l&#39;identification des matières. Les profils spectraux des matériaux connus peuvent être générés et utilisés en tant que bibliothèques de référence pour la comparaison avec des échantillons inconnus. L&#39;un des principaux avantages des systèmes d&#39;IHV est sa capacité à combiner l&#39;imagerie par spectroscopie, établissant ainsi l&#39;emplacement et de la distribution des IP inconnus in vivo ou ex vivo ainsi que les relier à une autre particule de connu, composition similaire référence. Il existe plusieurs avantagesen utilisant des systèmes d&#39;IHV sur les techniques d&#39;imagerie classiques: préparation de l&#39;échantillon minimal est nécessaire; préparation de l&#39;échantillon est typiquement non-destructive dans la nature; acquisition et d&#39;analyse d&#39;image est plus rapide; la technique est rentable 13; et la distribution spatiale et l&#39;analyse des composés de composition mixte et / ou dans des matrices complexes est plus facilement accompli 14. Pour la recherche sur les nanomatériaux impliquant précieux échantillons, l&#39;un des aspects les plus importants est la disponibilité d&#39;une méthode d&#39;imagerie non destructive, ce qui permet d&#39;examiner le potentiel de façon répétée des échantillons par une ou plusieurs méthodes. Répétées ou multiples analyses peut être souhaitable de développer des jeux de données complets qui ne seraient pas disponibles à partir d&#39;une seule méthode. Pour cet égard, l&#39;étude de ses propriétés optiques est le plus sûr moyen d&#39;analyser l&#39;échantillon. En utilisant un microscope à fond noir amélioré (EDFM) et le système HSI pour étudier la réponse optique de l&#39;échantillon - à savoir Reflectance, mais aussi absorbance et de transmission - l&#39;identification et la caractérisation de fonction peut être effectuée 15. Paramètres de caractérisation potentiels comprennent une évaluation de la taille relative et la forme de nanoparticules ou des agglomérats et la distribution des nanoparticules dans un échantillon. Dans cet article, nous décrivons les méthodes de cartographie spécifiquement pour les nanoparticules d&#39;oxyde de métal dans les tissus post-mortem en utilisant un système HSI basé sur un algorithme de correspondance pixel-spectrale appelé mappeur angle spectrale (SAM). Nous avons choisi cette application particulière, car elle a le potentiel de compléter actuel et futur de la recherche en nanotoxicologie vivo, dans laquelle des modèles animaux sont utilisés pour évaluer les conséquences sanitaires de l&#39;exposition aux nanomatériaux manufacturés. L&#39;application de cette méthode pourrait également informer recherche à l&#39;échelle nanométrique de délivrance de médicament qui utilise des modèles de tissus ou animales. En particulier, l&#39;absorption de nanoparticules, la distribution, le métabolisme et l&#39;excrétion long organs et les tissus pourraient être étudiés avec ce système. Une grande variété d&#39;applications sont à l&#39;étude pour une utilisation dans la recherche biomédicale 11. Cette méthode pourrait être utilisée pour l&#39;évaluation de différents échantillons biologiques (tels que les types différents tissus, d&#39;échantillons de lavage broncho-alvéolaire et les frottis de sang) qui ont été exposés à des nanoparticules d&#39;une variété de compositions élémentaires 16-19. En outre, ce procédé est utile pour l&#39;étude de la biodistribution des nanoparticules in vivo et in vitro, ce qui est pertinent pour des études d&#39;administration de médicament 11 à l&#39;échelle nanométrique. Au-delà des échantillons biologiques, EDFM et HSI peuvent être utilisés pour évaluer les nanoparticules dans les échantillons environnementaux, comme les eaux usées 20. Évaluation de l&#39;exposition professionnelle peut être facilitée par l&#39;utilisation de cette technique aussi bien, car il peut être utilisé pour évaluer l&#39;efficacité de l&#39;équipement de protection personnelle pour prévenir la pénétration de nanoparticules. En outre, la te de rechercheh développe actuellement un EDFM similaire et HSI protocole pour l&#39;évaluation d&#39;échantillons de supports filtrants de nanoparticules recueillies lors des évaluations d&#39;exposition professionnelle. Bien que ces types de préparation de l&#39;échantillon pour différents EDFM HSI et peut varier, il est important qu&#39;elles sont préparées d&#39;une manière telle qu&#39;ils peuvent être facilement visualisés par le système optique. Typiquement, l&#39;échantillon doit être préparé comme si elle allait être visualisée par microscopie en fond clair traditionnel. Il existe plusieurs systèmes d&#39;imagerie hyperspectrale disponibles dans le commerce 11.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CytoViva 150 Unit (condenser)</td>
			<td>CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>mounted to Olympus BX43 microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>for use with CytoViva 150 Unit condenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>enhanced darkfield camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>hyperspectral camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>1025087</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x&#160; 1.45mm)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>custom</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>type A microscopy immersion oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12368B</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol in water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software online download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal oxide nanoparticles</td>
			<td>supplied to the research team by industrial partners</td>
			<td></td>
			<td>alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metal oxide nanoparticles in histological samples by enhanced darkfield microscopy and hyperspectral mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

Microscopie hyperspectrale est utile pour sa capacité à identifier les matériaux d&#39;une manière similaire à la spectrophotométrie. Comme indiqué sur la figure 1, chaque matériau a plusieurs spectres caractéristique et une forme générale de sa réflectance, qui est unique. En outre, la figure 1 illustre la nature de la matrice dépendant des profils spectraux: les profils spectraux pour chacun des trois oxydes métalliques dans des échantillons de tissus histologiques (panneau supérieur) sont différents des profils spectraux pour chacun des trois oxydes métalliques, en suspension aqueuse ( panneau inférieur). En cartographiant les profils caractéristiques spectrales à des échantillons inconnus dans la même matrice, la technique est utile pour déterminer la présence ou l&#39;absence d&#39;un matériau, et peut également comparer semi-quantitative des quantités relatives de matière dans des échantillons. Les bibliothèques spectrales de référence créées à partir d&#39;échantillons de peau du contrôle positif sont appropriés pour la cartographie à l&#39;expérimentaldes échantillons de peau. Comme on le voit sur ​​la figure 2, les bibliothèques de spectres de référence de localisation et les témoins positifs correspondant et ne correspondent pas à des témoins négatifs correspondants. L&#39;avantage le plus important de la technique est sa capacité à détecter de faibles niveaux de matières d&#39;intérêt dans des échantillons, ainsi que pour les différencier des contaminants. . Par exemple, les nanotubes individuels peuvent être observées dans les poumons lors de l&#39;inhalation des doses aussi faibles que 40 pg dans un 20-30 g rat 25 la figure 3 illustre ce dans des échantillons histologiques de la peau: tandis que certaines particules sont facilement évidente dans l&#39;image optique fond noir (colonne 2), d&#39;autres sont détectés en utilisant l&#39;imagerie hyperspectrale (colonne 3) qui aurait pu être interrompue en utilisant la microscopie en fond clair (colonne 1) ou d&#39;autres méthodes. L&#39;utilisation de HSI fond noir sert également à améliorer la spécificité sur la microscopie en fond clair simple. Ces images peuvent ensuite être soumis à des formes plus quantitatives d&#39;analyse, nanalyse de particules otamment par ImageJ. Microscopie sur fond noir amélioré a plusieurs applications différentes, même en l&#39;absence d&#39;imagerie hyperspectral. La première est sa capacité à générer de haute qualité, des images à contraste élevé. Ceci est mieux mise en évidence par la figure 3, dans laquelle les particules d&#39;intérêt sont facilement identifiables par rapport à leurs homologues en fond clair. Ces images peuvent également être soumis à une analyse quantitative de particules, mais en l&#39;absence de cartographie hyperspectrale, la prudence est nécessaire pour éviter de confondre une particule contaminant d&#39;une particule d&#39;intérêt. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> Figure 1. Référence bibliothèques spectrales (matrice tissulaire) par rapport aux bibliothèques spectrales (nanoparticules en suspension). Ce chiffre démontre l&#39;importance de générer une bibliothèque spectrale de référence à partir nanomaterials d&#39;intérêt dans la même matrice que les échantillons expérimentaux. La première ligne montre la bibliothèque spectrale de référence (RSL) pour chaque matière dans cette étude (alumine, la silice et l&#39;oxyde de cérium). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Cette RSL a été créé par la méthode décrite dans ce protocole, où des échantillons de tissu de contrôle positif ont été filtrés contre les échantillons négatifs de tissus de contrôle. La deuxième ligne montre les bibliothèques spectrales (SL) créés à partir des nanoparticules d&#39;intérêt en suspension liquide sur une lame de verre. Pour l&#39;alumine, un pic à des longueurs d&#39;onde bimodal de 500 et 650 a été trouvé dans la RSL, tandis qu&#39;un pic de plus et moins courbe caractéristique a été observée dans la suspension d&#39;alumine NP SL à environ 600. Pour la silice, un pic à une longueur d&#39;onde d&#39;environ 650 était présent dans la RSL, alors un pic plus courbé et moins distinctif a été vu dans le NP de silice suspension SL à ArouND 600. Pour l&#39;oxyde de cérium, un pic bimodal a été trouvé aux longueurs d&#39;onde de 520 et 620 dans la RSL, alors un pic distinctif est moindre a été observée dans l&#39;oxyde de cérium NP suspension SL à environ 560. Cela suggère que la matrice dans laquelle les infirmières praticiennes sont intégrées crée un changement dans les spectres qui peuvent être considérables lors de la sélection des contrôles pour créer le SL pour l&#39;expérience aussi précis. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> Figure 2. Référence bibliothèques spectrales (matrice tissulaire) mappés sur le contrôle positif et le contrôle négatif tissus de la peau de porc. Ce chiffre sert de confirmation des RSL, le cas échéant pour la cartographie d&#39;échantillons expérimentaux, en ce que chaque RSL (colonne de gauche) correspond bien à son contrôle positif (colonne du milieu) correspondant et ne correspond pas à son contrôle négatif (colonne de droite) correspondant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez h</a>avant pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> Figure 3. hyperspectrale cartographie des tissus de la peau de porc expérimentale exposés à des nanoparticules d&#39;oxyde de métal. Rangées de haut en bas correspondent aux différentes couches de la peau, du plus superficiel au plus profond couche: épiderme, le derme et tissu sous-cutané, respectivement. La première ligne montre la couche cornée de l&#39;épiderme à partir d&#39;un échantillon de peau qui a été exposée aux IP alumine en suspension; la deuxième rangée été exposés à la silice IP en suspension; et la troisième rangée de Ceria IP en suspension. Chaque colonne représente la même zone de la peau imagée avec des techniques différentes. La première colonne correspond à la microscopie en fond clair (40X mag .; barre d&#39;échelle = 50 pm), où la zone inscrite dans un carré rouge a été agrandie (100X mag; barre d&#39;échelle = 10 um) avec amélioré microscopie sur fond noir (EDFM) dans la deuxième colonne, où des flèches blanches pointent vers le haut contraste IP. La troisième colonne a été obtenue avec une caméra hyperspectrale (HSI), montrant les mêmes IP de contraste élevé (flèches blanches). EDFM et IHV images ont été prises à 100X; barre d&#39;échelle = 10 um. La quatrième colonne montre l&#39;image HSI mappé contre le RSL respectif pour chaque groupe d&#39;exposition, où les IP alumine sont indiquées en vert, les IP de silice en rouge, et d&#39;oxyde de cérium IP en jaune, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

Identification des nanoparticules d&#39;oxyde de métal dans des échantillons histologiques par cartographie Darkfield Microscopie et hyperspectrale Enhanced

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K vues.  SUNY Polytechnic Institute, Colleges of Nanoscale Science and Engineering. Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Fabrication d&#39;un fonctionnalisés magnétique bactérienne nanocellulose avec oxyde de fer Nanoparticules

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

Cellule étiquetage et le ciblage des nanoparticules d&#39;oxyde de fer Superparamagnetic

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Synthèse entraînée par micro-ondes de l&#39;oxyde de fer Nanoparticules pour la détection rapide de l&#39;athérosclérose

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Fabrication d&#39;une extraction en phase solide Microchip Dipole-assistée pour analyse de traces métalliques dans des échantillons d&#39;eau

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Production de nanoparticules métalliques par laser-ablation pulsée dans les liquides: un outil pour étudier les propriétés antibactériennes des nanoparticules

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Nettoyage catalytique de plante oxygénées espèces In Vivo par des nanoparticules d’oxyde de cérium anioniques

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

Utilisation de la magnétométrie pour surveiller l’incorporation cellulaire et la biodégradation subséquente des nanoparticules d’oxyde de fer synthétisées chimiquement

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires intraoperative diagnostic tools to avoid repeated surgeries due to a positive surgical margin. Recently, by taking the advantage of the high intrinsic optical absorption of DNA/RNA at 266 nm wavelength, ultraviolet photoacoustic microscopy (UV-PAM) has been developed to provide high-resolution histological images without labeling, showing great promise as an intraoperative tool for SMA. To enable the development of UV-PAM for SMA, here, a high-speed and open-top UV-PAM system is presented, which can be operated similarly to conventional optical microscopies. The UV-PAM system provides a high lateral resolution of 1.2 &#181;m, and a high imaging speed of 55 kHz A-line rate with one-axis galvanometer mirror scanning. Moreover, to ensure UV-PAM images can be easily interpreted by pathologists without additional training, the original grayscale UV-PAM images are virtually stained by a deep-learning algorithm to mimic the standard hematoxylin- and eosin-stained images, enabling training-free histological analysis. Mouse brain slice imaging is performed to demonstrate the high performance of the open-top UV-PAM system, illustrating its great potential for SMA applications.

A high-speed and open-top ultraviolet photoacoustic microscope that can provide histological images intraoperatively for surgical margin analysis is demonstrated, including the system configuration, optical alignment, sample preparation, and experimental procedures.