Ce travail a été partiellement financé par Regione Toscana et de la Communauté européenne dans le cadre de la BUBBLE ERANET + Projects LUS et BI-TRE.

Note: Toutes les concentrations de nanotiges d&#39;or sont exprimés en termes de nominal Au molarités. A titre de comparaison avec d&#39;autres œuvres, notez que 1 M Au correspond à peu près à 20 uM nanotiges d&#39;or, dans notre cas. 1. Préparation de Cationic Or nanorods Remarque: La méthode commence avec la synthèse du bromure de cétrimonium (CTAB) -capped nanotiges d&#39;or par réduction autocatalytique de HAuCl 4 avec de l&#39; acide ascorbique, selon le protocole présenté par Nikoobakht et al 25 , et adapté en fonction des Ratto et al 26... Ensuite , ces nanotiges or sont modifiées afin d&#39;obtenir plus de biocompatibilité et de l&#39; affinité pour les membranes plasmatiques, par la combinaison de polyéthylène - glycol brins 10, 11, 27, 28 et des composés d&#39;ammonium quaternaire 22. <ol><li> Purifier 24 ml nanorods or CTAB-plafonnés à un Concentration de 450 uM Au par deux cycles de centrifugation (12 000 xg, 30 min) et décantation. Assurez-vous que le rapport du volume mort au volume initial est d&#39;environ 1/200 ou plus bas pour toutes les étapes de centrifugation dans ce protocole. Utiliser CTAB 500 um aqueuse comme une solution de lavage et enfin transférer les particules dans 6 ml de tampon acétate 100 mM à pH 5 contenant 500 uM de CTAB et 0,005% (v / v) de polysorbate 20. </li><li> Ajouter 30 pi 10 mM aqueux alpha-méthoxy-oméga-mercapto-poly (éthylène glycol) (MW ~ 5000) et laisser réagir pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 30 ul de 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N bromure de triméthylammonium dans du diméthylsulfoxyde et de laisser au repos pendant 24 heures à 37 ° C. </li><li> Ensuite, ajouter 18 ml de 0,005% (v / v) de polysorbate 20 dans de l&#39;eau et on purifie ces particules par quatre cycles de centrifugation (12 000 xg, 30 min) et décantation. Utiliser 0,005% (v / v) de polysorbate 20 dans l&#39;eau comme solution de lavage et enfin transférer les particules dans du PBS stérile 2,4 ml à un pH7.4. La concentration nominale finale de l&#39;or est de 4,5 mM. </li></ol> 2. Chargement des macrophages murins avec or nanorods <ol><li> Utiliser la lignée cellulaire de monocytes / macrophages J774A.1 et du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 1 mM de glutamine, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine en tant que milieu de culture. Plate 5 x 10 5 cellules dans quatre boîtes de Pétri de 60 mm de diamètre et leur permettre de se développer pendant 24 heures, de manière à être subconfluent au moment du détachement (voir étape 2.2). <ol><li> Tout au long du protocole, de maintenir les cellules dans des conditions standard de culture (37 ° C, 5% de CO2, 95% d&#39; air et 100% d&#39; humidité relative). Utilisez une hotte à flux laminaire et de l&#39;équipement de protection individuelle approprié pour manipuler les cellules. </li></ol></li><li> Après 24 h, charger les cellules avec cationiques nanotiges d&#39;or et les préparer à être intégré dans des films de chitosane: <ol><li> Afin de permettre aux particules d&#39;être absorbées par les cellules, ajouter une portion aliquote de 4,5mM Au nanotiges d&#39;or cationique dans PBS dans chaque boîte de Pétri, de manière à parvenir à une concentration finale de 100 uM Au. Laissez les boîtes de Pétri en incubation pendant 24 heures. </li><li> Ensuite, observer les cellules sous un microscope optique pour confirmer leurs bonnes conditions et le téléchargement. Les cellules doivent présenter leur morphologie normale et un certain nombre de vésicules intracellulaires sombres. Détacher les cellules par un racleur, fusionner ceux de deux boîtes de Petri, afin d&#39;obtenir une quantité appropriée de cellules pour les étapes suivantes (au moins 2 x 10 6 cellules) et centrifuger les (120 x g, 6 min) pour éliminer toute excès de nanotiges d&#39;or cationiques. Le culot cellulaire devrait ressembler presque noir. </li><li> Suspension le culot dans 2 ml de PBS et compter les cellules par l&#39;utilisation d&#39;une chambre Bürker. Centrifuger une suspension contenant 2 x 10 6 cellules (120 xg, 6 min) et fixe leur culot dans 2 ml de 3,6% (p / v) de formaldehyde dans du PBS pendant dix minutes à la température ambiante. Enfin, lavez cette pastille à trois reprises par centrifugation (120 xg, 6 min) afin d&#39;éliminer le fixateur. En utilisant du PBS comme solution de lavage. </li></ol></li></ol> 3. Embedment de Macrophages en chitosane Films Remarque: Les propriétés particulières de chitosane 26, 27, 28, 29 sont exploités pour produire des fantômes biomimétiques contenant des macrophages colorés avec nanotiges d&#39;or cationiques. En ce qui concerne d&#39; autres hydrogels tels que l&#39; agarose, le chitosane permet des films qui sont beaucoup plus forts et plus mince, ce qui est essentiel pour la microscopie PA 6. La fabrication de ces fantômes est effectuée selon des protocoles antérieurs 29, 30, 31 , avec quelques modifications imposées par les 30 suivants. <ol><li> Préparer un acidifiée (pH 4,5, obtenu par addition d&#39;acide acétique) et visqueux à 3% (p / v) de chitosan de faible poids moléculaire (poids moléculaire moyen de 120 kDa), la solution, bien mélanger etlaisser homogénéiser pendant 24 heures à 40 ° C. </li><li> Ensuite, mélanger les macrophages murins contenant nanotiges d&#39;or cationique (2 x 10 6 cellules) avec 500 pi de solution de chitosane. </li><li> Afin d&#39;obtenir ~ 50 um d&#39; épaisseur fantômes, verser 250 mg du mélange dans 1,91 cm 2 moules en polystyrène et les laisser sous un courant d&#39;azote pendant 24 heures. Par la suite, le traitement de ces échantillons avec 500 ul de NaOH 1 M, afin d&#39;induire la réticulation, et les rincer avec 10 ml d&#39;eau ultrapure. </li></ol> 4. Contrôle de la stabilité de la conversion Photoacoustique Remarque: La stabilité de conversion PA est étudiée au moyen d&#39;expériences PA avec la configuration fait maison qui est décrite dans la référence 6. <ol><li> Suspendre un film de chitosan contenant les macrophages dans l&#39;eau déminéralisée, par exemple par l&#39;utilisation d&#39;un support en plastique immergé dans une boîte de Petri, de manière à garder une distance d&#39;environ 5 mm du fond de la plaque. Mettez cette plaque sur un étage XY micrométriqueafin de contrôler la position de l&#39;échantillon. </li><li> Focaliser un faisceau laser avec ~ 5 durée nsec d&#39;impulsion en résonance avec la bande plasmonique longitudinale des nanotiges d&#39;or (par exemple, provenant d&#39; un oscillateur paramétrique optique pompé par la troisième harmonique d&#39;un laser Nd Q-switché: YAG laser avec une longueur d&#39;onde de 400 - 2500 durée nm et impulsion de 5 nanosecondes) perpendiculaire à la surface du film avec un diamètre de spot ~ 300 um. <ol><li> Placer un atténuateur en face de la sortie du laser pour régler la fluence du laser et en utilisant un diviseur de faisceau pour focaliser une partie du faisceau laser à un compteur d&#39;énergie (par exemple, un détecteur pyroélectrique) , et surveiller les variations de fluence. Maintenir la fluence optique en dessous de ~ 1 mJ / cm 2 par impulsion pendant l&#39;alignement. Porter des lunettes de sécurité laser appropriée chaque fois que le laser est activé. </li></ol></li><li> Trempez un transducteur à ultrasons (plage de fréquence de 1 - 20 MHz) dans la boîte de Pétri ~ 2 mm hors de la surface du film et ajuster sa position en utilisant les traductions micrométriqueset les étapes de rotation pour maximiser le signal émis PA à partir du film. </li><li> Déterminer une fluence de la sonde F LO qui ne porte pas atteinte à l&#39;échantillon 6: <ol><li> Irradier un point de l&#39;échantillon aléatoire à une fluence environ 1 mJ / cm 2 par impulsion pour au moins 500 impulsions. Pour chaque impulsion, PA acquérir le signal correspondant à partir du transducteur à ultrasons et la fluence laser provenant du compteur d&#39;énergie à un oscilloscope. Nom de la fluence moyenne comme essai F LO. </li><li> Calculer l&#39;intensité du signal PA en tant que son amplitude crête à crête en fonction du nombre d&#39;impulsions. Afin de contrepoids aux fluctuations d&#39;intensité du laser, de normaliser l&#39;amplitude de chaque signal PA au rapport de sa propre fluence procès F LO. Analyser l&#39;évolution de l&#39;intensité normalisée PA en fonction du nombre d&#39;impulsions et de vérifier sa stabilité dans le temps. </li><li> Dans le cas d&#39;instabilité, répétez les étapes 4.4.1 à 4.4.3 avec une valeur inférieure de F LO <sup&gt; procès. Dans le cas de la stabilité, répétez - les avec une valeur de procès F LO supérieur de ~ 10%, jusqu&#39;à ce qu&#39;une perte de stabilité se pose. Réglez la sonde fluence F LO que la deuxième valeur la plus élevée de l&#39; épreuve F LO qui assure la stabilité. </li></ol></li><li> Mesurer un seuil fluence remodelant: <ol><li> Choisir un autre point de l&#39;échantillon aléatoire et sonder une intensité moyenne PA (I LO a) plus de 500 impulsions à F LO. </li><li> Définir une fluence nominale supérieure à F LO et de fournir 50 impulsions. Nom de leur fluence moyenne comme F exc. </li><li> Sonde à nouveau une intensité moyenne PA (I LO b) de plus de 500 impulsions à F LO. Calculer le ratio R = I LO b / I LO a. Une valeur de R inférieure à l&#39;unité donne la preuve d&#39;un changement irréversible des propriétés optiques de l&#39;échantillon. </li><li> Utilisez la scène XY micrométrique pour déplacer le film et changer le point de l&#39;échantillon au hasard. Répétez les étapes 4.5.1 à 4.5.4 avec différentes valeurs de F exc, de manière à prendre quelques valeurs de R ci - dessous, autour et au-dessus de l&#39; unité. 15 points sont raisonnables. </li><li> Parcelle R en fonction de F exc et identifier le seuil de reprofilage fluence F th en tant que valeur lorsque R commence à varier d&#39;une au - delà de l&#39; incertitude statistique. 6 </li></ol></li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

La notion de cibler les macrophages associés aux tumeurs est en train de devenir un concept puissant pour lutter contre le cancer 34, 35, 36. Ici, au lieu de leur destruction, ces cellules sont recrutés en tant que véhicules cellulaires pour apporter nanotiges d&#39;or dans une tumeur, par l&#39;exploitation de leur tropisme. Cette perspective exige une conception réfléchie des particules, leur intégration dans les cellules et leur caractérisation. Nous avons...

Au cours de la dernière décennie, diverses particules plasmoniques telles que nanotiges d&#39;or, nanobilles et nanocages, ont reçu une attention considérable pour les applications en optique biomédicale 1, 2, 3, 4. En contradiction avec les nanosphères d&#39;or standard, ces particules nouvelles résonnent dans la fenêtre proche infrarouge (NIR) qui prévoit la plus profonde pénétration optique à travers le corps et le plus haut contraste optique sur les composants endogènes 1. Cette fonction a suscité un intérêt pour des applications innovantes, telles que la photoacoustique (PA) imagerie et l&#39;ablation photothermique du cancer. Cependant, plusieurs problèmes freinent la pénétration clinique de ces particules. Par exemple, leur activation optique tend à induire leur surchauffe et de modifier leurs formes fonctionnelles vers des profils plus sphériques, qui entraîne un photoinstabilité 5, 6, 7, 8 </sup&gt;, 9. Une autre question qui domine le débat scientifique est leur administration systémique dans les tumeurs. En particulier, nanotiges d&#39;or combinent tailles qui sont idéales pour imprégner les tumeurs qui présentent une perméabilité accrue et la rétention et la facilité de conjugaison avec des sondes spécifiques de marqueurs malignes. Par conséquent, leur préparation pour une injection directe dans la circulation sanguine est perçue comme un système réalisable 10, 11, 12, 13. Cependant, cette voie reste problématique, avec la plupart des particules devenant capturées par le système phagocytaire mononucléaire 10, 11, 12. En outre, un autre problème réside dans la stabilité optique et biochimique des particules après circulation à travers le corps 14. Lorsque les particules perdent leur stabilité et de l&#39; agrégat colloïdale, leurs caractéristiques plasmon et la dynamique du transfert de chaleur peuvent souffrir de couplage plasmonique 15, </sup&gt; 16, 17 et contre-surchauffe 18. Plus récemment, la notion d&#39;exploiter le tropisme des macrophages associés aux tumeurs est apparue comme une solution de rechange à puce 19, 20, 21. Ces cellules détiennent une capacité innée à détecter et infiltrer les tumeurs avec une grande spécificité. Par conséquent, un point de vue peut être d&#39;isoler ces cellules d&#39;un patient, de les charger avec nanorods or in vitro, puis de les injecter dans le patient, avec l&#39;intention de les utiliser comme véhicules cellulaires en charge de la livraison. Un autre avantage serait de gagner plus de contrôle sur la stabilité optique et biochimique des particules, en raison de leur interface biologique serait construit in vitro. Pourtant, les performances de ces véhicules cellulaires comme agents de contraste optiques ont besoin d&#39;une analyse critique. Dans ce travail, nous décrivons la préparation et les questions critiques de Cellulvéhicules ar contenant nanotiges d&#39;or pour l&#39;imagerie PA du cancer. PEGylés nanotiges d&#39;or sont modifiées avec des composés d&#39;ammonium quaternaire 22, afin d&#39;obtenir un profil cationique qui devrait favoriser leurs interactions avec les membranes plasmatiques 23, 24. Ces particules subissent l&#39;absorption efficace et non spécifique de la plupart des types cellulaires, nous l&#39;espérons, sans interférer beaucoup avec leurs fonctions biologiques. macrophages murins sont chargés avec jusqu&#39;à moins de 200, 000 nanotiges d&#39;or cationiques par cellule, qui deviennent confinées dans les vésicules d&#39;endocytose serrés. Cette configuration devrait se poser problème, en raison de la menace de couplage plasmonique et le contre-surchauffe à l&#39;intérieur de ces vésicules. Par conséquent, les macrophages sont noyés dans des hydrogels biopolymères qui imitent les tissus biologiques, afin de vérifier que la majeure partie de la stabilité de la conversion PA des particules est retenue dans le transfert du milieu de croissance des vésicules d&#39;endocytose. effectivles critères de mesure de e sont élaborés afin de mesurer la stabilité de la conversion PA dans des conditions d&#39;intérêt immédiat pour l&#39;imagerie PA. Un seuil remodelage est réglé au début même de l&#39;instabilité optique après un train de 50 impulsions laser avec le taux de répétition typique de 10 Hz. Nous sommes convaincus que ces résultats peuvent donner une impulsion pour le développement de nouvelles stratégies pour délivrer des particules plasmoniques à des tumeurs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6269</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold(III) chloride trihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">520918</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silver nitrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5960</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanoseeds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MeO-PEG-SH</td>
			<td style="width:104px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PEG1171</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8750</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">733305</td>
			<td style="width:321px;">To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td style="width:321px;">To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;&#160;Polysorbate 20</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:321px;">To centrifuge PEGylated gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td style="width:321px;">To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">J774a.1</td>
			<td style="width:104px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:321px;">Monocyte/macrophage murine cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-707F</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">705001</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:104px;">EuroClone</td>
			<td style="width:119px;">ES7018</td>
			<td style="width:321px;">To detach cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:104px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">47630</td>
			<td style="width:321px;">To fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chitosan, low molecular weight&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">448869</td>
			<td style="width:321px;">75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">306576</td>
			<td style="width:321px;">To insolubilize chitosan and generate the hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene cell culture plates</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">702011</td>
			<td style="width:321px;">Used as molds to fabricate chitosan hydrogels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:104px;">Continuum, Santa Clara, USA</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Surelite OPO plus</td>
			<td style="width:321px;">Source of optical excitation for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pyroelectric detector&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Gentec, Quebec, Canada</td>
			<td style="width:119px;">QE8SP</td>
			<td style="width:321px;">To monitor optical fluence for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Pre amplified needle hydrophone</td>
			<td style="width:104px;">Precision Acoustic, Dorset, UK</td>
			<td style="width:119px;">Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range</td>
			<td style="width:321px;">To measure photoacoustic signals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods

nanotiges d&#39;or sont attrayants pour une gamme d&#39;applications biomédicales telles que l&#39;ablation photothermique et l&#39;imagerie photoacoustique du cancer, grâce à leur absorbance optique intense dans la fenêtre proche infrarouge, une faible cytotoxicité et le potentiel de la maison dans les tumeurs. Cependant, leur livraison à des tumeurs reste encore un problème. Une approche innovante consiste en l&#39;exploitation du tropisme des macrophages associés aux tumeurs qui peut être chargé avec nanotiges d&#39;or in vitro. Ici, nous décrivons la préparation et l&#39;inspection photoacoustique des véhicules cellulaires contenant nanotiges d&#39;or. PEGylés nanotiges d&#39;or sont modifiées avec des composés d&#39;ammonium quaternaire, afin d&#39;obtenir un profil cationique. En cas de contact avec les macrophages murins dans des boîtes de Petri ordinaires, ces particules se trouvent à subir une utilisation massive dans des vésicules d&#39;endocytose. Ensuite, ces cellules sont noyés dans des hydrogels biopolymères, qui sont utilisés pour vérifier que la stabilité de la conversion photoacoustiquedes particules est retenue dans leur inclusion dans des véhicules cellulaires. Nous sommes convaincus que ces résultats peuvent fournir une nouvelle source d&#39;inspiration pour le développement de nouvelles stratégies pour délivrer des particules plasmoniques à des tumeurs.

Ici, la faisabilité des véhicules cellulaires contenant nanotiges d&#39;or pour l&#39;imagerie PA du cancer est montré ainsi que les résultats typiques du protocole. Les images TEM dans la figure 1 montrent l&#39;aspect habituel des particules après l&#39; étape 1 et de leurs véhicules cellulaires après l&#39; étape 2. La préparation des particules et des cellules pour l&#39; imagerie TEM est décrit...

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Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Préparation et Photoacoustique Analyse des véhicules cellulaires contenant de l&#39;or nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K vues.  Italian National Research Council. We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

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Bio-ingénierie

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Fabrication de micro-tissus en utilisant des modules de gel de collagène cellules contenant

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Protocoles de préparation des échantillons, d&#39;imagerie et d&#39;analyse pour la microscopie à balayage en lame de couteau

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Détection et isolement des cellules du mélanome de circulation à l&#39;aide Débitmétrie photoacoustique

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Intégré ophtalmoscopie photoacoustique et Spectral-domaine tomographie par cohérence optique

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Photoacoustic Cystography

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The risk of bladder cancers in children due to radiation exposure is more significant than many other cancers. Here we demonstrate the feasibility of nonionizing and noninvasive photoacoustic (PA) imaging of urinary bladders, referred to as photoacoustic cystography (PAC), using near-infrared (NIR) optical absorbents (i.e. methylene blue, plasmonic gold nanostructures, or single walled carbon nanotubes) as an optical-turbid tracer. We have successfully imaged a rat bladder filled with the optical absorbing agents using a dark-field confocal PAC system. After transurethral injection of the contrast agents, the rat's bladders were photoacoustically visualized by achieving significant PA signal enhancement. The accumulation was validated by spectroscopic PA imaging. Further, by using only a laser pulse energy of less than 1 mJ/cm2 (1/20 of the safety limit), our current imaging system could map the methylene-blue-filled-rat-bladder at the depth of beyond 1 cm in biological tissues in vivo. Both in vivo and ex vivo PA imaging results validate that the contrast agents were naturally excreted via urination. Thus, there is no concern regarding long-term toxic agent accumulation, which will facilitate clinical translation.

Photoacoustic cystography (PAC) has a great potential to map urinary bladders, a radiation sensitive internal organ in pediatric patients, without using any ionizing radiation or toxic contrast agent. Here we demonstrate the use of PAC for mapping urinary bladders with an injection of optical-opaque tracers in rats in vivo.

Cystographie Photoacoustique

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Préparation et analyse des<em&gt; In vitro</em&gt; Trois Breast Dimensional Carcinome Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Fabrication et caractérisation des fantômes de tissu optique contenant la Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Préparation, Purification et l’utilisation de Liposomes contenant de l’acide gras

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Préparation et Photoacoustique Analyse des véhicules cellulaires contenant de l'or nanorods

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