This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Culture cellulaire des cellules cérébrales microvasculaire endothéliales humaines (HBMEC) <ol><li> Revêtement des flacons de culture cellulaire <ol><li> Pour préparer la solution de fibronectine, ajouter 10 ml de PBS à un tube à centrifuger de 15 mL. Ajouter 150 pi fibronectine et bien mélanger. </li><li> Pour couvrir le fond d&#39;un flacon de culture de cellules T-25 ajouter 2 mL de la solution de fibronectine. Incuber le flacon de culture cellulaire pendant au moins 3 h à 37 ° C dans l&#39;incubateur. Des flacons revêtus de fibronectine peuvent être stockés pendant 2 semaines à 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol></li><li> Et Ensemencement culture cellulaire de HBMEC <ol><li> Aspirer la solution de fibronectine à partir du fond du flacon de culture de cellules. Ajouter 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² en suspension dans 6 ml de milieu ECM-b (= ECM-B supplémenté avec 5% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine et 1% de supplément de croissance des cellules endothéliales). Incuber à 37 ° C / 5% CO 2. Vérifiez la croissance cellulaire à l&#39;aide quotidienne d&#39;un microscope. </li><li> Changer le support tous les 3 jours.Récolte ou fractionnement de cellules, lorsque HBMEC atteignent la confluence d&#39;environ 80%. HBMEC doit être utilisé entre le passage 1 et 15 pour éviter la perte des propriétés physiologiques. </li></ol></li><li> Récolte HBMEC. <ol><li> Préparer Accutase solution en mélangeant Accutase (1x) avec du PBS dans un rapport de 1: 1. Maintenir Accutase solution à 37 ° C dans un bain d&#39;eau jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Transfert moyen ECM-b de la fiole de culture de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL. Laver HBMEC par addition de 5 ml de PBS au fond du flacon de culture de cellules. Aspirer PBS et répéter l&#39;étape de lavage deux fois de plus. </li><li> Ajouter une solution préchauffée Accutase 2 ml. Incuber à 37 ° C pendant 2 min. Par la suite, HBMEC sont remis en suspension en appuyant fermement le flacon de culture cellulaire à plusieurs reprises. détachement des cellules est contrôlée à l&#39;aide d&#39;un microscope </li><li> L&#39;ECM-b-support précédemment stocké dans un tube de 15 ml est ajouté à nouveau dans le ballon de culture de cellules dès HBMEC commencent à se détacher. Rincer à plusieurs reprises le fond du flacon jusqu&#39;à ce que la plupart sont HBMECremis en suspension. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu ECM-b. Compter les cellules et on dilue la suspension de cellules pour obtenir une concentration finale de 3 x 10 5 ml de milieu par HBMEC ECM-b. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des inserts pour la culture cellulaire <ol><li> Le revêtement des inserts de culture cellulaire Remarque importante: Évitez de toucher la membrane des inserts de culture cellulaire. <ol><li> Ajouter une solution de 100 ul de fibronectine (voir 1.1.1) de chaque insert de culture de cellules (Figure 1A) et un puits d&#39;une plaque à fond plat à 96 puits (puits de contrôle optique). Incuber pendant au moins 3 h à 37 ° C. Après incubation de la solution aspirée fibronectine. </li><li> Ajouter 100 pi suspension HBMEC aux inserts de culture cellulaire et le puits de contrôle optique. Ajouter 600 ul de milieu ECM-B vers le compartiment inférieur de la celluleinserts de culture. Incuber pendant 3 - 4 jours à 37 ° C / 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que l&#39; intégrité de la barrière (figure 1B) est atteinte, vérifier la croissance cellulaire par évaluation microscopique du HBMEC dans le puits de contrôle optique. Note: La croissance cellulaire au-delà de quatre jours est pas recommandé. </li><li> Facultatif: Pour reproduire les conditions inflammatoires Aspirer le milieu du compartiment inférieur et le remplacer par du milieu ECM-B supplémenté avec 500 U / ml d&#39;IFN-γ / TNF-α de 24 h avant l&#39;essai de migration. </li></ol></li></ol> 3. Contrôle de la qualité avec Evans bleu le jour du dosage Transmigration <ol><li> Préparation de la solution bleu evans <ol><li> Pour préparer une solution de mélange PBS / B27 10 ml de PBS avec 200 ul de complément B27 en utilisant un tube à centrifuger de 15 mL. Diluer la solution mère bleu Evans (20 mg / ml de PBS) 1: 1000 avec du PBS / B27. </li></ol></li><li> Evans essai de perméabilité bleu <ol><li> Aspirer le milieu du compartiment inférieur suivie par le compartiment supérieurd&#39;un insert de culture cellulaire contenant une monocouche confluente HBMEC. Ajouter 100 ul d&#39;une solution bleu evans à l&#39;insert de culture cellulaire. </li><li> Ajouter 600 ul de PBS / B27 dans le compartiment inférieur et incuber pendant 60 min à 37 ° C / 5% CO 2. Retirez délicatement l&#39;insert de culture cellulaire en utilisant une pince. </li></ol></li><li> Evans mesure bleu <ol><li> Retirer PBS / B27 du compartiment inférieur et le transfert de 100 ul de chacun de deux puits d&#39;une polystyrol noir plaque de 96 puits à fond plat. Insérer la plaque dans un lecteur de plaque Tecan Pro infini M200 et déterminer position z optimal. </li><li> excitation de la mesure de Evans en utilisant des paramètres respectifs bleu (par exemple: excitation: 620 nm, émission: 680 nm, largeur de bande d&#39;excitation: 9 nm, largeur de bande d&#39;émission: 20 nm, l&#39;amélioration de 175x, 25 clignote, le temps d&#39;intégration: 20 us). </li><li> Pour déterminer les fonctions de barrière HBMEC pour comparer les données acquises à une courbe étalon représentant permeation bleu Evans à travers HBMEC à différents points de temps après la semencecellules ING (Figure 1B, à droite). </li></ol></li></ol> 4. Essai de migration <ol><li> Préparation des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). <ol><li> Ajouter 10 ml RPMI dans un tube de centrifugation de 15 ml et ajouter 200 pi supplément B27. Count PBMC et les cellules de centrifugation à 300 xg pendant 5 min. Re-suspendre PBMC à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules / ml de RPMI / B27. </li></ol></li><li> Mise en place du test de migration <ol><li> Aspirer moyen du compartiment inférieur suivie par le compartiment supérieur d&#39;inserts de culture cellulaire contenant des monocouches confluentes HBMEC (figure 1A). Par donneur d&#39; ajouter 100 uL de suspension de PBMC chacun des inserts de culture cellulaire et également à un puits d&#39;une plaque à 24 puits par (contrôle in vitro). </li><li> Ajouter 600 ul de RPMI / B27 dans le compartiment inférieur des inserts de culture cellulaire et de 500 ul de la PBMC du contrôle in vitro et incuber 6 heures à 37 ° C / 5% CO 2. </li&gt; </ol></li><li> La récolte des PBMC migrée <ol><li> Retirez l&#39;insert de culture cellulaire à l&#39;aide des pinces et rincer soigneusement le fond avec 400 ul de PBS sans toucher la membrane. Jeter l&#39;insert de culture cellulaire. </li><li> Ajouter 20 ul Fluorospheres de comptage de débit (environ 1000 perles / ul) au compartiment inférieur de la culture cellulaire insérer ainsi que pour le contrôle in vitro et bien mélanger. Transfer 1 ml de suspension de PBMC résultant de cytométrie en flux tubes. </li></ol></li></ol> 5. cytométrie en flux <ol><li> La préparation des échantillons <ol><li> Centrifugeuse PBMC à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps par addition d&#39;un fluorochrome conjugué d&#39;anticorps à 100 pi de tampon de cytométrie en flux (PBS / 1% BSA / EDTA 2 mM) par échantillon. Pour les résultats présentés ci-dessous 1 ul CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 pl CD56-PC7, 1 pi CD8-A700 et 1 ul CD16-A750 ont été utilisés par échantillon. </li><li> Resuspendre PBMC dans 100 ul de la solution d&#39;anticorps et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter tampon cytométrie de flux 250 uL et centrifuger à 300 g pendant 5 min. </li></ol></li><li> acquisition d&#39;échantillons <ol><li> Re-suspendre PBMC en la quantité requise (varie en fonction du cytomètre de flux utilisé) de cytométrie de flux tampon. </li><li> Acquérir coloré les PBMC en utilisant un cytomètre à écoulement avec un détecteur actif entre 525 et 700 nm de longueur d&#39;onde pour détecter Fluorospheres de comptage de débit (excitation 488 nm, émission 525 à 700 nm). (Les étapes suivantes sont, par exemple, si un flux Gallios cytomètre fonctionnant avec le logiciel Kaluza G est utilisé:. (1) Démarrer l&#39;ordinateur (2) Lorsque le système d&#39;exploitation est entièrement chargé, démarrer le cytomètre à écoulement en appuyant sur le « cytomètre sur bouton » . (3) Chargez le protocole d&#39;acquisition respectif en appuyant sur le bouton « protocole ouvert ». (4) Choisissez le protocole requis et sélectionnez « ouvrir ». (5) en double le protocole pour chaque échantillon en cliquant avec le droitbouton de la souris sur le protocole visible dans le carrousel virtuel et un clic gauche sur le terrain « en double ». (6) d&#39;étiquetage de chaque échantillon dans la liste de l&#39;échantillon. (7) Transférer les échantillons aux positions indiquées sur le carrousel et commencer l&#39;acquisition.) </li></ol></li><li> L&#39;analyse des échantillons <ol><li> Ouvrir flux résultant cytométrie données à l&#39;aide du logiciel respectif. Déterminer le nombre de sous - populations d&#39;intérêt pour transmigré PBMC ainsi que les cellules provenant de puits de contrôle in vitro et de débit comptage Fluorospheres en utilisant le logiciel d&#39;analyse respective. (Un exemple de la stratégie de déclenchement est donnée dans la partie des résultats (Figure 1 C: Pour analyser la transmigration des sous - ensembles de cellules NK, d&#39; abord sélectionner les lymphocytes dans un canal de diffusion latéral (SSC) par rapport au canal de diffusion vers l&#39; avant (FSC) parcelle Lymphocytes sont. puis affichés dans une CD3 contre parcelle CD56 et CD56 + CD3 -. Les cellules NK sont choisies pour distinguer entre les sous - ensembles des cellules NK, les cellules NK sont affichées dansCD56 contre CD16 intrigue et CD56 CD16 lumineux dim / - ainsi que CD56 CD16 + dim cellules NK sont sélectionnées. En outre, comptage de flux Fluorospheres sont choisis parmi un FSC contre SSC terrain et par la suite affichées dans une trame d&#39;un canal avec une émission entre 525 et 700 nm en fonction du temps pour déterminer leur nombre.) </li><li> Pour calculer le nombre total de cellules de chaque échantillon, à normaliser le nombre détecté de cellules en utilisant Fluorospheres de comptage de débit: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Déterminer le pourcentage de cellules ayant migré comme rapport entre les cellules totales et les cellules ayant migré au total dans le contrôle in vitro. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Nous présentons ici une technique pour étudier la transmigration des lymphocytes à travers la barrière sang-cerveau humain. L&#39;analyse in vitro de la migration des lymphocytes au système nerveux central est important d&#39;étudier les processus de base de l&#39; extravasation des lymphocytes, des altérations liées aux maladies potentielles, et de nouvelles approches thérapeutiques. Plusieurs modifications du modèle de barrière hémato-encéphalique sont possibles. Par ...

la migration des lymphocytes du sang dans les tissus est crucial pour la surveillance immunitaire. Une séquence d&#39;interactions moléculaires spécifiques assure le site extravasation spécifique dans l&#39; intestin grêle, peau, ganglions lymphatiques, le système nerveux central (SNC) et d&#39; autres tissus 1. Les modifications de la migration des lymphocytes sont impliqués dans la physiopathologie d&#39;un certain nombre de maladies largement répandus 2. La migration dans le SNC immuno-privilégié est étroitement régulée , et en conséquence des modifications de ce procédé sont impliqués dans les maladies liées au SNC, comme l&#39; encéphalomyélite 3, la neuromyélite optique, accident vasculaire cérébral et la sclérose en plaques (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Il est donc important d&#39;étudier extravasation des lymphocytes pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie et de développer des outils pour une<html> mélioration de la charge de morbidité 8, 9, 10, 11, 12. Les lymphocytes migrent dans le système nerveux central par des voies distinctes. Extravasation à travers veinules post - capillaires dans l&#39;espace sous - arachnoïdien par l&#39; intermédiaire de la barrière de fluide céphalo-sang dans les plexus choroïdes et à travers la barrière sang-cerveau ont été décrits 1, 13, 14, 15. La migration à travers la barrière hémato-encéphalique est réalisée par l&#39;interaction des lymphocytes avec des cellules endotheliales 14. Contrairement aux cellules endotheliales à la périphérie, les cellules endotheliales du système nerveux central expriment de grandes quantités de molécules de jonctions serrées, ce qui limite strictement la quantité de cellules et de protéines capables de traverser la barrière hémato-encéphaliquelass = &quot;xref&quot;&gt; 16. Résultats de l&#39;inflammation dans le desserrage des jonctions serrées et induit l&#39;expression de molécules d&#39;adhésion; Ainsi, l&#39; amélioration de la migration des lymphocytes dans le SNC 1, 17, 18. Extravasation via la barrière hémato-encéphalique est un processus en plusieurs étapes. Lymphocytes attache aux cellules endothéliales et ensuite rouler le long de l&#39;endothélium dans un procédé principalement médiée par les sélectines 1, 15. Par la suite, les interactions entre les chimiokines sécrétées par l&#39;endothélium et les récepteurs de chimiokines respectifs exprimés sur les lymphocytes induisent des changements conformationnels d&#39;intégrines, favorisant ainsi l&#39; adhésion ferme aux cellules endothéliales 1. Enfin, les lymphocytes, soit exploration le long de la barrière endothéliale contre le flux sanguin avant transmigrant dans l&#39;espace périvasculaire, ou bloquer immédiatement et directement transmigrate au niveau du site d&#39;adhérence de la firme 1, 19, 20. Toutes ces étapes de l&#39; extravasation des lymphocytes peuvent être analysés in vitro en utilisant des techniques distinctes 21. La microscopie vidéo time-lapse est utilisé pour étudier la fixation initiale et le laminage 15. Des tests d&#39;adhésion fournissent des informations détaillées sur l&#39; arrestation ferme endothéliale barrières 22. Des dosages de transmigration comme démontré ici permettent l&#39; analyse de la transmigration des cellules immunitaires 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Utilisation de l&#39;humain in vitro modèle de barrière hémato-encéphalique, on pourrait montrer récemment que plus migrla capacité de Atory de CD56 CD16 lumineux dim / - cellules NK par rapport à leur CD56 CD16 + dim homologues est reflété par une prédominance de ce sous - ensemble des cellules NK dans le compartiment 21 intrathécale. Ainsi, notre dispositif expérimental semble être approprié pour simuler la situation in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>without CaCl2 or MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin 1mg/mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 cell culture flask</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBMEC</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pelobiotech</td>
			<td>PB-H-6023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM-b</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth supplement</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>clear, 6.5mm diameter, 3.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50x concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200Pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black flat bottom plate</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>675086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Count Fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7547053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios 10-color flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza 1.5a</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300430</td>
			<td>clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-PC7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A21692</td>
			<td>clone N901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16-A750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66330</td>
			<td>clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300506</td>
			<td>clone RPA-T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-A700</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66332</td>
			<td>clone B9.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

Lymphocyte extravasation dans le système nerveux central (SNC) est essentiel pour la surveillance immunitaire. altérations liés à la maladie de l&#39;extravasation des lymphocytes pourraient entraîner des changements physiopathologiques du système nerveux central. Ainsi, l&#39;enquête sur la migration des lymphocytes dans le système nerveux central est important de comprendre les maladies inflammatoires du système nerveux central et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous présentons ici un modèle in vitro de la barrière sang-cerveau humain pour étudier extravasation des lymphocytes. les cellules endotheliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) sont cultivées confluente sur un téréphtalate de polyéthylène poreux Transwell insérer pour imiter l&#39;endothélium de la barrière hémato-encéphalique. Fonction de barrière est validée par l&#39;immunohistochimie de zonula, des mesures de résistance électrique (TEER) transendothéliale ainsi que l&#39;analyse de permeation bleu Evans. Ce modèle permet d&#39; étudier la diapédèse des sous - ensembles de lymphocytes rares tels que CD56 CD16 lumineux dim / - cellules NK. e plusle minerai, les effets d&#39;autres cellules, des cytokines et des chimiokines, des altérations liées à la maladie, et les schémas thérapeutiques distincts sur la capacité migratoire des lymphocytes peut être étudiée. Enfin, l&#39;impact des stimuli inflammatoires, ainsi que différents régimes de traitement sur la barrière endothéliale peuvent être analysées.

Les résultats représentatifs montrant transmigration des sous - ensembles de cellules NK et de lymphocytes T en utilisant le modèle de barrière sang-cerveau humain (figure 1A) sont représentés. L&#39;intégrité de la monocouche mesures HBMEC a été validé par la coloration de la molécule de jonction étanche ZO-1, transendothéliaux résistance électrique (TEER), et permeation bleu Evans (figure 1B). Suite à 3 - 4 jours de culture HBMEC a exp...

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K vues.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

Vidéo: Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l&#39;analyse des migrations In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Recherche

Immunologie et infection

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Finger-stick Méthode d&#39;échantillonnage de sang pour la détermination des induite par l&#39;exercice apoptose des lymphocytes

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Homme In Vitro</emRépression> comme outil de dépistage pour la reconnaissance d&#39;un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Respect de dosage

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Développement d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de l&#39;interaction de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE avec son récepteur de haute affinité FcsRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture cellulaire

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d&#39;impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...