Cette étude a été soutenue par Max McGee Centre national de recherche pour les jeunes Diabetesat Medical College of Wisconsin et l&#39;enfance Institut de recherche du Wisconsin. Les bailleurs de fonds n&#39;a joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte de données et d&#39;analyse, ou de la préparation du manuscrit.

1. Avant de mettre en place un test de suppression, on a besoin de perles robe tosylactivated avec des anti-CD3 humain (clone UCHT1, 1μg/ml concentration finale) pour la stimulation des cellules et par la suite vérifier si les perles sont efficacement revêtus par la création d&#39;une prolifération in vitro de dosage à l&#39;aide humaine Les cellules T <ol><li> Prenez 1ml de M-450 perles tosylactivated du flacon d&#39;origine, lieu support magnétique et maintenez jusqu&#39;à ce que toutes les perles ont adhéré à la paroi du tube. Retirez le tampon tandis tube est toujours dans le support magnétique. Prenez le tube de support magnétique et ajouter 1ml de buffer1, placer le tube dans support magnétique à nouveau et retirez le tube est alors buffer1 dans le support magnétique; perles remettre en suspension dans 1ml de buffer1 et ajouter 40μl de l&#39;anti-CD3 humain, agiter à 37 ° C pendant 15 minutes, ajouter 0,1% p / v de BSA et continuer l&#39;agitation pour la prochaine 16 heures. </li><li> Laver les billes en buffer2 fois pendant 5 minutes à 2-8 ° C et une fois dans buffer3 pendant 5 minutes à 2-8 ° C en utilisant support magnétique, comme expliqué ci-dessus; retirer le tampon et remettre les billes en 1ml de buffer2; les perles sont 4x10 concentration 8 / ml final et prêt à l&#39;emploi. </li><li> Aliquoter 50000 et 25000 PBMC / puits en triple dans une plaque de 96 puits et ajouter un nombre variable de cellules CD3 billes recouvertes (4x10 8 billes / ml, CD3 1μg/ml, par exemple 1, 2, 3, 4, 5 billes / cellules ) afin de déterminer le nombre optimal de perles par cellule. Après 72 heures de culture, ajouter 1μCi [3 H] thymidine et poursuivre l&#39;incubation à 37 ° C pour les 16 prochaines heures. Récolte des cellules dans la plaque de la récolte Multiscreen (Millipore), ajouter à scintillation liquide et lire comptages par minutes (cpm) / puits à l&#39;aide Top Count NXT (Packard, CT). Utilisez les perles / ratio de cellule lorsque CPMS sont au dessus de 5000 mais inférieur à 15000 pour éviter une stimulation excessive des Treg, qui pourrait perdre la fonction suppressive. Habituellement, le ratio de 3 billes / cellules stimule à la fois intervenants et les cellules Treg dans tous les groupes de sujets testés jusqu&#39;à 1-4. </li></ol> 2. Isolation de PBMC du sang total de donneurs sains ou de leukopacks humaine ou buffy coat (BC) sont généralement prises par des volontaires sains et disponibles gratuitement auprès de centres locaux de transfusion sanguine (figure 1) <ol><li> Diluer le BC (~ 50 ml) 01h06 avec du PBS (ajouter 250ml). Maintenant, il ya 300ml volume total. Lentement couche de 25ml de BC diluée sur le dessus de 15ml Ficoll-Paque PLUS ajoutée à 50ml tubes Falcon, sans perturber les couches. Centrifuger à 800xg (1400rpm dans une centrifugeuse Sorvall avec godet oscillant du rotor SH-3000) pendant 30 minutes à 4 ° C, avec des freins éteint. </li><li> Recueillir soigneusement la couche PBMC (phase intermédiaire) et le transférer à une nouvelle tubes Falcon 50 ml. Lavez PBMC par le remplissage des tubes jusqu&#39;à 50 ml avec du DPBS. Recueillir 2 culots de cellules dans un tube. Centrifuger à 400xg pendant 10 min à 4 ° C. Répéter l&#39;étape de lavage à deux reprises, chaque fois que la combinaison de 2 culots de cellules dans un tube unique. Mélanger tous les culots cellulaires dans un seul tube 50ml. </li><li> Comptez PBMC en utilisant le test exclusion du bleu trypan. Faire une dilution 1:10 dans bleu Trypan en ajoutant 20 pi de PBMC à 180μl de bleu de trypan tache. Mélangez bien et de prendre 20 pi à compter en hématimètre immédiatement. Comptez le nombre de toutes les cellules non colorées et seulement teinté bleu situé à deux pâtés de maisons carrés contenant chacun 16 petits carrés. Prendre la moyenne des deux nombres et la multiplier par 10. Divisez ce nombre par 100 pour obtenir le nombre de PBMC / ml. Pourcentage de cellules viables de calculer que [1 - (nombre de cellules bleues / nombre de cellules totales) x100]. Procéder, si la viabilité est ≥ 95%. </li></ol> 3. MACS pré-tri des cellules T CD4 <ol><li> Avant de procéder, le transfert de 1ml de PBMC dans un nouveau tube, ajouter 4ml de médias pour la préparation des cellules pour l&#39;irradiation avec des 5000rad-ci seront cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC). </li><li> Centrifuger le reste des cellules à 250xg dans PBS/2mM BSA tampon EDTA/0.5% pour 10min à 4 ° C. Décanter le surnageant des cellules, et remettre en suspension dans 4 ml de tampon BSA PBS/2mM EDTA/0.5%. </li><li> Ajouter 200 ul de microbilles MACS anti-CD4 et incuber à 4 ° C pendant 20 minutes. </li><li> Lavez en ajoutant 40ml de tampon BSA PBS/2mM EDTA/0.5% et centrifuger à 250xg pendant 10 minutes à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension dans 8 ml de dégazée, la température ambiante PBS/2mM tampon EDTA/0.5% de BSA. </li><li> Filtre-séparée de la suspension cellulaire à l&#39;aide de pré-séparation des filtres avant de les charger sur une colonne LS. </li><li> Fractionner la suspension cellulaire et 4ml couche de chaque colonne LS plus calibré (avec 3ml de tampon BSA deggassed PBS/2mM EDTA/0.5%). Colonne de LS est fixé dans le séparateur MidiMACS. Avant la suspension cellulaire s&#39;épuise, soit ré-exécuter accréditives ou d&#39;ajouter 3ml de la température ambiante deggassed PBS/2mM tampon EDTA/0.5% de BSA et de laisser le tampon traversent. Ajoutez plus de mémoire tampon jusqu&#39;à ce qu&#39;il ressorte clairement. </li><li> Pipette 5ml de tampon deggassed sur la colonne LS, enlever la colonne LS à partir du séparateur MidiMACS et le placer dans un nouveau tube de prélèvement stérile 15ml laissant courir ~ 1.0ml travers. Remettre le piston dans la colonne et poussez lentement le reste de lale volume de sortie. </li><li> Faites de même avec les deux colonnes LS et combiner les deux fractions de CD4 +. Ajoutez jusqu&#39;à 50ml cellules PBS et compter. Rendement attendu est à 5x10 8 cellules. Centrifuger à 400xg pendant 10 minutes et remettre les cellules bien dans 2ml de tampon BSA PBS/2mM EDTA/0.5%. </li></ol> 4. Fluorescent Activated tri cellulaire (FACS) isolement (figure 2) <ol><li> Faire un cocktail d&#39;anticorps dirigés contre des marqueurs CD pour les marqueurs suivants surface cellulaire (garder l&#39;abri de la lumière): 20 pl de l&#39;anti-CD8 humain-FITC (clone RPA-T8), 20 pl de l&#39;anti-CD14 humain-FITC (clone M5E2; LPS récepteur), 20 pl de l&#39;anti-CD32-FITC humain (clone FLI8.26; FcyR type II) et 6 pl d&#39;anti-humain CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chaîne) et, subsidiairement, ajouter 40μl de lutte contre -CD4 humain APCCy7 (clone RPA-T4). </li><li> Prenez 5uL de la suspension de cellules et de 2ml tache avec 2μl de cocktail aux taches, ce qui est un tube pour déterminer le seuil (fluorochrome Minus One-FMO) 5. </li><li> Ajouter 50 ul d&#39;anti-humain CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) au cocktail de tache, et ajouter le cocktail à la suspension de cellules et incuber à 4 ° C 30 minutes. Laver les cellules dans du tampon PBS, centrifuger à 400xg pendant 10 minutes et remettre les cellules à une concentration cellulaire de 10 7 / ml. </li><li> Préparer cellules non colorées et les cellules ou des perles colorées par simple fluorochrome pour l&#39;utiliser comme commande de compensation pour le tri cellulaire sur FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ). </li><li> Acquérir des cellules dans le tube de la FMO qui permettra à l&#39;utilisateur de fixer le seuil pour le tri de cellules CD25 + T (figure 2a). Régler une porte autour FITC cellules négatives pour exclure FITC cellules positives comprenant les monocytes, les macrophages et les lymphocytes CD4 + d&#39;autres non-cellules T (Figure 2b). </li><li> Dans une parcelle séparée, dessiner pour les portes-CD25, et CD25low CD25high cellules T-Tregs (top 1% des cellules exprimant le plus grand nombre de CD25) (figure 2c). Sous-ensembles de cellules montrent typiquement une pureté élevée (Figure 2D, 2E et 2F). </li><li> Centrifuger les tubes de prélèvement de cellules au 400xg pendant 10 minutes et les garder sur la glace jusqu&#39;à ce plaquage. </li></ol> 5. Mettre en place des cultures de cellules dans la plaque de 96 puits (schéma ci-joint sous Table1) dans 200μl/well <ol><li> 50 pl aliquote de billes recouvertes CD3 (1 pg / ml) calculé à 3 billes / cellules intervenant dans un puits, remis en suspension dans les médias avec 10% de sérum humain AB en U-96 puits à fond des assiettes. (Par exemple, pour rendre les médias 2ml avec CD3-couché, prenez 7.5μl du stock de billes recouvertes CD3-finale de concentration 4x10 8 / ml et diluer dans 2 ml de médias; tous les 50 pl contiendra 75000 beads-3beads/cell). </li><li> Diluer APC irradiées à 5x10 concentration cellulaire 5 / ml et ajouter 50 pl (contiendra 2,5 x 10 4 cellules) dans chaque puits avec une stimulation précédemment ajoutés, y compris les puits étiquetés comme «Tregs seulement&quot;, &quot;seul APC» et «médias seulement&quot; dans le tableau 1. </li><li> Ajouter 2,5 x 10 4 / ainsi CD4CD25 ou CD4CD25low cellules T en triple suivant la conception dans le tableau 1. </li><li> Ajouter Tregs au co-cultures (ligne B, tableau 1) dans le rapport 01:10 (2500 cellules Treg) et à des puits étiquetés comme «Tregs seulement&quot; et incuber la plaque à 37 ° C en CO 2 incubateur avec 5% de CO 2 en humidité saturée pendant 72 heures. </li><li> Pulse puits avec 1μCi [3 H] thymidine et continuent d&#39;incubation à 37 ° C pour les prochaines 16 heures. </li></ol> 6. La récolte et le comptage <ol><li> Récolte des cellules sur la plaque de récolte multivision utilisant Packard Filtermate abatteuse ou un système alternatif. </li><li> Ajouter à scintillation liquide (Microscint 20), couvrir la récolte assiette avec couvercle en plastique transparent en préparation pour l&#39;étape finale. </li><li> Lire comptes par minutes (cpm) / puits à l&#39;aide Top Count NXT (Packard, CT) ou un système alternatif. </li></ol> 7. Pourcentage de calcul de la répression <ol><li> Comme les cellules étaient cultivées en triple, la moyenne est calculée pour chaque condition. Si le coefficient de variation est&gt; 30%, la valeur aberrante est éliminée et que la CMP à partir de deux puits sont en moyenne. Pourcentage de suppression est obtenue en calculant [(sc) / s] x 100%, où s = cpm en culture simple et c = cpm en co-culture. </li><li> Comme naïfs (CD25-) et in vivo activé (CD25low) lymphocytes T effecteurs sont plaquées comme des cellules T intervenant, la différence dans la capacité des Tregs pour supprimer chacune de ces sous-ensembles est capturé et utilisé comme un indicateur pronostique fonctionnelle potentielle fondée sur la prémisse que les cellules activées sont plus difficiles à supprimer. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: Une grande variabilité dans les méthodes utilisées et les résultats issus de test in vitro avec la suppression humaine nous a incité à effectuer une étude approfondie des conditions influençant le dosage 1. Nous avons développé un test qui teste pas seulement fonction de Treg, mais aussi leur pureté, considérant le faible ratio entre les Tregs: Teffs (1:10), que nous avons déterminé plus tôt 6. En outre, les Tregs diffèrent èmela capacité de l&#39;EIR succès suppriment naïfs et dans les cellules T activées in vivo, même chez des sujets sains, comme le montre la figure 3 et dans nos études précédentes 2,4, ce qui devient plus importante si l&#39;équilibre immunitaire est affaibli, comme chez les sujets à risque de développer le DT1 . Le test a très bien fonctionné dans l&#39;étude où nous avons comparé la fonction suppressive des ressources naturelles (nTregs), inductible (iTregs) et dans nTregs élargi in vitro, nous permettant de comparer leurs fonctions entre le contrôle sain, d&#39;apparition récente (RO) DT1 et de longue date (LS ) sujets DT1. Nous avons conclu que RO sujets DT1 avaient une meilleure capacité de générer à la fois fonctionnelle et iTregs nTregs élargi par rapport à des sujets de contrôle LS DT1 et sain 7. Ainsi, ce test peut être utilisé comme un excellent outil dans la reconnaissance des deux un état précoce et tardive de déséquilibre immunitaire. Représentation schématique du schéma 1 les étapes impliquées dans la répression dans le dosage in vitro <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Étapes de l&#39;analyse de suppression in vitro avec des photographies présentées <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Gating stratégie en isolement cellulaire par FACS. a) CD25 + seuil a été ajusté en fonction de Fluorochrome Minus One (FMO), b) les cellules ont été fermée que le FITC-négatif, c) FITC négative cellules ont ensuite été fermé et recueillies dans le CD + CD25-, CD25high CD + CD25low et CD + ( Tregs) illustré avec des pourcentages, d) FACS triés Tregs après le tri, e) FACS triés CD + CD25low après le tri, et f) FACS CD4 + CD25 triés cellules T après le tri <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Les résultats représentatifs de sujets sains a) Les résultats représentatifs de coups par minute (cpm) de sujets sains présenté comme unique pour toutes les cultures cellulaires sous-ensembles concernés (naïve-CD25-, in vivo activées CD25low, cellules présentatrices d&#39;antigène-APC et lymphocytes T régulateurs-Treg) ainsi que des co-cultures de cellules T intervenant (CD25-ou CD25low) et Tregs. b) Pourcentage de la suppression de chaque CD25 et CD25low répondeur cellules T autologues par Tregs est présenté pour le contrôle des sujets sains (n = 4). Répression a été calculé comme [(sc) / s] x 100%, où s = cpm en culture simple et c = cpm en co-culture. Bien que légère différence dans la capacité des Treg à réprimer répondeur cellules T a été remarqué, il n&#39;était pas significative (test t apparié p = 0,08). C) Présenté sont cpm de sujets à risque pour chaque culture unique, y compris CD25 et CD25low de répondeur Les cellules T ainsi que APC et Tregs, et co-cultures où chaque sous-ensemble de lymphocytes T intervenant est ensemencé avec Tregs (CD25-/Tregs et CD25low/Tregs). d) Pourcentage de la suppression de chaque CD25-et les cellules T CD25low répondeur d&#39;une autogreffe Tregs est présenté pour les sujets à risque (n = 4). La différence dans la capacité des Treg à réprimer CD25 versus CD25low répondeur cellules T a été significative (test t apparié p = 0,04). Tableau 1. Schéma de mise en place dans le dosage de suppression in vitro <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1-3 </td><td> 4-6 </td><td> 7-9 </td><td> 10-12 </td></tr><tr><td> Une </td><td> CD4CD25- </td><td> CD4CD25low </td><td> médias seulement </td><td> médias seulement </td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25-/ Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> Tregs seule </td><td> Seul APC </td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

Comme la seule caractéristique unique de Tregs, fonction suppressive doit être testé de façon fiable et uniforme entre les sujets à différentes phases de développement de la maladie dans les mêmes et entre les différentes études. Nous vous proposons des détails sur le test de suppression développés dans notre laboratoire que notre contribution à la standardisation de ce dosage. Dans notre étude d&#39;optimisation approfondie, nous avons déterminé que la stimulation des cellules T avec des anti-CD3 humai...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif ou d&#39;un instrument </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> Amersham Pharmacia Biotech </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS-1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Bleu Trypan </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 microbilles </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> Pré-filtres de séparation </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> Colonne de LS </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD4 humain APCCy7 (clone RPA-T4) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD25-PE humains (clone M-A251; IL-2Rα) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD8 humain-FITC (clone RPA-T8) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD14 humain-FITC (clone M5E2; récepteurs LPS) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD32-FITC humain (clone FLI8.26; FcyR type II) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humain CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chaîne) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M-450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 humain </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> Homemade </td><td></td><td> 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH 7,6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> Homemade </td><td></td><td> PBS/2mM EDTA / BSA 0,1% pH 7,4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> Homemade </td><td></td><td> 0,2% de BSA Tris/0.1 pH 8,5 </td></tr><tr><td> RPMI complet des médias </td><td> Homemade </td><td></td><td> Du milieu RPMI 1640 2 mM L-glutamine 100 mM HEPES 5 U / pg / ml pénicilline / strept 0,5 mM pyruvate de sodium </td></tr><tr><td> [3 H] thymidine </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> humains mis en commun sérum AB </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de la récolte Multiscreen </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

human in vitro suppression as screening tool for the recognition of an early state of immune imbalance

Les cellules T régulatrices (Treg) sont des médiateurs essentiels de la tolérance immunitaire aux antigènes du soi. De plus, ils sont des régulateurs essentiels de la réponse immunitaire après une infection. Malgré les efforts pour identifier les marqueurs de surface unique sur Tregs, la seule caractéristique unique est leur capacité à supprimer la prolifération et la fonction des lymphocytes T effecteurs. Alors qu&#39;il est clair que seuls les essais in vitro peuvent être utilisés pour évaluer la fonction Treg humains, cela devient problématique lorsque l&#39;évaluation des résultats à partir des études transversales où les cellules saines et les cellules isolées de sujets atteints de maladies auto-immunes (comme diabète de type 1-DT1) doivent être comparés. Il ya une grande variabilité entre les laboratoires dans le nombre et le type de cellules T intervenant, la nature et la force de stimulation, Treg: ratios répondeur et le nombre et le type de cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC) utilisés en médecine humaine dans les tests in vitro de suppression. Cette variabilité rend la comparaison entre les études mesurant la fonction Treg difficile. Le champ Treg a besoin d&#39;un test de suppression standardisé qui va bien travailler avec des sujets sains et ceux atteints de maladies auto-immunes. Nous avons élaboré une épreuve suppression in vitro qui montre que très peu la variabilité intra-essai dans la stimulation des cellules T isolées chez des volontaires sains par rapport aux sujets avec une destruction auto-immune sous-jacente du pancréas β-cellules. L&#39;objectif principal de cette pièce est de décrire un essai in vitro de suppression humaine qui permet la comparaison entre les groupes de sujets différents. De plus, ce test a le potentiel pour délimiter une petite perte de fonction et d&#39;anticiper nTreg d&#39;autres pertes dans le futur, donc sujets identification qui pourraient bénéficier d&#39;une thérapie immunomodulatrice préventives 1. Ci-dessous, nous fournir une description approfondie des différentes étapes de cette procédure. Nous espérons contribuer à la standardisation de l&#39;analyse de suppression in vitro utilisé pour mesurer la fonction Treg. En outre, nous offrons ce test comme outil de reconnaître un état de déséquilibre début immunitaire et un biomarqueur potentiel fonctionnel pour DT1.

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs sont suppresseurs puissants du système immunitaire. Il ya un manque de marqueurs de surface unique de les définir, par conséquent, les définitions des Treg sont principalement fonctionnelle. Nous décrivons ici une optimisation<em&gt; In vitro</em&gt; Test capable d&#39;identifier déséquilibre immunitaire chez les sujets à risque de développer le DT1.

Homme In Vitro</emRépression> comme outil de dépistage pour la reconnaissance d&#39;un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

human-vitro-suppression-as-screening-tool-for-recognition-an-early

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

14.4K vues.  Medical College of Wisconsin. Tregs sont suppresseurs puissants du système immunitaire. Il ya un manque de marqueurs de surface unique de les définir, par conséquent, les définitions des Treg sont principalement fonctionnelle. Nous décrivons ici une optimisation In vitro Test capable d'identifier déséquilibre immunitaire chez les sujets à risque de développer le DT1.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d&#39;Innate Immune Health chez le poisson zèbre

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Respect de dosage

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de mesure de réponses immunitaires contre le paludisme dans le contexte du VIH co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

Détermination Suppression du système immunitaire contre la protection du système nerveux central pour les interventions pharmacologiques dans démyélinisation autoimmune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analyse de 18FDG TEP/CT d’imagerie comme un outil pour étudier Mycobacterium tuberculosis Infection et traitement chez les Primates Non humains

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Homme In Vitro comme outil de dépistage pour la reconnaissance d'un Etat précoce de déséquilibre immunitaire