Écrans de génétiques sont des outils importants pour l’identification des gènes et les mutations responsables de phénotypes d’intérêt et pour comprendre comment les gènes fonctionnent dans les processus biologiques. Les écrans sont effectués dans divers systèmes de modèles, y compris les mouches, les vers, les plantes et culture de cellules et ont conduit à la découverte de nouvelles voies cellulaires et des cibles potentielles de médicaments pour les maladies humaines.
Cette vidéo sera donnent un aperçu des différents types d’écrans génétiques, expliquer deux protocoles généraux pour les écrans dans les vers nématodes et montrer que quelques écrans moyens sont appliquées aujourd'hui dans les laboratoires.
Tout d’abord, nous allons jeter un oeil à quels écrans génétiques sont et ce que nous pouvons apprendre d’eux.
Écrans génétiques sont fondés sur la génétique soit avance ou arrière. Dans un avant ou un dépistage génétique « classique », les mutations sont générées de façon aléatoire dans l’ADN d’un organisme à l’aide de rayonnements ou des produits chimiques reconnus comme agents mutagènes. Bases supplémentaires peuvent également être insérés à ADN en utilisant, par exemple, des séquences appelés transposons, qui peuvent s’intégrer à des positions différentes au sein du génome et perturbent la fonction des gènes dans lequel ils s’insèrent. Ces types d’insertions sont souvent couplés avec des journalistes fluorescents pour permettre une détection directe des organismes mutés. Quand un mutant s’avère présentent un phénotype d’intérêt, le gène inconnu qui a été muté peut puis être mappé à un chromosome et séquencé.
L’approche opposée au dépistage est un écran de génétique inverse, où chercheurs perturber l’expression de nombreux gènes candidats et ensuite chercher des phénotypes mutants résultant de ces manipulations.
En plus de « perte de fonction » des mutations qui perturbent l’activité d’un gène, écrans génétiques peuvent aussi se fonder sur « gain de fonction » mutations, qui entraînent un gène expression ou fonctionnalité d’augmenter. Ceci peut être réalisé en insérant au hasard des éléments de régulation génique dans le génome, qui conduirait la surexpression d’un gène qui insère l’élément en amont de.
Par ailleurs, dans une méthode appelée « contrôle de l’expression », chercheurs font utiliser des bibliothèques des plasmides contenant les séquences codant pour des protéines de différents gènes et les introduire dans les cellules où les gènes seront fortement exprimés. Phénotypes qui en résulte permet alors de comprendre la fonction du gène.
Pour découvrir plus d’informations sur un gène connu ou une mutation, écrans de modificateur peuvent être utilisés. Un écran de suppresseur commence par un mutant caractérisé et identifie d’autres mutations qui rendent le phénotype mutant moins sévère. Une mutation du suppresseur trouvée du même gène que la mutation originale est dénommée « intragénique, » qu’une mutation du suppresseur située dans un gène différent est jugée « extragénique. »
En revanche, écrans enhancer identifient les mutations supplémentaires qui augmentent la sévérité d’un phénotype mutant. Ceux-ci peuvent être utiles pour déterminer les gènes qui sont redondantes ou peuvent interagir sur le plan fonctionnel. Si la combinaison de deux ou plusieurs mutations entraîne croissance sévèrement altérée ou même la mort, la condition est appelée « maladie synthétique ou la létalité ». Un écran pour les mutations de malades ou létales synthétiques révèle les gènes dont le fonctionnement redondant, mais essentiel, voies biologiques. Ceci est particulièrement utile, par exemple, dans l’identification de plusieurs produits de gènes qui peuvent être simultanément ciblés avec des médicaments pour tuer les cellules cancéreuses.
Maintenant que vous comprenez certaines stratégies de dépistage génétique commun, regardons un protocole général d’un écran vers l’avant dans une Organization modèle populaire, le ver nématode.
Dans cet exemple, mutagenèse chimique s’effectuera avec méthanesulfonate d’éthyle ou EMS, qui fonctionne en modifiant chimiquement les nucléotides de la guanine, amenant à la paire de façon inappropriée avec la thymine dans les tours suivants de la réplication de l’ADN. Parce que EMS est un mutagène et cancérogène possible, il doit être traité uniquement lorsque vous portez une double couche de gants, et travaux doit être menés dans une hotte aspirante.
Pour commencer, un grand nombre d’au dernier stade larvaire est sélectionné, lavé et recueilli. EMS est ensuite ajouté pour les vers et les vers sont incubés pendant plusieurs heures à provoquer des mutations. Après mutagénèse, EMS devrait être supprimé vers et inactivé par l’hydroxyde de sodium. Les vers sont ensuite lavés plusieurs fois dans le milieu et ensemencés sur la gélose.
Ensuite, saine vers sont transférés aux nouvelles plaques fraîchement ensemencées par des bactéries comme source de nourriture et autorisés à reproduire. Deuxième génération progéniture peut visuellement projetée pour les phénotypes mutants, tels que les défauts de la locomotives.
Maintenant, revenons à travers un protocole pour un dépistage génétique inverse de nématodes.
Une approche commune à la réalisation des écrans inverses à worms est de nourrir les animaux, une bibliothèque de bactéries exprimant ARN double-brin, un par la souche bactérienne, qui va frapper vers le bas de l’expression d’un gène candidat chaque dans les vers. Ces bibliothèques sont souvent disponibles dans le commerce et peuvent être sous – cultivées pour utilisation dans les écrans.
Pour commencer, seul colonies de bactéries contenant des clones de bibliothèque sont cultivées, et production d’ARN double brin est induite. Cultures sont ensuite repérées sur des puits séparés d’une plaque avec le milieu de croissance nématodes et laisse sécher sous une hotte stérile.
Ensuite, vers sont plaqués sur les bactéries et autorisés à se nourrir dans une chambre humidifiée pour trois ou quatre jours. Phénotypes mutants peuvent rapidement être observées, soit dans les vers originaux placés sur les plaques de l’alimentation, soit dans la descendance de première génération.
Maintenant que vous avez vu comment avancer et écrans de génétiques inverses sont effectués, nous allons discuter de certaines de leurs applications actuelles.
Certains écrans génétiques sont utilisés pour aider les scientifiques à identifier les protéines qui interagissent physiquement ou fonction dans la même voie moléculaire. Dans cette expérience, les scientifiques a conçu un haut débit microscopie d’écran pour découvrir de nouveaux récepteurs transmembranaires qui activent une molécule de signalisation particulière. En surexprimant une variété de gènes dans les cellules humaines embryonnaires de rein contenant le fluorescent étiqueté signalisation protéines, qu'ils ont pu surveiller les récepteurs qui affectent la localisation intracellulaire de la protéine.
Une autre application du dépistage génétique est la caractérisation des interactions gène-médicament. Ici, une bibliothèque de mutant de levure a été générée à l’aide de mutagénèse aléatoire à grande échelle avec insertions de transposon. Ensuite, chaque souche mutante a été cultivé en présence d’un médicament. La croissance de chaque souche a été quantifiée par PCR suivie de microarrays ou séquençage analyse afin de déterminer lequel des mutants, comparée aux sujets témoins unmutated, était sensible au traitement médicamenteux.
Enfin, les écrans peuvent servir à comprendre les gènes et les réseaux moléculaires perturbées dans la maladie humaine. Chercheurs dans cette expérience des cultures de neurones en présence de virus RNA-encodage à coup de masse expression de nombreux gènes cibles différents. Analyse automatisée des cellules immunocolorées servait alors de révéler les gènes qui influent sur les propriétés physiques des neurones, tels que la croissance des neurites. Cette approche a permis d’identifier les gènes impliqués dans les maladies neurodégénératives.
Vous avez regardé juste video sur écrans génétiques de JoVE — une technique puissante pour découvrir les gènes impliqués dans les processus biologiques fondamentaux. Dans cette vidéo, nous avons examiné quelques grands types d’écrans génétiques, protocoles généraux pour effectuer les deux vers l’avant et inverser les écrans et discute comment ces méthodes sont appliquées dans les laboratoires aujourd'hui. Merci de regarder !
