Cycle cellulaire désigne l’ensemble des processus cellulaires et biochimiques qui se produisent au sein d’une cellule conduisant à sa division. Une cellule passe par différentes étapes du cycle, et le temps nécessaire pour achever ce processus est presque constant pour un type de cellule. Tout écart par rapport à cette durée est révélatrice de la division cellulaire anormale. Analyse du cycle cellulaire devient donc un outil très utile pour les biologistes intéressés à étudier les mécanismes de division cellulaire, ce qui permettra en bout de ligne dans le traitement des patients atteints de maladies comme le cancer, dans lequel le cycle cellulaire est perturbé.

Cette vidéo va discuter le principe et un protocole généralisé de l’analyse du cycle cellulaire. Enfin, nous allons montrer que quelques applications de cette méthode couramment utilisée.

Nous allons apprendre quelle analyse du cycle cellulaire, et comment fonctionne ce test.

Essentiellement, analyse de cycle de cellules d’une population mixte nous dit combien de cellules est dans chacune des différentes phases. Cela se fait couramment en évaluant le contenu en ADN de la cellule. Vous pouvez penser : pourquoi la teneur en ADN ? Pour comprendre cela, examinons brièvement ce qui se passe à l’ADN chromosomique fur une cellule au cours du cycle.

Au cours de la phase G1, contenu en ADN dans une cellule ne change pas. Par le biais de la phase S, réplication de l’ADN se déroule, et la fin de cette phase l’ADN contenu est doublée. En phase G2, les cellules de vérifier qu’il n’y a pas d’erreurs dans la duplication de l’ADN et enfin, à la fin de l’étape M — cet ADN obtient également divisé en deux cellules filles. Par conséquent, marquage ADN peut aider un scientifique déterminer le stade du cycle cellulaire.

Une considération importante pour cet étiquetage est le choix du colorant de liaison de l’ADN. Bromodéoxyuridine ou BrdU, est un acide nucléique analogique et structurellement imite la thymidine. Cela permet de BrdU d’incorporer dans le brin de plus en plus au cours de la réplication de l’ADN. Par conséquent, ce colorant étiquettes des cellules en phase S seulement. Après incorporation de BrdU, les brins d’ADN sont séparés et BrdU est détecté à l’aide d’anticorps fluorescent étiquetés.

Autres composés, tels que l’iodure de propidium ou PI, qui est intrinsèquement fluorescente, intercaler entre doubles brin d’acides nucléiques, et par conséquent les cellules tache à tous les stades. Toutefois, la quantité de PI coloration est proportionnelle à la quantité d’ADN.

Bien que le choix d’une tache dépend de l’expérience à portée de main, les chercheurs utilisent souvent des méthodes de coloration doubles. Molécules comme PI qui lient proportionnellement à toutes les cellules peut facilement distinguer les cellules G1 G2 ou cellules en phase M. Toutefois, les cellules en phase S sont toujours en transition. Par conséquent, l’addition de molécules comme BrdU que seulement les cellules en phase S d’étiquette augmentent la spécificité de la détection de phase de cycle cellulaire. Enfin, les cellules sont analysés utilisant l’écoulement cytometry d’énumérer des cellules dans les étapes du cycle de cellules différentes.

Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent la coloration du cycle cellulaire, nous allons discuter une procédure utilisant BrdU et PI.

Mettre en place les récipients de culture cellulaire : un pour l’expérience et trois autres comme témoins. Environ 60 % confluency, BrdU dissous dans les milieux de culture est ajouté aux cellules vivantes, suivies de l’incubation. À ce stade, le BrdU est incorporée dans la réplication de l’ADN.

Après incubation, les cellules sont centrifugés et remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Ensuite, les cellules sont fixées en ajoutant suspension cellulaire goutte glacée d’éthanol 70 % tout en produisant des tourbillons doucement. Cela cesse la division cellulaire et prévient l’agglutination.

Les cellules fixes sont à nouveau centrifugés et remis en suspension dans du PBS. Ensuite, une solution concentrée d’acide contenant un détergent comme le Triton-X, est ajoutée aux cellules goutte à goutte. Le détergent permeabilizes les cellules pour permettre l’entrée des composés membrane imperméable et acide diminue le pH et dénature les ADN, exposant BrdU. Les cellules sont ensuite centrifugés, surnageant est ignoré et le culot est remis en suspension dans une solution alcaline pour rétablir le pH.

Enfin, les cellules sont lavées avec du PBS et incubées avec l’anticorps BrdU conjugué à une balise fluorescente à température ambiante. Après cette étape, les échantillons devraient être protégés de la lumière pour éviter le photoblanchiment.

Lorsque la double coloration, les cellules sont incubées avec PI et RNase. RNase est nécessaire d’enlever les ARN-ARN ou ARN-ADN doubles brins, qui également se lient à la PI et peuvent donner des résultats faussement positifs. Les cellules sont ensuite transmis à travers un tamis cellulaire pour faire suspension monocellulaire, ce qui est nécessaire pour l’analyse en cytométrie en flux.

Maintenant que vous avez appris le protocole pour la souillure, passons en revue comment analyser les données obtenues.

Brièvement, en écoulement cytometry qu'un faisceau laser éclaire un jet étroit de suspension cellulaire unique et les émissions aux longueurs d’onde particulières de ces colorants dans chaque cellule est détecté comme un événement unique sur un diagramme de dispersion.

Ici, le nuage de PI colorées cellules spectacle deux groupes distincts, avec presque deux fois le montant de PI que l’autre. Après l’optimisation du détecteur PI, ces ensembles apparaissent comme deux pics dans une analyse de l’histogramme. Le pic à une plus grande intensité de PI représente les cellules G2/M et celle de plus faible intensité cellules G1. Superficies de ces sommets représentent le nombre de cellules dans les phases correspondantes.

De même, les événements de BrdU-FITC peuvent être affichées dans une analyse histogramme sur une échelle logarithmique. Ce graphique montre que BrdU positive cellules sont nettement plus lumineux que les cellules incolores et depuis qu’une fraction de la population sont dans la phase S, une plus grande crête de BrdU cellules incolores sont visibles.

Le diagramme de dispersion des cellules colorées avec BrdU et PI peut être affiché avec la PI sur l’axe des x linéaire et BrdU sur l’axe y logarithmique, et cela montre un modèle de fer à cheval va de G1, S, G2. La proportion de cellules dans les zones fermées peut être déterminée et affichée sur un graphique en barres.

Maintenant que nous sommes passés à travers le protocole de base pour l’analyse du cycle cellulaire, nous allons étudier comment elle peut être utilisée dans différentes configurations expérimentales.

A. en combinant des manipulations génétiques avec l’analyse de cycle de cellules, les scientifiques étudient les rôles des protéines spécifiques dans la progression du cycle cellulaire. Dans cette étude, les scientifiques surexprimé une protéine appelée p27 dans les fibroblastes embryonnaires de souris. Les résultats démontrent que la surexpression conduit à abaisser le nombre de cellules en phase S, indiquant que cette protéine joue un rôle essentiel dans la régulation du cycle cellulaire.

Selon l’analyse du cycle cellulaire, scientifiques peuvent comparer cinétique de progression. Ici, la cinétique de progression entre les deux lignées cellulaires de cancer colorectal et une lignée de cellules cancéreuses du sein ont été comparés. Les résultats ont démontré que les cellules cancéreuses du sein gravi cycle cellulaire à un rythme plus lent par rapport aux lignées cellulaires de cancer colorectal, étant donné le pourcentage plus élevé de cellules cancéreuses du sein dans le G1 au fil du temps.

Enfin, pour in vivo l’analyse du cycle cellulaire, BrdU peut être injecté chez les rongeurs et la population de cellules cibles peut être isolée pour l’analyse du cycle cellulaire. Dans cette étude, les cellules souches hématopoïétiques ou injection autorenouveler de BrdU souris ont été isolés pour analyse en cytométrie en flux. Les données recueillies ont révélé la distribution des CSH parmi les étapes du cycle de cellules différentes avec prédominance en phase G1 et S.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur l’analyse du cycle cellulaire. Nous avons examiné les principes qui sous-tendent ce processus, détaillée un protocole étape par étape et a examiné comment ce type d’analyse est utilisé dans différents contextes expérimentaux. Comme toujours, Merci pour regarder !