« Chromatographie » se réfère à un large éventail de méthodes utilisées pour isoler un composant d’un mélange complexe, une étape essentielle avant d’une biomolécule propriétés et activités peuvent être déterminées. Chaque technique chromatographique a un mécanisme différent pour la séparation, selon la matrice de l’échantillon et le composé cible. Cette vidéo mettra l’accent sur les principes et le fonctionnement des deux méthodes communes de biochimie : chromatographie d’exclusion stérique et affinité.

Chromatographie d’exclusion stérique ou SEC repose sur la taille des composés dans l’échantillon. Une phase mobile contenant l’échantillon est ajoutée à une colonne avec un matériau poreux : la phase stationnaire. Les molécules de l’échantillon tombent dans 1 des 3 catégories.

Trop grand pour entrer dans les pores des molécules de voyage la plus courte distance par le biais de la colonne. Toutes les espèces dont le poids moléculaire au-dessus de cette « limite d’exclusion » quittera la colonne en même temps. Assez petit pour entrer librement dans les pores des molécules seront conservés le plus longtemps et sortira la colonne ensemble. Le poids moléculaire permettant l’entrée de pore complet est la « limite de perméation ».

Seulement des molécules entre ces limites seront séparés entre eux, car ils dépensent des quantités variables de temps diffusant dans et hors des pores. Molécules plus petites sont conservés plus longtemps sur la colonne car ils passent plus de temps dans la phase stationnaire, tandis que les plus grosses molécules dans ces limites quitter plus tôt.

Des poids moléculaires dans 1 à 2 ordres de grandeur se situent dans ces limites. Les colonnes sont choisis avec cela à l’esprit, ou plusieurs colonnes peuvent être utilisées en série s’il existe un large éventail de composés désirés.

Maintenant que vous avez vu la théorie de la SEC, regardons comment elle est réalisée.

Pour commencer la procédure de la SEC, la colonne doit être équilibrée avec l’eau désionisée et tampon de chromatographie. Une fois préparée, tampon contenant l’échantillon est injecté sur la colonne. La mémoire tampon est ensuite poussé par un débit faible. Un détecteur surveille ce qui sort de la colonne pour déterminer la présence de l’analyte désirée. Grosses molécules de poids moléculaire supérieur à la limite d’exclusion sortie la colonne en même temps. Petites fractions de la colonne sont collectées dans des tubes. Chaque fraction est testée pour la qualité de la molécule cible par électrophorèse sur gel ou d’autres techniques d’analyse.

Maintenant nous allons jeter un oeil à la chromatographie d’affinité ou AC, l’un des moyens plus efficaces pour purifier les protéines. Nombreuses biomolécules lient sélectivement à certains biens de ligands-a qui AC utilise en adhérant à un ligand spécifique à la cible à la phase stationnaire.

Lorsque le mélange s’écoule à travers la colonne, les molécules cibles fixer sur le ligand et le débit de repos. Le mélange expiré par le biais de la colonne, la molécule cible peut être collectée au moyen d’une des deux méthodes d’élution basées sur la spécificité.

Biospecific élution peut être considérée un avoir un « normal » ou « inverse-rôle ». Dans biospecific normal-rôle d’élution, un agent est ajouté qui rivalise avec le ligand collé à lier avec la biomolécule cible.

Dans biospecific inverse-rôle d’élution, un agent est en concurrence avec l’objectif de se lier au ligand collé. Le deuxième type d’élution, non-spécifique à élution, abaisse la liaison ligand-à-cible en changeant la pH, force ionique ou solution polarité. Si une protéine ne soit pas lié à un ligand qui peut être immobilisé, la protéine peut être exprimée en contenant un « tag » : courtes séquences peptidiques conçus pour se lier au ligand.

Une variété est une chromatographie d’affinité immobilisée ion métallique, « IMAC » pour faire court, où un ligand métallique collé, comme le nickel ou cobalt, se lie aux résidus d’histidine sur la protéine modifiée. Par le biais de techniques de biologie moléculaire, protéines cibles sont générés avec la répétition des résidus d’histidine, appelés polyhistidine-étiquette, qui se lie au métal par l’intermédiaire de la chaîne latérale imidazole sur histidine. Une fois lié, la protéine peut être rassemblée d’imidazole gratuit via inverse-rôle spécifique d’élution et plus tard utilisé dans un large éventail d’applications en aval.

Maintenant que vous avez vu la théorie de la chromatographie d’affinité, regardons une procédure IMAC en laboratoire.

En IMAC, la phase stationnaire peut être ajoutée directement au mélange de la phase mobile et échantillon, permettant la liaison de la protéine de son étiquette. Ce coulis est ensuite versé dans la colonne, où le non lié aux composés goutte à goutte dans les déchets, tandis que la boue reste. Le conteneur de lisier est rincé pour recueillir la résine résiduelle et l’échantillon, qui est ajoutée à la colonne.

La résine est agitée pour s’assurer que les composants non liés sont à écoulement libre. Ajouté le lavage tampon contribue à les nettoyer. Après ont enlevé tous les composants non liés, le déchet est remplacé avec un récipient pour recueillir la protéine cible.

Mémoire tampon contenant l’imidazole est ajouté, agité et laisser reposer pour dissocier la molécule cible. L’imidazole lie au métal, en remplaçant et en relâchant la protéine étiquetée. La protéine libérée est recueillie, et l’étape de l’imidazole est répétée pour assurer le recouvrement total. Pour plus amples purifier l’échantillon, SEC peut être exécuté sur l’échantillon avant l’analyse.

Maintenant que nous avons vu la théorie et l’intérieur de ces deux techniques, regardons quelques-unes des façons qu'elles sont appliquées dans le domaine biochimique.

Une raison courante pour purifier les protéines est d’étudier leur rôle dans la maladie. Fibrose kystique est causée par des défauts dans les protéines de régulateur conductance transmembranaire de la fibrose kystique ou CFTR. Après une croissance de la protéine avec une balise son chez la levure, affinité et chromatographie d’exclusion stérique permettent l’isolement de la protéine, suivie par l’étude de sa fonction.

Dans certains cas, la présence d’une balise polyhistidine pouvez modifier la structure d’une protéine, cela n’affecte sa fonction. Une autre balise commune est la protéine liant le maltose ou MBP, qui se liera à lié amylose dans une colonne. Maltose est ensuite utilisée pour libérer le complexe. Le MBP puis peut être clivé et retiré auprès de la SEC pour produire la protéine désirée pure.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur chromatographie d’exclusion stérique et affinité. Il couvert la théorie des techniques, passe procédures générales et certaines des utilisations des techniques couverts.

Merci de regarder !