Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine des maladies rénales. Particulièrement dans la compréhension des glomerulus dans les états normaux et maladie. La biologie glomerular peut être difficile à étudier en raison de la variété des types de cellules présents et de leur structure unique.
Le principal avantage de cette technique est de fournir une source facilement disponible de glomeruli intact en utilisant des méthodes et des équipements simples. Cette technique a des implications pour notre compréhension de la barrière de filtration dans le rein normal et maladie. En particulier, il peut faire la lumière sur notre compréhension de la maladie rénale chronique protéique dans laquelle les lésions glomériques conduit à la sécrétion anormalement élevée de protéines sériques dans l’urine.
En général, les personnes nouvelles à cette technique auront de la difficulté à obtenir un rendement et une pureté adéquats dans l’échantillon final. Brittney Rush, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, utilisez des tondeuses à cheveux pour enlever les cheveux de l’abdomen antérieur d’un rat euthanasié.
Utilisez 70% d’éthanol pour nettoyer la peau exposée. Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, faire une incision midline dans la peau. Pour exposer les organes internes, faire une incision midline à travers la couche musculaire.
Localiser et isoler les reins et les placer dans un tube conique en plastique de 50 millilitres avec 30 millilitres de solution de sel tamponnée de Hank ou HBSS placés sur la glace. Transférer le tube sur la glace sur une hotte stérile de culture cellulaire. Transférer les reins dans une boîte de Pétri stérile contenant cinq millilitres de HBSS placés sur la glace.
Utilisez des ciseaux et des forceps tranchants pour éliminer et jeter la graisse périrénale. Pour enlever et jeter les capsules entourant le rein, faire une petite incision superficielle, puis utiliser des forceps pointus pour le retirer doucement du rein. Placer les reins sur une gaze stérile dans une deuxième boîte de Pétri avec cinq millilitres de HBSS et diviser chaque rein en deux à travers une section mi-sagittale.
Utilisez un scalpel pour enlever et jeter la médulle qui peut être identifiée par sa couleur plus foncée et son emplacement central. Transférer les morceaux restants contenant principalement le cortex rénal, dans une troisième boîte de Pétri avec cinq millilitres de HBSS. Utilisez une lame de rasoir stérile pour les hacher jusqu’à ce que les morceaux soient de moins d’un millimètre de taille ou jusqu’à ce qu’une pâte soit formée.
Utilisez 1%BSA PBS pour mouiller le haut et le bas d’un tamis de 180 micromètres sur un bécher à déchets de 500 millilitres. Cette étape est essentielle car elle enrobe le tamis de protéines et réduit l’adhérence du glomeruli qui améliorera ensuite le rendement. Placer le cortex mixte sur un petit bord du tamis.
Utilisez la bride de piston texturée d’une seringue jetable de 10 millilitres pour faire taire le tissu à travers le tamis dans une casserole inférieure placée sur la glace. Rincer périodiquement avec hbss en utilisant aussi peu que possible pour éviter la dilution de l’échantillon et réutiliser le fluide de collecte dans la casserole inférieure pour rincer le tamis. Après le tamis terminé, lavez soigneusement le fond du tamis avec HBSS du fond de la casserole pour capturer n’importe quel glomeruli lâchement adhéré.
Divisez tout le liquide de la casserole inférieure en seringues de 10 millilitres équipées d’aiguilles de calibre 20. Passer le liquide à travers l’aiguille au moins trois fois dans la casserole inférieure. Pour la dernière collection, garder le glomeruli contenant du liquide dans la seringue jusqu’à ce qu’il soit prêt à passer à travers le tamis de 90 micromètres.
Pendant ce temps, laver la casserole inférieure en la rinçant avec 1%BSA PBS et dans un bécher à déchets. Utilisez 1%BSA PBS pour mouiller le haut et le bas d’un tamis de 90 micromètres, puis placez-le sur le dessus de la casserole inférieure. Appliquer l’échantillon dans les seringues sur un bord du tamis.
Utilisez une bride de piston texturée pour faire taire le tissu à travers le tamis comme cela a été fait précédemment. Utilisez la solution à partir de la casserole inférieure pour laver les tissus et recueillir tout à partir d’un bord du tamis. Une fois le tamis terminé, lavez soigneusement le fond du tamis avec le tampon HBSS du fond de la casserole pour capturer n’importe quel glomeruli qui peut être lâchement adhéré.
Recueillir tout le liquide de la casserole inférieure dans un tube conique en plastique de 50 millilitres. Utilisez 1%BSA PBS pour laver la casserole inférieure dans un bécher à déchets. Ensuite, utilisez 1%BSA PBS pour mouiller le haut et le bas d’un tamis de 75 micromètres.
Placer le tamis sur le dessus de la casserole inférieure placée sur la glace. Appliquer l’échantillon sur un bord du tamis avec le liquide qui coule à travers facilement. Rincer le haut du tamis avec un minimum de 20 millilitres de 1%BSA PBS dans un bécher à déchets et laver soigneusement le fond du tamis.
Pour recueillir le glomeruli qui est resté sur le dessus du tamis de 75 micromètres, rincer à travers le tamis à l’envers avec autant de HBSS que nécessaire pour recueillir le glomeruli dans une boîte de Pétri. Recueillir le glomeruli tamisé dans un tube conique en plastique de 50 millilitres sur la glace. Après avoir centrifugé à 1800 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, retirez soigneusement le supernatant à l’aide d’une pipette.
Suspendre à nouveau la pastille dans 10 millilitres de HBSS froid. Mélanger les échantillons et répéter la centrifugation. Suspendre à nouveau le glomeruli en cinq millilitres de HBSS.
Pour compter le glomeruli total, placez une goutte de 10 microlitres de l’échantillon sur une lame de verre, comptez au microscope et plusieurs par 500 pour obtenir le rendement total. Les structures isolées devraient être composées de presque tous les glomeruli sans structures tubulaires. Si des tubules sont présents et affecteraient votre application en aval, ils peuvent être enlevés en appliquant l’échantillon entier sur le tamis de 90 micromètres et en répétant le protocole à partir de ce moment-là.
Le protocole décrit ici est efficace pour isoler le glomeruli et la suspension finale est densément emballée avec glomeruli avec une pureté supérieure à 95% et une contamination minimale des segments tubulaires ou d’autres types de cellules. Ces glomeruli peuvent être tachés avec des taches d’hématoxyline et d’éosine pour voir leur morphologie. En outre, ils maintiennent leur structure tout au long du protocole, même après le traitement.
Ils conservent des podocytes intacts et viables, des cellules mésangiales et des cellules endothéliales. Les glomeruli isolés ont été exposés à des dommages chimiques pour simuler la pathologie in vivo. Plus précisément le sulfate de protamine qui perturbe la charge de la barrière de filtration glomerular.
Contrairement au glomeruli sain, le sulfate de protamine traité glomeruli, ont une réduction proéminente du néphron et un certain nombre de noyaux positifs pour WT1. Lorsqu’il est vu avec la microscopie électronique de transmission, glomeruli sain montrent des processus typiques de pied. Après traitement de sulfate de protamine, les processus de pied sont allongés ou effacés indiquant des dommages de podocyte.
Pour déterminer la viabilité cellulaire dans le glomeruli isolé, le caspase fendu trois a été observé comme marqueur d’apoptose. Il n’y avait pas de caspase fendu trois à zéro et une heure après l’isolement du glomeruli. Quelques cellules ont montré des signes d’apoptose à deux et quatre heures avec une augmentation progressive au fil du temps.
Le plus grand nombre de cellules apoptotiques ont été notés à 24 et 48 heures. Sur la base de ces résultats, nous recommandons que le glomeruli isolé soit utilisé immédiatement après l’isolement pour la plupart des expériences. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de travailler rapidement et efficacement.
A partir du moment où le rein est isolé, glomeruli commencent à se détériorer. Plus vite vous isolez le glomeruli, plus vous aurez de temps à poser, d’isolement, de manipulation. Après l’isolement, le glomeruli isolé peut être exposé à des agents chimiques ou biologiques pour stimuler les conditions physiologiques ou pathologiques.
Et les spécimens peuvent être processus pour l’isolement de protéine ou d’ARN, l’histologie ou l’immunofluorescence et la microscopie électronique. Depuis son développement dans les années 1950, cette technique a aidé les chercheurs à étudier la biologie glomerular. Dans l’ensemble, ce protocole fournit une méthode pour évaluer les caractéristiques morphologiques et cellulaires du glomeruli intact dans les états normaux et maladie.
Cette méthode peut aider à notre compréhension des maladies rénales chroniques protéiques et aider au développement de thérapies futures.
