Les auteurs tiennent à remercier les Drs Silvia B Campos-Bilderback et George J Rhodes pour l&#39;achèvement des procédures chirurgicales impliquant le placement de lignes d&#39;accès veineux. Ils aimeraient également remercier Sara E sevrage pour maintenir les colonies Munich-Wistar composé de deux Simonsen et souches Frömter.

1. Conjugaison de sérum albumine de rat de sulfo-rhodamine 101 sulfonyle (Texas Red) <ol><li> Dissoudre 100 mg de Rat albumine sérique (RSA) dans 6.667 ml de 100 mM Sodium Bicarbonate pH 9,0; concentration finale de 15 mg / ml dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Lieu solution dans la glace / eau bécher et refroidir à entre 0 et 4 ° C. </li><li> Ajouter 200 pi de qualité diméthylformamide élevé (DMF) anhydre à un flacon de 10 mg de Texas Red sulfonyle (TRSC); vortex sur le milieu pendant 15 sec. </li><li> Solution RSA Vortex à moyen et ajouter le TRSC dissous. </li><li> Wrap 50 ml conique en feuille (Parafilm peut être utilisé pour assurer un joint étanche est formé), lieu horizontalement dans un seau à glace w / glace seulement et le placer sur rocker à agiter solution lentement (éviter la formation de bulles), laissez réaction se poursuivre à 0 à 4 ° C pendant 1 heure. </li><li> Assurez-5 L de solution saline à 0,9%, et mouiller un poids moléculaire de 50 kDa couper chambre off qui peut être soit a) membrane de dialyse avec clips, b) ditube de alysis comme dans un flotteur-a-lyseur, ou c) un tiroir-lyseur cassette (tous adaptés pour enlever RSRT non conjuguée). </li><li> mélange réactionnel de place dans la chambre de dialyse et le lieu de la 5 L w / la solution saline à 0,9%, dialyser la nuit à 4 ° C avec une agitation douce à l&#39;aide d&#39;un barreau aimanté. </li><li> Changer la solution de dialyse de 5 L en matinée et en fin d&#39;après midi jusqu&#39;à une nuit d&#39;incubation résultats dans pratiquement aucun changement de couleur (Cela prend généralement ~ 48 h avec au moins 4 échanges). En outre, avec le seuil de rétention de 50 kDa être si près de la MW de RSA, 66kDa, il est possible de ne jamais produire une solution claire, ce sera dépend de la distribution de la taille des pores de la membrane; 60 h et 5 échanges est plus de suffisamment de temps. </li><li> Mesurer le volume et diviser le poids initial de 100 mg par le volume de donner concentration approximative de TR-RSA; concentrations varient généralement de 10 à 13 mg / ml. Le colorant final: le rapport albumine doit être ~ 4:1, 1 fluorophore par 15,000 Daltons de MW de protéine. Conserver à 4 ° C; ne gèlent jamais la solution TR-RSA, telle qu&#39;elle résulte fragmentation qui peut se produire va modifier les valeurs de perméabilité. </li></ol> 2. Préparer la platine du microscope inversé pour l&#39;imagerie / Microscope Paramètres <ol><li> Lieu ~ 7.4 des morceaux de ruban autoclave (environ ¾ &quot;de long) parfaitement empilés les uns sur les autres à l&#39;intérieur d&#39;un plat de 50 mm avec un fond de la lamelle 40 mm (lamelle plat à fond). Celles-ci doivent être placés plus près de l&#39;un des bords de sorte que le bord de la bande va prendre contact avec le bord de courbure du rein, mais ne bloque pas le chemin de la lumière objective (Figures 1A et 1B); rats plus grands auront besoin de plus d&#39;espace entre la bande et le bord du plat. </li><li> Placer 2 Repti-Therm patins à côté de la scène aux côtés de l&#39;antenne de 50 mm (figure 1A). Placez un réchauffement de l&#39;eau veste couverture sur la scène. </li><li> Maximiser l&#39;efficacité lors de la collecte des images en assurant la tourelle a un objectif 10x air oR 20x (air ou l&#39;eau) objectif et un objectif à immersion d&#39;eau alimenté élevée, pour recueillir des images pour la quantification. </li><li> Au cours de l&#39;imagerie de la manière la plus efficace pour ajouter de l&#39;eau à des objectifs est de faire tourner les sur le côté et ajouter de l&#39;eau à l&#39;aide d&#39;une seringue de 1 avec un long morceau de tuyau PE-200 qui peuvent atteindre le haut des objectifs. </li><li> Réglez l&#39;intensité d&#39;excitation du laser 10watt à ~ 15-20% en utilisant les filtres de densité neutre sur le logiciel. Les arséniure de gallium phosphure photodétecteurs non descanned sont fixés à 750 pour recueillir les émissions verts, et 625 pour recueillir les émissions rouges. Émission bleue (comme la tache Hoechst 33342 nucléaire) sont collectées à l&#39;aide d&#39;un détecteur de multialkaline nondescanned standard avec un réglage entre 750-800. </li><li> Afin d&#39;assurer la perception correcte des émissions de faible intensité à l&#39;intérieur de l&#39;espace de Bowman, assurez-vous que les limites inférieures des détecteurs sont réglés de manière à ne pas exclure ces valeurs. Marqueurs d&#39;avertissement visuels indiquent si la sensibilitéréglage est trop bas, et ces valeurs est donnée une valeur d&#39;intensité égale à zéro. </li><li> Chargez une seringue de 1 à ~ 5-8 mg de la solution d&#39;albumine fluorescent dilué avec 0,9% de solution saline stérile pour faire apparaître le volume total de 1 cc. </li></ol> 3. Exposer le rein dans un Rat Wistar Munich pour Intravitale 2-Photon Imaging <ol><li> Commencez avec un rat pré-anesthésiés en utilisant Pentabarbitol (50 mg / ml, solution, 120 g de poids corporel μl/100), Inactin (130 mg / ml, solution, 120 μ/100 g de poids corporel), ou isofluorane (5% induction, 1.5 à la maintenance de 2,5%), une ligne demeure veineuse d&#39;accès (veineuse jugulaire ou fémorale soit), et le flanc gauche rasé juste en dessous de la cage thoracique juste au-dessus de la cuisse gauche. </li><li> Placez le rat plat sur ​​le côté droit de sorte que l&#39;, côté rasé gauche est orientée vers le haut, assurez-vous qu&#39;il soit à plat sur ​​la table, avec sa posture allongée et pas accroupi, avec les pattes avant de toucher les uns les autres et à l&#39;arrière des pattes de toucher l&#39;autre (Figure 2A). </li&gt; <li> Très palper doucement à sentir le rein pour déterminer où il pond naturellement dans le rétropéritoine et tracer une ligne droite parallèle au corps (de la cage thoracique à la cuisse) à l&#39;aide d&#39;un Sharpie (figure 2A). </li><li> Choisir la peau avec une paire de pince à griffes, et pincer la peau le long de la ligne tracée à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces hémostatiques à écraser le tissu et d&#39;éviter des saignements. Couper le long de l&#39;incision à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux chirurgicaux. Broyage de la peau extérieure et les couches musculaires avant la coupe va considérablement réduire et éliminer typiquement saignement. </li><li> Répétez cette procédure pour la couche musculaire externe, qui est mince. </li><li> Pour l&#39;incision dans la couche musculaire interne, qui va exposer le péritoine, re-palper le rein d&#39;estimer la taille. Pincez une ligne d&#39;incision plus petite que le rein, en assurant l&#39;incision est juste sur le rein. Il est préférable de faire cette incision trop petite et l&#39;agrandir si nécessaire. Si cela est fait trop grand, suture sera nécessaire.Cette dernière incision est critique; trop loin sur dans n&#39;importe quelle direction va affecter la stabilité sur la scène et induire soit des artefacts de mouvement de la respiration (meilleur scénario) ou va étirer la perfusion pédicule rénal et réduire négativement rénale (le pire scénario). </li><li> Localisez le rein (comme le montre la figure 2B) et l&#39;adhérence de la graisse entourant aide d&#39;une pince, en travaillant vers le pôle inférieur du rein dans une main sur la mode de la main. </li><li> Une fois le pôle inférieur du rein est atteint, tirez doucement sur le rein à travers l&#39;incision tout en serrant très légèrement en dessous du rein à extérioriser. Si l&#39;incision est trop petit, écraser la couche musculaire et réduire l&#39;élargir; répéter la procédure d&#39;extérioriser rein. </li></ol> 4. Placer le Rat Wistar Munich sur la scène pour l&#39;imagerie <ol><li> Placer le rein vers le bord du plat de la lamelle avec le rein légèrement tourné vers la dorsale (côté arrière) du rat de sorte que le côté ventral du rein is la prise de contact avec le plat à fond lamelle (figure 1A). Ajouter une solution chauffée, stérile 09.% De solution saline à l&#39;antenne. </li><li> Regardez à travers l&#39;objectif 10x ou 20x et vérifier mouvement. Si un mouvement est détecté, rouler le rat sur ​​un peu de sorte que le thorax est plus loin de la boîte de fond de la lamelle, assurez-vous que le rein est aussi près du bord du plat sans étirement du pédicule rénal (figure 1B). </li></ol> 5. Acquisition d&#39;images pour quantifier la perméabilité rénale de l&#39;albumine <ol><li> Le calcul de la perméabilité glomérulaire (Glomeruluar coefficient de tamisage; CGC) de toute macromolécule nécessitera de prendre des images de référence de fond de glomérules individuels avant la perfusion de la molécule fluorescente. Si votre microscope est équipé d&#39;une platine motorisée capable d&#39;emplacements de marquage, trouver et centre glomérules individuels en utilisant l&#39;objectif motorisé inférieur et marquer chaque emplacement. Un double passe fluorescéine / rhodamine épifluorescence filter est idéal pour cette procédure, bien que ce soit filtre d&#39;émission fonctionnera (contraste de phase ou d&#39;autres sources non-fluorescence d&#39;éclairage ne fonctionnera pas). Glomérules apparaîtra comme des structures circulaires vides entourés de tubules proximaux ayant une autoflourescence jaune-orange inhérente lorsqu&#39;il est vu à travers le filtre double passe. </li><li> Si votre microscope n&#39;a pas une platine motorisée, scannez le rein dans une configuration de trame avec l&#39;objectif de faible puissance et de faire une carte rudimentaire où les glomérules individuels sont situés, en s&#39;appuyant sur des repères naturels tels que les gros vaisseaux sanguins superficiels situés au-dessus de la capsule rénale ou patchs de graisse. </li><li> Mettez la tourelle à l&#39;eau puissance objectif à immersion supérieur et prendre les ensembles de données 3D de chaque glomérules en s&#39;assurant que les boucles capillaires et l&#39;espace de Bowman sont clairement visibles. Utilisant une palette pseudocouleur (autre que B / W quelque chose) permettra de visualiser ces structures. </li><li> En se concentrant sur un vaisseau sanguin superficiel infuser lentement en til fluorescent s&#39;assurant temps albumine est donnée pour permettre la distribution systémique. Pour les molécules à faible CGC, il est essentiel de maximiser les valeurs d&#39;intensité dans le plasma, mais pas pour atteindre des niveaux qui vont saturer les photo-détecteurs au microscope. Cela augmente la détectabilité des molécules filtrées. Remarque: il existe généralement un laps sec 5-7 entre le moment où l&#39;albumine fluorescent est introduit à la fois qu&#39;il apparaît à l&#39;écran (l&#39;acquisition des images complètes à ~ 1 image / seconde). </li><li> Laisser environ 10 minutes pour permettre à tous les petits fragments potentiels de poids moléculaire aient disparu avant l&#39;acquisition de volumes 3D à des intervalles de 1 um à être utilisées dans le calcul de la CGC albumine. En règle générale, la souche de Munich rats Wistar de l&#39;Simonsen a beaucoup moins de glomérules de surface, donc tout ce qui peut être visualisée sont imagés et quantifiés. La souche Frömter dispose d&#39;un nombre beaucoup plus élevé si nous limitons le nombre chiffré à ~ 10. </li><li> A la fin de l&#39;étude, le rat est euthanasié par une surdose d&#39;anesthésique l&#39;IC utilisée dans l&#39;étude. Un double pneumothoracotamy est effectuée pour assurer l&#39;euthanasie. </li></ol> 6. Calcul de la CGC pour Fluorescent albumine à partir de volumes 3D <ol><li> Grâce à un logiciel de traitement d&#39;image Metamorph charger des ensembles de données 3D pour chaque glomérules, à la fois l&#39;ensemble de fond et mis en prise après la perfusion de l&#39;albumine fluorescente. </li><li> Dans le volume contenant le fluorescent albumine localiser une boucle capillaire superficiel avec suffisamment d&#39;espace vide entre ses marges définies et le bord de la capsule de Bowman. </li><li> Dans le volume de fond localiser le même plan focal qui doit contenir toutes les indications visuelles de l&#39;image contenant l&#39;albumine. Sélectionnez une région dans la boucle capillaire d&#39;intérêt et noter la valeur moyenne de l&#39;intensité. Ensuite, sélectionnez une région dans l&#39;espace de Bowman et noter la valeur moyenne de l&#39;intensité. Celles-ci seront utilisées comme valeurs de référence. </li><li> Pour la quantification, sélectionnez la région similaire au sein de l&#39;espace de Bowman dans le c albumineontenant image. Faites cela pour au moins deux autres régions à prendre une valeur moyenne de l&#39;intensité moyenne à l&#39;intérieur de l&#39;espace de Bowman. </li><li> Sélectionnez la boucle capillaire avec l&#39;intensité de plasma lumineux et dessiner une région autour d&#39;elle. Suivant en utilisant la fonction de seuil, mettre en évidence les valeurs de luminosité dans le plasma circulant, en évitant les rayures foncées qui circulent de RBC. Remarque les valeurs d&#39;intensité moyenne de l&#39;espace de plasma sélectionné. Il est important de choisir de préférence les zones claires de l&#39;écran plasma, car les facteurs dans le sang ne servent qu&#39;à provoquer et sous-estimation des niveaux de fluorescence plasma. </li><li> Utiliser un tableur Microsoft Excel entrez les valeurs pour calculer la CGC où: </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les étapes soulignés ici représentent ce que nous croyons être celles qui vont produire des valeurs de perméabilité cohérentes et précises car elles contournent les pièges suivants: <ol><li> Diffusion: L&#39;utilisation d&#39;un dispositif d&#39;émission des fluorophores rouges permettre une collecte plus efficace de la lumière depuis plus photons de longueurs d&#39;onde sont moins enclins à se disperser. En utilisant soit des fluorophores émettant vert ou bleu va introduire une plus grande variation da...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Les maladies du rein impliquant la perte urinaire de grandes macromolécules essentielles, comme l&#39;albumine sérique, ont longtemps été pensé pour être causés par des altérations de la barrière de perméabilité composé de podocytes, cellules endothéliales vasculaires, et une membrane basale de travail à l&#39;unisson. Les données de notre laboratoire en utilisant intravitale microscopie 2 photons ont révélé une barrière plus perméable de filtration glomérulaire (GFB) qu&#39;on ne le pensait dans des conditions physiologiques, avec récupération des filtré albumine se produisant dans un sous-ensemble au début de cellules appelées cellules des tubules proximaux (PTC) 1,2 3. Les techniques précédentes utilisées pour étudier la filtration rénale et d&#39;établir les caractéristiques de la barrière de filtration impliqué micropuncture de la lumière de ces segments tubulaires début de l&#39;échantillonnage du contenu et analyse 4 fluide. Ces études ont déterminé la concentration d&#39;albumine dans le liquide luminal être pratiquement inexistante; correspondant étroitementpour ce qui est normalement détecté dans l&#39;urine. Cependant, la caractérisation des polymères de dextran avec des tailles définies par cette technique a révélé celles d&#39;une taille similaire à l&#39;albumine sérique des niveaux plus élevés dans la lumière tubulaire et l&#39;urine; suggérant une perméabilité accrue 5. Ce document est un aperçu détaillé de la technique utilisée pour visualiser et quantifier directement glomérulaire fluorescent perméabilité albumine in vivo. Cette méthode permet la détection de l&#39;albumine filtrée à travers la barrière de filtration dans l&#39;espace de Bowman (la chambre initiale de filtration urinaire), et permet également la quantification de l&#39;albumine réabsorption par les tubules proximaux et la visualisation de suite transcytosis albumine 6. L&#39;absence d&#39;albumine fluorescent le long des segments tubulaires plus tard, en route vers la vessie met en évidence l&#39;efficacité de la voie de récupération dans les segments des tubules proximaux plus tôt. De plus, lorsque cette technique a été appliquée pour déterminer la perméabilitéde dextranes ayant une taille similaire à des valeurs de perméabilité pratiquement identiques albumine ont été signalés 2. Ces observations appuient directement la nécessité d&#39;élargir la portée de beaucoup de maladies rénales protéinuriques de modifications incluses dans la remise en état des cellules du tubule proximal.

La figure 3 montre un exemple d&#39;une image prise à partir d&#39;un glomérule de surface d&#39;un Munich Wistar Frömter rat et les mesures prises pour déterminer la perméabilité de l&#39;albumine fluorescente. La valeur CGC de l&#39;albumine de 0,0111 dérivé pour cette glomérule chute individu au sein de la gamme vu dans cette souche de rats Wistar Munich lorsque dans l&#39;état nourri 3. La stabilité observée dans ces images est due à la planification minutieuse et l&#39;exéc...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Une technique utilisant haute résolution intavital microscopie 2-photons pour visualiser directement et de quantifier filtration gloemrular dans les glomérules de surface. Cette méthode permet la détermination directe des caractéristiques de perméabilité des macromolécules dans des états normaux et malades.

Quantifier glomérulaire perméabilité des macromolécules fluorescentes en microscopie 2 photons à Munich chez le rat Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K vues.  Indiana University School of Medicine. Une technique utilisant haute résolution intavital microscopie 2-photons pour visualiser directement et de quantifier filtration gloemrular dans les glomérules de surface. Cette méthode permet la détermination directe des caractéristiques de perméabilité des macromolécules dans des états normaux et malades.

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Recherche

Médecine

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Une méthode de quantification des performances du membre supérieur dans la vie quotidienne utilisant des accéléromètres

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

In Vivo Analyse morphométrique des humains nerfs crâniens à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique oreilles maladie de Menière et des oreilles de l’audition normale

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermique mesurage du débit de Filtration glomérulaire chez la souris

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

Mesure très sensible de la perméabilité glomerulaire chez les souris avec fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Coloration par immunofluorescence à monture entière, imagerie confocale et reconstruction 3D du nœud sino-auriculaire et auriculo-ventriculaire chez la souris

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolement et culture de macrophages cardiaques résidents du nœud sino-auriculaire murin et auriculo-ventriculaire

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Analyse des enregistrements électrocardiographiques à long terme pour détecter les arythmies chez la souris

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...