Les supercomplexes sont des assemblages supramoléculaires formés par des complexes de chaînes respiratoires dans la membrane interne-mitochondriale. On croit que la formation de ces supercomplexes confère plusieurs avantages structurels et fonctionnels, notamment une diminution de la production d’espèces réactives d’oxygène, la stabilisation et un assemblage plus efficace des complexes individuels de chaînes respiratoires, la régulation de l’activité de la chaîne respiratoire et la prévention de l’agrégation des protéines dans l’environnement riche en protéines de la membrane interne. Les changements dans l’assemblage et la composition des supercomplexes sont dynamiques, et il est de plus en plus démontré qu’ils sous-tendent les changements dans la fonction mitochondriale observés lors de l’adaptation physiologique, ainsi qu’une variété de maladies génétiques et acquises.
Cette vidéo présente un protocole hybride page natif clair/bleu pour résoudre et analyser les supercomplexes d’une manière précise et efficace dans le temps. Le principal avantage de cette méthode hybride page native claire/bleue est qu’elle combine de façon optimale divers aspects des protocoles traditionnels de PAGE natif bleu et clair, ce qui permet de réduire au minimum l’exposition aux détergents et aux composés anioniques par rapport aux protocoles publiés. La séparation et l’analyse optimales des supercomplexes sont réalisées sur les gels à grand gradient.
Cette procédure comporte plusieurs étapes délicates nécessitant des compétences manuelles et une exécution minutieuse. Le soutien visuel au protocole écrit fournit des conseils importants qui facilitent la mise en œuvre de la technique. La démonstration de la procédure est Alexandrie, un étudiant au doctorat de mon laboratoire.
Pour commencer, centrifugeuse les mitochondries isolées du tissu animal dans un tube de 1,5 millilitre à 16 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et ajoutez le volume calculé de tampon d’extraction de froid glacé contenant de la digitonine au tube pour résuspendre la pastille mitochondriale. Placer les tubes sur un mini rotateur à tube et incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius à une vitesse de rotation moyenne.
Échantillons de centrifugeuses à 20, 400 fois-G pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius pour enlever les fragments insolubilisés. Transférer le surnatant dans un nouveau tube sur la glace. Si l’électrophoresis n’est pas effectuée le même jour, stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius.
Ouvrez la chambre de coulée. Placez une plaque de verre extérieure de 20 centimètres de 22 centimètres dans la chambre. Placez un ensemble d’espaceurs de 1,5 millilitre à l’aide de la carte d’alignement pour vous assurer qu’ils sont bien assis contre le côté et les coins de la chambre.
Placez une plaque de verre intérieure sur les entretriers pour former le sandwich au gel et placez une feuille de séparation en plastique sur la plaque de verre. Disposer trois autres assemblages de sandwichs au gel. Ajouter plus de blocs acryliques ou de plaques de verre si nécessaire pour occuper le reste de l’espace dans la chambre.
Placez une bande de parafilm dans la rainure avant d’asseoir fermement le joint dans l’encoche du joint. Placez la plaque de plafond sur la chambre et serrez les six vis. Tenez-vous debout la chambre de coulée.
Placez le gradient ancien sur une plaque de remue-remuer avec un agitateur magnétique dans la chambre de mélange de lumière. Connectez le tube de la chambre de coulée à l’ancien gradient, et fixez le tube dans la cassette de la pompe périssaliste. Assurez-vous que le robinet d’arrêt du gradient ancien est fermé.
Pour lancer quatre gels, préparez 60 millilitres de 4% et 60 millilitres de solutions gel 12% dans deux flacons Erlenmeyer, et tourbillonnez complètement pour bien mélanger. Versez la solution de gel de 4% dans la chambre de mélange léger, et les 12% dans la chambre de réservoir lourd du gradient ancien. Réglez la vitesse de remue-remuer de la plaque à 350 rpm.
Ensuite, ouvrez le robinet d’arrêt et allumez la pompe à 35 rpm. Une fois que le niveau de solution de la fraction de lumière est inférieur à la fraction lourde, mettez la pompe en pause et ouvrez la tige de la vanne entre les réservoirs légers et lourds. Laissez les fractions de volume équilibrer et redémarrer la pompe.
Assurez-vous qu’aucune bulle n’entre dans le système et ne se coincer entre les plaques de verre. Une fois le gel dégradé complètement versé, arrêter la pompe et superposer une eau millilitre sur chaque sandwich au gel pour éviter le séchage du gel. Laissez-le polymériser pendant deux heures.
Préparer 25 millilitres de gel empilant dans le flacon Erlenmeyer et tourbillonner pour bien mélanger. Inversez délicatement le montage pour enlever l’eau et insérez des peignes de 15 puits dans chaque sandwich au gel. Verser le gel empilant et laisser polymériser pendant deux heures.
Après cela, insérez du gel et des pinces à sandwich et retirez le peigne. Avec la plaque de verre courte orientée vers le bas, insérer le sandwich au gel dans le noyau de refroidissement. Répétez l’répétition de l’autre côté et placez le noyau dans le réservoir d’électrophorèse.
Verser 300 millilitres de tampon cathodique bleu dans la chambre intérieure du réservoir d’électrophoresis. À l’aide d’une pipette et de pointes de chargement, chargez de 75 à 175 microgrammes de protéines par puits. Dans la chambre froide à quatre degrés Celsius, branchez les électrodes dans l’alimentation électrique et allumez-la à 150 volts, et exécutez le gel pendant une heure et demie, ou jusqu’à ce que les échantillons soient tous entrés dans le gel de gradient.
La charge reproduit l’échantillon dans des puits distincts pour permettre une détermination parallèle des activités en gel et une analyse immunoblot des complexes OXPHOS. Retirer le tampon cathodique bleu avec la pipette. Remplacer par 300 millilitres de tampon cathodique bleu coomassie, et faire fonctionner le gel à 200 volts pendant la nuit dans la chambre froide.
Avant la fin de l’électrophorèse, préparez des tampons d’activité en gel selon le manuscrit, et gardez-les dans l’obscurité à température ambiante. Arrêtez l’électrophoresis et récupérez le gel. Coupez le sac en plastique pour qu’il puisse être ouvert comme un livre.
Couper les voies et transférer les voies de gel dans des sacs en plastique. Utilisez un scellant thermique pour sceller deux des trois côtés. Si des expériences de contrôle négatives sont effectuées, ajouter des inhibiteurs aux tampons d’essai.
Pour trois échantillons expérimentaux, ajouter 20 millilitres de tampon d’activité dans le gel. Enlever les bulles et sceller le quatrième côté du sac en plastique. Incuber des voies gel à 37 degrés Celsius dans l’obscurité et vérifier toutes les 15 minutes.
Le temps d’incubation varie en fonction de la quantité de protéines et de complexes. Après l’incubation, rincer les voies gel dans l’eau pour arrêter la réaction, et l’image sur un fond blanc pour le complexe I, complexe II, complexe IV, ou fond noir pour complexe V.Pour cet exemple, une activité complexe IV en gel a été effectuée pour visualiser les supercomplexes isolés des mitochondries fraîches de foie de souris. La quantité optimale de digitonine pour cet échantillon est de quatre grammes par gramme, car il fournit une bonne résolution du complexe monomère IV, et des supercomplexes de poids moléculaire élevé.
À un rapport inférieur, les bandes ne sont pas claires et se résolvent dans un frottis pendant l’électrophoresis, tandis que l’utilisation d’un rapport plus élevé de digitonine conduit à la perturbation des supercomplexes de poids moléculaire élevé. Les mitochondries hépatiques isolées d’une souris ont été traitées avec la quantité optimale de digitonine pour extraire les supercomplexes respiratoires. La mobilité électrophoretic des complexes OXPHOS est légèrement réduite lorsque les protéines sont séparées à l’aide de conditions hybrides de PAGE natif clair/bleu, par rapport à la PAGE native standard, en raison de la quantité réduite de bleu coomassie.
Ce changement de mobilité est plus important pour les monomères IV complexes, suivis de monomères V complexes, et complexe I.Le fond bleu est plus bas dans la PAGE native/bleue claire hybride par rapport à la PAGE native bleue. Les niveaux élevés de fond suivant la PAGE native bleue masquent complètement la coloration d’activité dans le gel pour le complexe II, et augmentent le bruit de fond lié à l’activité des dimers iv complexes. Pour ce protocole, la titration des échantillons d’intérêt avec diverses quantités de digitonine est essentielle afin d’identifier les conditions qui permettent une solubilisation optimale, tout en préservant l’activité enzymatique et les interactions physiologiques des protéines.
Toutes les étapes concernant la coulée de gel doivent être effectuées méticuleusement à la formation d’un gradient optimal pour une séparation appropriée de l’échantillon. Un soin extrême doit également être pris pour la manipulation de ces gels grands et fragiles. Tenez-les toujours avec plusieurs doigts à l’aide de l’extrémité haute en pourcentage du gel.
Avec cette méthode hybride page natif clair/bleu, les échantillons ne sont exposés que brièvement au colorant anionique Coomassie bleu au début de l’électrophorésie sans exposition à d’autres détergents. Cela permet de séparer et de résoudre les supercomplexes aussi efficacement qu’avec les méthodes traditionnelles de PAGE native bleue, tout en évitant l’effet négatif des niveaux bleus élevés de Coomassie sur les analyses d’activité dans le gel et les interactions protéine-protéine labile dans les supercomplexes. Avec ce protocole, il est donc possible de combiner des mesures précises et rapides de l’activité en gel avec des techniques analytiques impliquant l’électrophoresis 2D, l’immunodédetection et/ou l’analyse référencée protéomique des supercomplexes.
