Notre protocole permet de mesurer la détection et la discrimination des odeurs volatiles avec un panneau de récepteurs odorants. Cette méthode ouvre la possibilité de développer des biocapteurs à base de récepteurs odorants. Cette technique permet une surveillance in vitro en temps réel de l’activation des récepteurs odorants sur les molécules d’odorant en phase de vapeur.
Il comble l’écart entre les approches in vitro et in vivo. Cette méthode peut être utilisée pour comprendre la cinétique des événements qui conduisent à la perception des odeurs, y compris le rôle des enzymes métaboliques muqueales. Pour commencer, préparez M10 et M10 PSF selon le manuscrit.
Les cellules sont cultivés en 10 millilitres de M10 PSF à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Observez le plat de culture sous un microscope à contraste de phase. Quand il atteint 100% confluent, divisez les cellules à une concentration inférieure en aspirant le média et en lavant les cellules doucement avec 10 millilitres de PBS.
Puis aspirer le PBS et ajouter trois millilitres de trypsine-EDTA. Laisser réagir pendant environ une minute jusqu’à ce que les cellules se dissocient du plat. Ajouter cinq millilitres de M10 pour inactiver la trypsine, et pipette de haut en bas pour détacher les cellules attachées au plat.
Transférer les huit millilitres de suspension cellulaire du plat dans un tube de 15 millilitres et centrifuger le tube à 200 fois G pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant et résusquer les cellules en cinq millilitres de M10 PSF en pipetage de haut en bas pour briser toute masse cellulaire. Évitez de créer des bulles dans le tube.
Pour obtenir 20% de confluence des cellules, ajoutez neuf millilitres de PSF M10 dans un nouveau plat de culture cellulaire de 1000 millimètres, et transférez un millilitre de la solution cellulaire résuspendue. Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Ce plat, assis à 20% de confluence, atteindra 100% de confluence en 48 heures.
Placer le plat sous un microscope à contraste de phase à observer. Prenez 1/10 du plat de culture de confluence 100% cellulaire. Aspirer le média et laver les cellules doucement avec 10 millilitres de PBS.
Ensuite, traitez les cellules avec trypsine-EDTA et M10, centrifugeuse, et traiter à nouveau avec M10 PSF comme précédemment effectué. Pour réaliser une plaque de 96 puits, ajoutez 500 microlitres des cinq millilitres des cellules résuspendues à 5,5 millilitres de M10 PSF frais. Mélangez les cellules et le PSF M10 sans générer de bulles d’air.
Pipette 50 microlitres des cellules suspendues diluées dans chaque puits de la plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Tout d’abord, placez la plaque de 96 puits cultivé pendant la nuit sous un microscope à contraste de phase, observez la confluence cellulaire et assurez-vous qu’elle se situe entre 30 % et 50 % Préparez un premier mélange de transfection dans un tube de 1,5 millilitre qui contient les plasmides communs à l’ensemble de la plaque selon le manuscrit.
Rho-pCi est un contrôle négatif vecteur vide, et Olfr1377 est un contrôle positif connu pour répondre à l’acétophénone odorant testé. Diviser le mélange en deux mélanges de transfection contenant l’un des plasmides de contrôle. Préparer un deuxième mélange de transfection contenant 500 microlitres de MEM et 20 microlitres de lipofectamine 2000 réagent.
Ajouter la moitié du deuxième mélange à chaque réservoir bien et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas. Incuber le tube pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter cinq millilitres de M10 pour une plaque de 96 puits.
Ajouter 2,5 millilitres dans chaque puits de réservoir et mélanger délicatement. Remplacez le M10 PSF dans la plaque de 96 puits précédemment plaquée par 50 microlitres du dernier média de transfection. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Ouvrez ensuite la porte du luminomètre et insérez le tube relié à la pompe à vide. Passer l’aspirateur dans la chambre du luminomètre pendant la nuit. Après la transfection, observez la plaque de 96 puits sous un microscope de contraste de phase pour assurer une confluence cellulaire entre 60% et 100%Préparez la solution de stimulation de la solution de sel équilibré de Hank contenant 10 millimolar de HEPES et cinq millimolar de D-glucose.
Retirer le milieu de transfection de la plaque de 96 puits et laver les cellules en ajoutant 50 microlitres de solution de stimulation fraîche à chaque puits. Pour diluer la solution de reagent GloSensor cAMP, pipette 2,75 millilitres de la solution de stimulation dans un tube de cinq millilitres et ajouter 75 microlitres de la solution de réaccente cAMP. Retirez la solution de stimulation des puits et ajoutez 25 microlitres de solution réaccienne diluée à chaque puits.
Incubez la plaque de 96 puits à température ambiante dans un environnement sombre et sans odeur pendant deux heures. Tout d’abord, diluer l’acétophénone odorant à 1% dans 10 millilitres d’huile minérale et capuchon du tube. Avant la fin du temps d’incubation du réaccônable de l’AMP, ajouter 25 microlitres de la solution odorante à chaque puits dans une nouvelle plaque de 96 puits.
Ensuite, placez cette plaque d’odorant dans la chambre du luminomètre pendant cinq minutes pour équilibrer la chambre avec des molécules odorantes volatiles. Réglez le luminomètre pour enregistrer la luminescence avec zéro seconde de retard pendant 20 cycles de mesure de la plaque de 90 secondes, avec 0,7 seconde d’intervalle entre les cycles. Juste avant de lire la plaque, retirer la plaque d’odorant de la chambre.
Dans la plaque de 96 puits contenant les cellules transfectées, ajouter 25 microlitres d’odorant dans l’espace entre les puits, et remettre rapidement la plaque dans la chambre. Commencez la mesure de luminescence de tous les puits pendant 20 cycles dans les 30 minutes. Après la mesure de la luminescence, retirer le odorant restant à l’intérieur du luminomètre en aspirant abondamment les odorants dans la chambre de lecture pendant au moins deux heures.
Remplacer par de l’air frais en envoyant de l’air comprimé pendant cinq minutes avant d’incuber le prochain odorant afin d’éviter la contamination croisée des odeurs volatiles. Pour commencer l’analyse des données, exportez les données à partir du logiciel luminomètre. Moyenne des répliques du même OR pour chaque temps d’enregistrement.
Pour calculer la réponse normalisée de la SALLE à tout contrôle éventuel, divisez la valeur moyenne vectorielle vide à la valeur moyenne de la SALLE à chaque heure d’enregistrement. Normalisez chaque réponse or à leur activité basale en divisant la réponse moyenne ou à zéro seconde à chaque réponse de temps d’enregistrement. Pour obtenir une valeur de réponse or unique pour la courbe de chaque OR, résumez toutes les valeurs de luminescence de chaque temps d’enregistrement pour chaque PIÈCE afin d’obtenir la zone sous la courbe.
Dans cette expérience, l’activation en temps réel des ors de souris sur le stimulus d’odorant de vapeur a été surveillée sur 20 cycles de mesure. Une lutte antivectorielle vide a été utilisée pour s’assurer que les activités induites par les odorants des OP testées étaient spécifiques. Les données de chaque puits ont d’abord été normalisées à la valeur moyenne de contrôle vectoriel vide pour chaque cycle.
Ensuite, pour comparer les différentes réponses des OR, les données ont été normalisées aux niveaux d’activité basale de la SA dans cet essai. Les valeurs d’activation unique pour chaque OR ont été calculées en calculant la zone sous la courbe pour chaque OR en résumant les valeurs d’émission de tous les cycles de mesure. En outre, les réponses dépendantes de la dose peuvent être mesurées à l’aide de doses croissantes d’odorants.
La réponse d’Olfr1377 à la stimulation d’acétophénone à cinq concentrations a été enregistrée. Seules les trois concentrations plus élevées ont pu activer Olfr1377. La stimulation composée pure montre une tendance à diminuer la réponse de LA au fil du temps, probablement due à la toxicité cellulaire.
Pendant l’étape, vous devez ajouter l’odorant dilué entre le puits, et être prêt à commencer rapidement l’enregistrement de la plaque. Le temps entre l’ajout d’odorants et la surveillance doit être réduit au minimum et constant entre deux expériences. Dans les cellules d’atria sont des matériaux biodangereux, alors rappelez-vous de disposer les cellules dans les dispensaires appropriés.
