Ce travail a été soutenu par le NIH DC009613, le Programme des sciences humaines frontières et Morley soins de bourse (JR).

1. La Recording Setup La chambre d&#39;enregistrement est montée sur un microscope inversé Nikon Eclipse TE2000U avec optique à contraste de phase qui est monté sur une table pneumatique et électrique blindé avec une cage de Faraday. La chambre d&#39;enregistrement Plexiglas compose de deux sections partiellement séparés par une barrière et collé sur une lame de verre silanisée. Une section de la chambre est utilisée pour régler les cellules tandis que l&#39;autre est utilisé pour stimuler l&#39;exposition pendant l&#39;enregistrement afin de minimiser l&#39;exposition prématurée du règlement, mais encore que les cellules inutilisées odorant. La configuration d&#39;enregistrement se compose d&#39;une pipette d&#39;aspiration (voir ci-dessous) monté dans un porte-pipette culot et une électrode de masse. La pipette d&#39;aspiration est positionnée à l&#39;aide d&#39;un micromanipulateur. Solutions de stimulation sont appliquées au moyen d&#39;un tube à triple cylindre en verre carré, avec chaque tube carré étant de 0,7 mm x 0,7 mm. Le verre à triple canon est relié à un système de perfusion rapide étape motorisé monté sur un manipulateur (SUTter SF-77B, Warner Instruments) et entré dans la chambre d&#39;enregistrement à un angle d&#39;environ 45 °. L&#39;extrémité de la vitre triple canon est biseautée à un angle de 45 ° à nouveau de telle sorte que la face finale (ouverture) de la vitre à triple canon est vertical pour permettre le positionnement à proximité de la pipette. La pipette d&#39;aspiration d&#39;électrode remplie d&#39;une solution de Ringer-type de mammifère et l&#39;électrode de masse sont reliées à la headstage 1 GΩ d&#39;un amplificateur de patch-clamp (CP-501A, Warner Instruments) en mode de verrouillage de tension. Le signal analogique provenant de l&#39;amplificateur (filtre passe-bas à 5 kHz) est affichée sur un oscilloscope numérique pour contrôler le signal en temps réel et également relié à un filtre de Bessel 8-pôle (Krohn-Hite) lorsque le signal est filtré passe-bas à 50 Hz. Les deux signaux (filtrage passe-bas à 5 kHz et 50 Hz) sont introduits dans un convertisseur A / D (Cambridge Electronic Design Micro 1401 MKII) qui est connecté à un ordinateur pour l&#39;acquisition des données. Les données sont enregistrées à l&#39;aide du signal 3 acquisition logiciel (Cambridge Electronic Design) à une fréquence d&#39;échantillonnage de 10 kHz. Le signal est enregistré sur les deux bandes passantes différentes d&#39;abord enregistrer le récepteur en cours ainsi que les potentiels d&#39;action superposés, puis le récepteur seul courant (voir Fig. 2). Le système de perfusion est utilisé pour commuter rapidement entre Ringer (témoin) et des stimuli olfactifs solution ou une solution de la composition désirée et est commandé par le signal PC et logiciel 3. Les solutions sont contenues dans des seringues 60 ml et le débit est contrôlé par qualité médicale régulateurs de débit intraveineux. Typiquement, le débit est réglé à 1 ml / min. L&#39;aspiration de la pipette d&#39;enregistrement est commandé de la manière suivante: Le port du côté du porte-pipette est reliée à une conduite d&#39;huile qui à son tour est reliée à un réservoir d&#39;huile à hauteur réglable. Élever ou abaisser le réservoir assure que la pression d&#39;écoulement et, par conséquent pipette Ringer à travers la pointe de la pipette est minime et légèrement positif. Aspiration supplémentaire ou de pression peut être appliquée à travers un tube relié à l&#39;espace aérien du réservoir avec une embouchure à l&#39;autre extrémité pour aspirer le corps de la cellule d&#39;une ORN isolé dans la pointe de la pipette d&#39;enregistrement. Les expériences sont réalisées à 37 ° C afin de mieux simuler l&#39;état natif physiologique de la cellule. La température est contrôlée en faisant passer les solutions à travers une unité de chauffage sur mesure qui consiste en des résistances en céramique à travers lequel les tubes en acier inoxydable contenant les solutions sont adoptées 10. La température est contrôlée au moyen d&#39;un thermomètre à thermocouple (Fluke). 2. Solutions Ringer mammifères solution de (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0,01 EDTA, HEPES 10, 10 glucose. Le pH a été ajusté à 7,5 avec NaOH. A 10% d&#39;une solution de Ringer diluée a été utilisé pour mesurer le courant de jonction. Odorasolutions tdp: acétophénone et l&#39;eugénol ont été préparés quotidiennement dans la solution de Ringer à partir de 20 actions DMSO mM. 3. Faire électrodes <ol><li> Placez un verre borosilicate unfilamented capillaire dans une Sutter P-97 extracteur micropipette et tirez une micropipette avec un cône long. </li><li> Transférer la pipette à un support micropipette sur mesure monté sur un microscope Nikon Eclipse E200 qui est à son tour muni d&#39;un réticule dans l&#39;oculaire et un couteau mobile diamant monté sur la scène. </li><li> Observez la pointe de la pipette sous l&#39;objectif 20x et en utilisant le réticule comme un guide; scribe doucement la pipette à un angle de 90 ° à l&#39;aide du couteau en diamant sur mesure où la pipette est de 10 um de large (diamètre extérieur). </li><li> Déplacez le couteau diamant de plus vers la pointe et appliquer graduellement la pression sur la pointe du couteau de diamant. La pointe de la pipette doit rompre proprement à l&#39;endroit où il a été prescrit. </li></ol> Sinon les étapes 3.1 à3.4 peuvent être combinés et pipettes peut être tiré avec des dimensions souhaitées directement sans avoir à couper la pointe de la pipette, mais il peut s&#39;avérer plus difficile de tirer de manière fiable pipettes avec un tel diamètre de l&#39;extrémité large et les bords coupés proprement. <ol start="5"><li> Sous un objectif 40X, feu polir l&#39;extrémité de la pipette à un diamètre intérieur de 5 um à l&#39;aide d&#39;un filament chauffé électriquement. Une fois terminée, la micropipette est prêt à être utilisé pour l&#39;enregistrement des courants de ORNs souris. La résistance ouverte pipette devrait être d&#39;environ 1 MW lorsqu&#39;il est rempli de Ringer. </li></ol> 4. Isolement des neurones récepteurs olfactifs <ol><li> Sacrifiez une souris en suivant les directives et règlements institutionnels. Retirer la tête, décoller la peau recouvrant le crâne et en dedans coupent la tête le long de la ligne médiane. </li><li> Placez les deux hémi-tête sous un stéréomicroscope à dissection, retirer la cloison nasale et enlever les cornets olfactifs. Placez tous les tissus dans une boîte de Pétri avec du glucose contenant solution de Ringer mammifères. </li><li> Peler l&#39;épithélium olfactif hors du cartilage sous-jacent à partir de deux cornets et transférer le tissu dans un tube Eppendorf contenant 250 ul Ringer. Nous utilisons des tissus de 2 cornets pour obtenir la bonne densité de cellules pour la taille de notre chambre d&#39;enregistrement. Stocker le tissu restant à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. </li><li> Vortexer le tube Eppendorf contenant l&#39;épithélium olfactif brièvement deux fois pendant 1 s à vitesse moyenne. Cette étape conduit à la dissociation mécanique des ORNs de l&#39;épithélium. </li><li> Placez la solution de Ringer contenant les ORNs dissociés dans la chambre d&#39;enregistrement. Retirer les gros morceaux de tissu également présentes dans la suspension à l&#39;aide de pinces fines. </li><li> Laissez les ORNs se contenter de 20 minutes avant le début de surfusion continue avec avis de sonnerie et de procéder à des enregistrements. </li></ol> 5. Enregistrements <ol><li> Abaisser l&#39;électrode d&#39;aspiration reliée à la conduite d&#39;huile dans la chambre d&#39;enregistrement et regulmangé la hauteur du réservoir d&#39;huile à établir une pression légèrement positive à la pointe de la pipette. Cela peut être fait en observant les débris cellulaires par exemple s&#39;éloigner de (pression positive) ou vers (pression négative) de la pipette. Essayez de ne pas contaminer la pointe de la pipette avec les débris cellulaires. </li><li> Numérisez la chambre d&#39;enregistrement pour une ORN isolée qui peut être reconnu par sa morphologie bipolaire typique utilisant un grossissement de 20-40x. Déplacer l&#39;électrode d&#39;enregistrement à proximité immédiate du corps cellulaire ORN. Commencer à sucer doucement de sorte que le corps de la cellule entre dans la pointe de la pipette. Lentement et continuer à appliquer le vide jusqu&#39;à ce que le corps de la cellule entière est aspiré dans la pointe de la pipette d&#39;aspiration, laissant la dendrite et les cils exposée à la solution de bain. Pour les images de ORNs aspirés et les formes de pipettes voir 7,11. Pas de garantir qu&#39;une fois l&#39;aspiration est appliquée, l&#39;ORN ne se déplace pas dans ou hors de la pipette. Si c&#39;est le cas, régler la hauteur du réservoir d&#39;huile en conséquence. </li><li> Utilisation de l&#39;micromanipulateurs, déplacer la pipette d&#39;aspiration de la section contenant les ORNs réglées à la section d&#39;enregistrement de la chambre. Placer soigneusement la pipette d&#39;aspiration en face du tube 3-coups pour un échange de solution. La pipette d&#39;aspiration doit être placé suffisamment près de l&#39;ouverture du tube 3-coups de telle sorte que l&#39;ORN est exposé à un écoulement laminaire évitant ainsi la turbulence de mélange et de réaliser l&#39;échange rapide solution. La solution d&#39;échange est réalisé par le renforcement de l&#39;interface entre les flux parallèles de solution s&#39;écoulant à travers la pointe de la pipette d&#39;aspiration. L&#39;évolution dans le temps de l&#39;échange solution est généralement autour de 20 ms, mesurée à partir du courant de jonction évoquée par le renforcement de la cellule entre les solutions de composition ionique différente (voir Fig. 2). Solutions sont livrées par gravité. </li></ol> &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; 6. Les résultats représentatifs <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" /> Figure 1. A neurones récepteurs bipolaires) dans le bulbe olfactif. B) Les machines transduction du signal dans les franges conduit finalement à excitateurs afflux actuel. La dépolarisation qui a suivi déclenche la génération du potentiel d&#39;action au niveau du corps cellulaire. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" /> La figure 2 montre la vitesse et la fiabilité de l&#39;échange solution. Une pipette a été renforcée à la normale dans Ringer diluée à 10% pendant 100 ms, et le courant de jonction résultant de la concentration en ions différente a été enregistré. Noir est la trace average de 5 essais, rouge retracer son SD. Le peu de changement en SD lors de l&#39;échange solution démontre la fiabilité de l&#39;échange solution d&#39;un essai à et l&#39;absence de bruit en excès dans le flux de solution non plus. <img alt="Figure 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" /> La figure 3 montre une réponse eugénol induite à partir d&#39;une ORN utilisant la technique pipette d&#39;aspiration. L&#39;ORN a été exposé à 100 pM pour l&#39;eugénol 1 seconde, comme indiqué par la barre au-dessus de l&#39;enregistrement. Dans la Fig. 3A (trace noire) du courant du récepteur a été filtré à une bande passante 0 - 50 Hz pour afficher uniquement le récepteur de courant Fig.. La figure 3B montre le même enregistrement, désormais filtré à la large bande passante de 0 - 5000 Hz (rouge trace) pour afficher également des potentiels d&#39;action (PA, indiqué par des flèches). L&#39;encart montre la même trace dans un délai étendu de visualiser plus clairement les points d&#39;accès à l&#39;apparition de la réponse. <img alt="Figure 4." src = &quot;/ files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg&quot; /&gt; Famille Figure 4. Dose-réponse d&#39;une ORN eugénol sensible (A). L&#39;eugénol est utilisé à des concentrations allant de 0,3 um à 100 um, la durée du stimulus était de 1 s et des traces ont été filtrés à 0 - 50 Hz. Une augmentation progressive de la concentration odorante conduit à une réponse plus large et plus rapide, qui a également mis fin à plus lentement après l&#39;exposition odorant a été résilié. ORNs peut afficher un profil de réponse oscillatoire durant de longues stimulations odorantes à des concentrations intermédiaires (Fig. 4B). Voici un acetephenone (3 uM) ORN réactif a été stimulée pendant 8 secondes. Après une réponse rapide et transitoire de crête au début de la stimulation d&#39;une série de petites réponses récurrents sont observés. La bande passante d&#39;enregistrement était de 0 - 50 Hz.

<ol>
	<li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology:+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding.">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li><li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects:+differences+and+commonalities.">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+retinal+rods+to+single+photons.">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li><li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors.">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).</li><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-dependent+Ca2++extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li><li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells.">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13 (1999).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2++concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

<p class="jove_content"&gt; La technique pipette d&#39;aspiration est une méthode électrophysiologique qui est utilisé pour enregistrer le courant induit par l&#39;odeur récepteur lent et les potentiels d&#39;action rapide biphasiques à partir d&#39;un ORN simultanément. Depuis la membrane plasmique de la cellule ne soit pas dépassé, cette méthode laisse le milieu intracellulaire non perturbé en sorte que les réponses odorantes ne sont pas altérées en raison de changements des concentrations d&#39;ions cytoplasmiques ou de dilution...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de la matière </td><td> Type </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Table pneumatique </td><td> équipement </td><td> Newport </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pompe à air </td><td> équipement </td><td> Newport </td><td> PVVCA </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Puller </td><td> équipement </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> En verre borosilicaté </td><td> équipement </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse Microscope inversé </td><td> équipement </td><td> Nikon </td><td> TE2000U </td><td> Equipé de Hg lampe, filtre GFP et les objectifs 20X et 5X moins </td></tr><tr><td> Amplificateur PC-501A </td><td> équipement </td><td> Warner </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> Couteau de diamant </td><td> Équipement </td><td> Fait sur mesure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digitizer Mikro1401 A / D </td><td> équipement </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Unité de filtre 3382 </td><td> équipement </td><td> Krohn Hite société </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Signal </td><td> logiciel </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moulé Ag / AgCl Pellet </td><td> équipement </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-pipette </td><td> équipement </td><td> Warner </td><td> 64-0997 </td><td> Personnalisée modifiées pour s&#39;adapter à headstage </td></tr><tr><td> Chambre d&#39;enregistrement </td><td> Équipement </td><td> Fait sur mesure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulateur MP85-1028 </td><td> équipement </td><td> Instrument Sutter </td><td> Micromanipulateur MP85-1028 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Huile minérale </td><td> Solution </td><td> Sigma </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> Oscilloscope TDS 1001 </td><td> équipement </td><td> Tektronix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trois-canon tube en verre carré </td><td> Équipement </td><td> Warner </td><td> 64-0119 </td><td> 0,6 mm de diamètre, 5 cm de long </td></tr><tr><td> Vanne </td><td> équipement </td><td> La Société Lee </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ValveLink 8,2 </td><td> équipement </td><td> Automatiser scientifique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Étape perfusion SF-77B rapide </td><td> équipement </td><td> Warner </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique

Animaux échantillonner l&#39;environnement odorant autour d&#39;eux à travers les systèmes chimiorécepteurs situés dans la cavité nasale. Signaux chimiosensoriels affectent les comportements complexes tels que le choix des aliments, prédateur, conspécifiques et la reconnaissance compagnon et d&#39;autres indices socialement pertinents. Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) sont situés dans la partie dorsale de la cavité nasale noyée dans l&#39;épithélium olfactif. Ces neurones bipolaires envoyer un axone vers le bulbe olfactif (voir Fig. 1, Reisert &amp; Zhao 1, initialement publié dans le Journal of General Physiology) et d&#39;étendre une dendrite unique à la frontière épithéliales de rayonner cils où dans le mucus qui recouvre la olfactif épithélium. Les cils contenir le mécanisme de transduction du signal qui mène à excitateurs afflux de courant à travers les canaux de transduction ciliaire, un nucléotide cyclique-dépendant (CNG) et un canal de Ca 2 +-Cl actif - canal (Fig. 1). Le depola qui a suivirisation déclenche la génération du potentiel d&#39;action sur le corps 2-4 Cellules. Dans cette vidéo, nous décrivons l&#39;utilisation de la &quot;technique d&#39;aspiration pipette&quot; pour enregistrer odorant réponses induites à partir ORNs. Cette méthode a été développée à l&#39;origine pour enregistrer à partir photorécepteurs à bâtonnets 5 et une variante de cette méthode peut être trouvé à jove.com modifié pour enregistrer à partir de cônes photorécepteurs de souris 6. La technique pipette d&#39;aspiration a été adapté plus tard pour également enregistrer à partir ORNs 7,8. Brièvement, après dissociation de l&#39;épithélium olfactif et d&#39;isolement des cellules, le corps de la cellule entière d&#39;une ORN est aspiré dans la pointe de la pipette d&#39;enregistrement. La dendrite et les cils restent exposées à la solution de bain et donc accessible à des changements de solution pour permettre par exemple odorant ou une application de blocage pharmacologique. Dans cette configuration, pas d&#39;accès à l&#39;environnement intracellulaire est acquise (pas de blocage de tension de cellule entière) et la tension intracellulaire reste libre de varier. Tout celaux l&#39;enregistrement simultané du courant qui provient du récepteur lent à des cils et des potentiels d&#39;action rapide tiré par le corps 9 cellules. La différence de cinétique entre ces deux signaux permet de les séparer en utilisant différents paramètres de filtre. Cette technique peut être utilisée sur n&#39;importe quel type sauvage ou de la souris knock-out ou d&#39;enregistrer de manière sélective à partir ORNs qui expriment la GFP également d&#39;étiqueter des sous-ensembles spécifiques de ORNs, par exemple, l&#39;expression d&#39;un récepteur olfactif donnée ou canal ionique.

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Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) convertir les signaux d&#39;odeurs dans un premier récepteur de courant qui à son tour déclenche des potentiels d&#39;action qui sont acheminés à des neurones de second ordre dans le bulbe olfactif. Ici, nous décrivons la technique pipette d&#39;aspiration d&#39;enregistrer simultanément le récepteur olfactif courant induit et des potentiels d&#39;action de ORNs souris.

Odorant induites réponses enregistrées à partir de neurones récepteurs olfactifs en utilisant la technique de la pipette d&#39;aspiration

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K vues.  Monell Chemical Senses Center. Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) convertir les signaux d'odeurs dans un premier récepteur de courant qui à son tour déclenche des potentiels d'action qui sont acheminés à des neurones de second ordre dans le bulbe olfactif. Ici, nous décrivons la technique pipette d'aspiration d'enregistrer simultanément le récepteur olfactif courant induit et des potentiels d'action de ORNs souris.

Vidéo: Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l&#39;enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Recherche

Neurosciences

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Application d&#39;une conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isoler les cellules souches nasal olfactif des rongeurs ou des êtres humains

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Cibler les neurones Bulbe olfactif Utiliser combiné In Vivo L&#39;électroporation et de Gal4-Based Enhancer Piège Lignes Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Utilisation Sensillum simple enregistrement pour détecter les réponses olfactive Neuron des punaises de lit à écomones

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...